CN104706682B - 一种中草药萃取物及其用于制备肺癌药物的用途 - Google Patents
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Abstract
一种中草药萃取物，其中，该中草药萃取物的制备方法包含：以重量比例为1：5至5：1的比例混合牛樟芝及北虫草，以获得一个混合物，及将该混合物与一种溶剂混合，其混合比例为重量体积百分比50%，并于40°C～90°C加热进行萃取，以获得一种中草药萃取液，及将该中草药萃取液进行浓缩，以获得该中草药萃取物，该中草药萃取物用于制备肺癌药物。
Description
技术领域
本发明关于一种中草药萃取物，特别是一种抑制肺癌细胞生长的萃取物，本发明更关于该中草药萃取物用于制备肺癌药物的用途。
背景技术
根据卫生署统计资料显示，癌症属十大死因之首，其中肺癌又为位于死亡人数第一名。其现有西医肺癌疗法是以放射线治疗、化学治疗和外科手术切除为主，然而由于外科手术效果不明显，放射线治疗及化学治疗则会过度伤害肿瘤附近的正常细胞，导致副作用的产生且于治疗后仍会有肿瘤转移的可能。
由于现有西医肺癌疗法具有令患者极为不适的副作用，而中医虽不如西医效果强烈，但其对人体伤害较低，因此逐渐受患者所接受。于台湾特有珍贵中药材中，牛樟芝（Antrodia cinnamomea）属于一种真菌，其子实体呈钟型或板型，只生长于高海拔的常绿阔叶的牛樟树（Cinnamomum kanehirae）上。植物化学研究显示，牛樟芝富含具有抑制肿瘤细胞生长的三萜类（Triterpenes）、超氧歧化酶、类固醇及多醣体等。
然而牛樟芝于中医药性分类中，属寒性，具有很强的抗自由基能力，短期服用能帮助有发炎症状的人消除过量的自由基，可解除发炎带来的不适感。然而自由基另一方面与血液循环动力及血管的扩张有关，若是长期服用，体内自由基过度被移除时则会造成血液循环不良，导致末梢微血管血流量不足，即是中医所谓的“体寒气虚”的现象。因此牛樟芝对于刚经历化学治疗或放射线治疗的肿瘤患者，可降低治疗过程对患者的副作用，但此时患者的免疫力已相当弱，若再过度使用牛樟芝，反而会造成更大的伤害。
北冬虫夏草（Cordyceps militaris）又名北虫草，呈金黄、桔黄色，属珍贵药用真菌。北虫草隶属于温性药材，富含虫草素（Cordycepin）、蛋白质、超氧歧化酶及人体所需的氨基酸与微量元素等。北虫草具有有平喘止咳、补肾的功效，与人参、鹿茸并称为中药宝库中的三大补药。虫草素也经证实可以借助活化小鼠黑色素瘤（mouse melanoma）细胞及肺癌细胞上的腺苷受体A3（adenosine receptors A3）达到抑制细胞增生的效果。
有鉴于此，基于现有西医肺癌疗法的副作用及牛樟芝寒性特质的问题，因此极需提供一种改良牛樟芝配方制备为肺癌药物，以解决上述问题。
发明内容
本发明的主要目的主要是提供一种中草药萃取物，可以作为肺癌药物，并辅助现有西医肺癌疗法，以减轻放射线治疗及化学治疗的副作用者。
本发明的次一目的是提供一种中草药萃取物，改良牛樟芝药性，降低长期服用造成身体虚寒的副作用。
发明的再一目的是提供一种中草药萃取物用于制备肺癌药物的用途，以该中草药萃取物作为一种活性成分，抑制肺癌细胞生长。
为达到前述发明目的，本发明所运用的技术手段及借助该技术手段所能达到的功效包含有：
一种中草药萃取物，其中，该中草药萃取物之制备方法包含：以重量比例为1：5至5：1的比例混合牛樟芝及北虫草，以获得一个混合物；将该混合物与一种溶剂混合，其混合比例为重量体积百分比50%，并于40℃～90℃加热进行萃取，以获得一种中草药萃取液；及将该中草药萃取液进行浓缩，以获得该中草药萃取物。
本发明的一种中草药萃取物，其中该混合物中包含重量比例较佳为5：1的牛樟芝及北虫草。
本发明的一种中草药萃取物，其中该溶剂较佳为95%乙醇。
本发明的一种中草药萃取物，其中加热较佳以50℃隔水加热方式。
本发明的一种中草药萃取物，其中该中草药萃取物的萃取时间较佳为8小时。
本发明的一种中草药萃取物用于制备肺癌药物的用途，是将该中草药萃取物投予一个所需个体，以抑制肺癌细胞生长。
本发明的一种中草药萃取物用于制备肺癌药物的用途，其中该中草药萃取物较佳是以口服方式投予所需个体。
本发明的一种中草药萃取物用于制备肺癌药物的用途，其中，较佳是以每公斤的所需个体体重投予0.1至0.6克的该中草药萃取物。
本发明的中草药萃取物富含三萜类、多醣体及虫草素等活性成分，可以有效降低肺癌细胞的存活率，且可以有效抑制活体的肺肿瘤的生长，是以达到毒杀肺癌细胞的功效。
本发明的中草药萃取物可以有效抑制肺癌细胞的生长，可以结合现有西医肺癌疗法，降低放射线治疗或化学治疗的剂量，达到减少现有西医肺癌疗法造成副作用的功效。
本发明的中草药萃取物，相较于牛樟芝或北虫草单方，具有较佳肺癌细胞抑制效果，更通过与北虫草的组合，改良牛樟芝寒性特质，达到减轻长期单独服用牛樟芝而引起的副作用的功效。
本发明的一种中草药萃取物用于制备肺癌药物的用途，借助其富含的三萜类、多醣体及虫草素等活性成分，有效抑制肺癌细胞增生，具有使肿瘤无法增生或扩散的功效。
注：在本申请文件包括权利要求书中所记载的“重量体积百分比”的定义为重量百分比=（溶质的重量(g)/溶剂的体积(ml)）X100%。
附图说明
图1A为本试验第A1组的牛樟芝萃取物的三萜类六大指标分析图谱。
图1B为本试验第A2组的牛樟芝与北虫草萃取物的三萜类六大指标分析图谱。
图1C为本试验第A3组的牛樟芝与北虫草萃取物的三萜类六大指标分析图谱。
图1D为本试验第A4组的牛樟芝与北虫草萃取物的三萜类六大指标分析图谱。
图1E为本试验第A5组的牛樟芝与北虫草萃取物的三萜类六大指标分析图谱。
图1F为本试验第A6组的牛樟芝与北虫草萃取物的三萜类六大指标分析图谱。
图1G为本试验第A7组的北虫草萃取物的三萜类六大指标分析图谱。
图2为以本试验各组的中草药萃取物处理人类肺癌细胞的细胞存活率曲线图。
图3A为小鼠植入人类肺癌细胞后，续连续投予RO水30天的肿瘤外观图（虚线圆圈处）。
图3B为小鼠植入人类肺癌细胞后，续以0.1g/kg/day的剂量，连续投予本较佳实施例的中草药萃取物30天，人类肺癌细胞植入小鼠的肿瘤外观图（虚线圆圈处）。
图3C为小鼠植入人类肺癌细胞后，续以0.3g/kg/day的剂量，连续投予本较佳实施例的中草药萃取物30天，人类肺癌细胞植入小鼠的肿瘤外观图（虚线圆圈处）。
图3D为小鼠植入人类肺癌细胞后，续以0.6g/kg/day的剂量，连续投予本较佳实施例的中草药萃取物30天，人类肺癌细胞植入小鼠的肿瘤外观图（虚线圆圈处）。
具体实施方式
为让本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本发明的较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下：
牛樟芝又可分为子实体及菌丝体，其中，较佳是可以选用摘取自牛樟树椴木上的天然牛樟芝子实体，因牛樟芝子实体所含三萜类的量较菌丝体高；而北虫草则选用子实体，因北虫草子实体中，活性成分如腺苷与虫草素的含量均较菌丝体高。
较佳地，本较佳实施例中草药萃取物可以经通过以下方式制备获得，但不以此为限。本较佳实施例中草药萃取物的制备方法包含：混合适量的牛樟芝及北虫草，以获得一个混合物；以一种溶剂萃取该混合物，以获得一种中草药萃取液；并使该中草药萃取液进行浓缩，即可以获得本较佳实施例的中草药萃取物。
详而言之，是取重量比例为1：5至5：1的比例混合牛樟芝及北虫草，以获得该混合物，较佳是以重量比例为5：1的牛樟芝及北虫草。较佳可以将该牛樟芝及北虫草分别碎成粉粒，并以筛网（筛号为30）进行颗粒筛选，以增加其混合效率及后续萃取效率。
续将上述混合物以重量体积百分比50%的比例与该溶剂混合，其中该溶剂较佳为95%乙醇，并于40℃～90℃加热进行萃取，萃取时间为8小时，以获得该中草药萃取液，其中加热方式较佳是以50℃隔水加热。此外，上述萃取也可以重复数次，使牛樟芝及北虫草所富含的活性成分可以完整溶出于该溶剂，此为本领域所属具有通常知识者所广泛应用，在此不加以赘述。
该中草药萃取液的浓缩较佳是使用3号滤纸进行真空过滤、并通过减压浓缩去除至少一半的溶剂，续于-60℃下冷冻干燥，以获得含水量小于2%的该中草药萃取物，使该中草药萃取物的活性成分更佳浓缩，是以仅需使用少量的该中草药萃取物即可以发挥最佳疗效。
本较佳实施例的中草药萃取物含有三萜类、虫草素及多醣体等多种活性成分，使该中草药萃取物针对肺癌细胞具有毒杀作用，可以抑制肺癌细胞增生，防止肿瘤扩增。
为证实本较佳实施例中草药萃取物具有三萜类、虫草素及多醣体，并可以使该中草药萃取物对于肺癌细胞有抑制效果，遂进行以下测试：
本试验中，取如第1表所示的中草药重量比例混合至总量500克，以获得各组混合物；续将该混合物以重量体积百分比50%的比例与95%乙醇混合，并通过50℃隔水加热方式进行萃取8小时，再通过3号滤纸真空过滤、减压浓缩去除至少一半的溶剂及-60℃的冷冻干燥处理，以获得各组的中草药萃取物。
第1表、本试验各组中草药的重量比例
| 组别 | 牛樟芝与北虫草重量比 |
| A1 | 1：0 |
| A2 | 5：1 |
| A3 | 3：1 |
| A4 | 1：1 |
| A5 | 1：3 |
| A6 | 1：5 |
| A7 | 0：1 |
（A）产率
本试验是以如第1表所示的各组中草药萃取物进行测试，产率计算式为（中草药萃取物重量/原始总重500克）×100%；其结果如第2表所示，以第A2组为最高（9.12±0.3%）。
第2表、中草药萃取物以95%乙醇萃取所得的产率
（B）三萜类含量检测
续秤取0.2克的各组中草药萃取物至一个螺旋试管中，加入5毫升甲醇，以超音波震荡15分钟，3000转离心10分钟，取5毫升上清液置入一个干净试管中，再以100℃水浴加热至干燥。
接着选用Purospher STAR（Merk）RP-18e（5μm）250mm×4mm管柱进行分析，以47：53的体积混合乙腈（Acetonitrile，简称ACN）及0.085%的磷酸溶液作为流动相，流速为1ml/min，检测波长为254nm的吸光值以进行分析，其结果分别如图1A至图1G所示。
总三萜含量分析结果如第3表所示，其中第A1组总三萜含量最高（32.45±1.12%）；第A2组总三萜含量居次（28.77±1.08%）；第A6组总三萜量为最低（18.26±1.23%）。
第3表、中草药萃取物总三萜含量表
| 组别 | 牛樟芝与北虫草重量比 | 总三萜含量（%） |
| A1 | 1：0 | 32.45±1.12 |
| A2 | 5：1 | 28.77±1.08 |
| A3 | 3：1 | 26.15±1.13 |
| A4 | 1：1 | 21.56±1.19 |
| A5 | 1：3 | 24.67±1.29 |
| A6 | 1：5 | 18.26±1.23 |
| A7 | 0：1 | 19.16±1.42 |
牛樟芝三萜类特别具有六大指标成分，分别为樟芝酸K（antcin K）、樟芝酸C（antcin C）、樟菇酸C（zhankuic acid C）、马偕1号（dehydrosulphurenic acid）、樟菇酸A（zhankuic acid A）与云鹏1号（dehydroeburicoic acid），各组的分析结果如第4表所示。也请分别参照图1A、图1B、图1C及图1E所示，分别为第A1、A2、A3及A5组，其均可检测出六大三萜类指标成分，其中第A1组六大三萜类面积百分比为最高（68.78%），其次则为第A2组（37.61%）（请参照第4表所示）。第A4、A6及A7组则无法通过仪器得到六大三萜类指标含量（请分别参照图1D、图1F及图1G所示）。
第4表、中草药萃取物六大指标三萜类分析结果
（C）虫草素含量检测
本试验使用第A1～A7组的样品，接着选用C18（5μm）150mm×4.6m管柱进行分析，以体积比40：60的甲醇水溶液作为流动相，流速为1ml/min，检测波长为260nm的吸光值以进行后续分析。
虫草素含量分析如第5表所示，其中，第A7组虫草素含量最高（8.25±0.29%）；第A6组虫草素的含量居次（6.57±0.24%）；第A1组则无法检测出虫草素的表现量。
第5表、中草药萃取物虫草素含量表
| 组别 | 牛樟芝与北虫草重量比 | 虫草素含量（%） |
| A1 | 1：0 | 无（N.D.） |
| A2 | 5：1 | 1.37±0.15 |
| A3 | 3：1 | 2.06±0.16 |
| A4 | 1：1 | 4.70±0.19 |
| A5 | 1：3 | 5.52±0.35 |
| A6 | 1：5 | 6.57±0.24 |
| A7 | 0：1 | 8.25±0.29 |
（D）多醣体含量检测
本试验是以半乳糖作为标准品，利用其浓度及吸光值制成标准曲线。续配置中草药萃取溶液，取1毫升各组的中草药萃取溶液加入5%酚类溶液1毫升，再加入5毫升浓硫酸，以获得各组混合溶液，使该各组混合溶液冷却30分钟后，震荡使其均匀混合，并利用分光光度计（Hitachi U1800Spectrometer），于490nm测其吸光值，借助标准曲线计算其浓度。
多醣体含量分析如第6表所示，其中，以第A2组含有最高量的多醣体（61.33±2.09%），高于第A1组（60.09±1.56%）；而第A7组所含多醣体的量最低，为13.09±1.37%。
第6表、中草药萃取物多醣体含量表
| 组别 | 牛樟芝与北虫草重量比 | 多醣体含量（%） |
| A1 | 1：0 | 60.09±1.56 |
| A2 | 5：1 | 61.33±2.09 |
| A3 | 3：1 | 51.16±1.24 |
| A4 | 1：1 | 15.92±1.31 |
| A5 | 1：3 | 14.37±1.36 |
| A6 | 1：5 | 14.38±1.02 |
| A7 | 0：1 | 13.09±1.37 |
综合上述试验结果，本较佳实施例的中草药萃取物含有丰富三萜类、虫草素及多醣体，是以对于肺癌细胞具有毒杀效果。
为证明本较佳实施例的中草药萃取物较单方具有较佳肺癌细胞抑制效果，续进行以下试验：
（E）中草药萃取物对人类肺癌细胞株存活率的影响
本试验选用购自食品工业发展研究所的人类肺癌细胞（A549细胞），该肺癌细胞株培养于含有10%胎牛血清（FBS，购自Biological Industries，Kibbutz beit haemek）、2mmol/L L-麸氨酸（L-glutamine，购自HyClone，USA）、1×非必需氨基酸（购自HyClone，USA）、100μg/ml链霉素（streptomycin）及100U/ml青霉素（penicillin，购自HyClone，USA）的培养液（F-12K），将该肺癌细胞株置于37℃、5％二氧化碳及95％湿度的培养箱，每隔两天更换一次新鲜培养液。
该肺癌细胞株于继代培养时，可以先将培养液与细胞以1000转进行离心5分钟，去除上清液后，再加入新的培养液，并且使10厘米培养皿内维持细胞数约1×105至1×106cells/ml。
试验进行时，可以取出已经长8至9分满的该肺癌细胞株的10厘米培养皿，去除已变色的培养液，加入8毫升PBS缓冲溶液冲洗细胞，加入胰蛋白酶/乙二胺乙酸（Trypsin/EDTA），反应1至3分钟后，轻摇培养皿使细胞自壁上脱落，加入已回温的培养液，轻轻将细胞冲散，再将含细胞的培养液分别置入离心管内，使细胞分散均匀，并取出20μl该肺癌细胞，再加入20μl0.04%的锥虫蓝（Trypan Blue）进行染色，放入细胞计数器，并于显微镜下计数活细胞数，细胞存活率必须不小于85%才可以进行后续试验。
以含血清的培养液将该肺癌细胞的浓度调整为1×105cells/ml，并取100μl的该肺癌细胞接种于96孔盘，使每个孔槽含有1×104细胞，并于37℃、含5％二氧化碳的培养箱进行隔夜培养。
经过24小时培养后，分别加入如第7表所示的样品（4个浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml及0.125mg/ml），混合均匀后，于37℃，含5%的二氧化碳培养箱隔夜培养24小时。
第7表、本试验以该中草药萃取物处理及控制组组别
| 组别 | 样品 |
| E1 | Dulbecco’s改良培养基（DMEM） |
| E2 | 二甲基亚砜（DMSO） |
| E3 | 牛樟芝与北虫草1：0 |
| E4 | 牛樟芝与北虫草5：1 |
| E5 | 牛樟芝与北虫草3：1 |
| E6 | 牛樟芝与北虫草1：1 |
| E7 | 牛樟芝与北虫草1：3 |
| E8 | 牛樟芝与北虫草1：5 |
| E9 | 牛樟芝与北虫草0：1 |
24小时后，移除培养液，以PBS缓冲溶液冲洗后，再加入100μl含有CCK-8的新鲜培养液，置于37℃，含5%的二氧化碳培养箱反应2小时后，震摇5分钟后，检测每个槽孔于450nm波长下的吸光值。试验结果的细胞存活率换算公式为[各实验组吸光值]/[未经任何药物处理的控制组吸光值]×100%。
请参照图2所示，第E4组于1mg/ml的作用浓度下，该肺癌细胞存活率仅为11.56±1.18%，其抑制效果明显高于第E3组（18.24±2.16％）；而第E9组于1mg/ml的作用浓度下，抑制效果最差，细胞存活率高达95.26±3.14%。由此可得知本较佳实施例第E4组具有较佳抑制肿瘤生长的效果。
本较佳实施例的中草药萃取物确实对于肺癌细胞具有毒杀功能，其中特以牛樟芝与北虫草重量比5：1的中药萃取物的效果最佳。
（F）中草药萃取物对肿瘤小鼠的肿瘤抑制效力评估
本试验是选用购自中国台湾成功大学医学院动物中心的Balb/C雄性小鼠，该小鼠皆在8周周龄以上，体重20～25克之间。该小鼠饲养于中国台湾成功大学医学院的SPF动物中心，维持室温在25±1℃的动物室，光照时间与黑暗时间各为12小时。而且，小鼠可自由的进食与饮水；饲料（购自美国LabDiet,Inc.）及饮水皆由中国台湾成功大学医学院动物中心供应。
将人类肺癌细胞株（如前述的A549细胞株，购自中国台湾食品工业发展研究所）以生理食盐水稀释至浓度为5×106cell/ml后，将该肺癌细胞株于小鼠腋下部位进行皮下注射。
接着，将本较佳实施例的中草药萃取物（其牛樟芝与北虫草的重量比5：1，即为前述第A2组）经口喂食至该小鼠，以RO水作为控制组，每天喂食两次（3种剂量分别为0.1、0.3及0.6g/kg/day），连续投予30天，且每周以x光照射记录肿瘤面积。肿瘤小鼠牺牲后，秤取小鼠体重，并秤重切除的瘤块、脾脏及胸腺，计算抑瘤率、脾系数和胸腺系数，也抽取该小鼠的血液通过全自动血液分析仪（sysmex F-800，Japan）进行肝肾功能的评估：血液中麸草酸转氨基酶（GOT）、血清丙酮转氨基酶（GPT）、血尿素氮（blood urea nitrogen，简称BUN）及肌酸酐（creatinine）的变化。
请参照图3A、3B、3C及3D所示，本较佳实施例的中草药萃取物相较于RO水组别可以有效减小肿瘤体积及其生长速度，且随着投予中草药萃取物的剂量增加，肿瘤生长的抑制效果也相对提升。
续参照第8表所示，不同剂量的中草药萃取物对于肺癌小鼠的体重、胸腺和脾脏重量变化无显著差异，显示该中草药萃取物不会损害其他非肿瘤区域。
第8表、中草药萃取物连续投予30天至肿瘤小鼠后，该肿瘤小鼠的体重、胸腺和脾脏重量与肿瘤体积变化
*P＜0.05各组动物所得数据相较于RO水组别数据的比较
请参照第9表所示，肿瘤小鼠体内该肝功能指数GOT与GPT数值，会随着本较佳实施例的中草药萃取物的投予剂量增加而减少，而肾功能指数BUN及肌酸酐则无明显差异，显示该中草药萃取物于实验剂量范围内具有体内保护肝脏的能力，但不会造成肾脏的损伤。
第9表、中草药萃取物连续投予30天至肿瘤小鼠后，该肿瘤小鼠肝肾功能相关生化指数的影响
*P＜0.05各组动物所得数据相较于RO水组别数据的比较
综合上述，本发明的中草药萃取物富含三萜类、多醣体及虫草素等活性成分，可以有效降低肺癌细胞的存活率，且可以有效抑制活体的肺肿瘤的生长，是以达到毒杀肺癌细胞的功效。
再者，本发明的中草药萃取物可以有效抑制肺癌细胞的生长，可以结合现有西医肺癌疗法，降低放射线治疗或化学治疗的剂量，达到减少现有西医肺癌疗法造成副作用的功效。
以及，本发明的中草药萃取物，相较于牛樟芝或北虫草单方，具有较佳肺癌细胞抑制效果，更通过与北虫草的组合，改良牛樟芝寒性特质，达到减轻长期单独服用牛樟芝而引起的副作用的功效。
此外，本发明的一种中草药萃取物用于制备肺癌药物的用途，是借助其富含的三萜类、多醣体及虫草素等活性成分，有效抑制肺癌细胞增生，具有使肿瘤无法增生或扩散的功效。
Claims (6)
1.一种用于制备肺癌药物的中草药萃取物，其特征在于：该中草药萃取物的制备方法包括：
以重量比例为5：1的比例混合牛樟芝及北虫草，以获得一个混合物；
将该混合物与一种溶剂混合，其混合比例为重量体积百分比50%，并于40°C～90°C加热进行萃取，以获得一种中草药萃取液；及将该中草药萃取液进行浓缩，以获得该中草药萃取物；该溶剂为95%乙醇。
2.根据权利要求1所述的中草药萃取物，其特征在于：加热是以50°C隔水加热方式。
3.根据权利要求1所述的中草药萃取物，其特征在于：该中草药萃取物的萃取时间为8小时。
4.一种中草药萃取物用于制备肺癌药物的用途，是将该中草药萃取物投予一个所需个体，以抑制肺癌细胞生长，其特征在于：其中，该中草药萃取物是由以下方法制备获得：
以重量比例为5：1的比例混合牛樟芝及北虫草，以获得一个混合物；及
将该混合物与一种溶剂混合，其混合比例为重量体积百分比50%，并于40°C～90°C加热进行萃取，以获得一种中草药萃取液；及将该中草药萃取液进行浓缩，以获得该中草药萃取物；该溶剂为95%乙醇。
5.根据权利要求4所述的中草药萃取物用于制备肺癌药物的用途，其特征在于：该中草药萃取物是以口服方式投予所需个体。
6.根据权利要求4所述的中草药萃取物用于制备肺癌药物的用途，其特征在于：是以每公斤的所需个体体重投予0.1至0.6克的该中草药萃取物。
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