TWI555529B - 中草藥萃取物用於製備肝癌藥物之用途 - Google Patents

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Description

中草藥萃取物用於製備肝癌藥物之用途
本發明係關於一種中草藥萃取物，特別係一種包含牛樟芝、桑黃菇及白鶴靈芝之中草藥萃取物，本發明更關於該中草藥萃取物用於製備肝癌藥物之用途。
根據國民健康局之統計分析顯示，肝癌是台灣癌症死亡的第二大原因，每年約有7000名患者死於肝癌，主要是由於B型肝炎與C型肝炎盛行，使得慢性肝炎得以進一步發展成肝硬化或肝癌。肝癌的習知治療方法以手術切除或原位肝臟移植為首選，然而若患者無法接受手術切除或者不具移植之資格時，則需選擇替代的療法，最常見的有射頻灼燒術(Radiofrequency ablation)，但成本較高、易有併發症的產生且僅適用於肝腫瘤小於2公分之患者。
由於習知肝癌療法所受限制較多、成本較高，又易引起併發症，因此除了習知肝癌療法，選擇中醫療法來輔助之患者亦逐漸增多，雖中醫療法的效果較為緩慢，但其對患者所產生之副作用亦隨之降低。台灣特有珍貴中藥材中，牛樟芝(Antrodia cinnamomea)係屬於一種寄生於牛樟樹中空樹幹內的真菌，富含有三萜類(Triterpenes)及超氧歧化酶等，具有保肝之效果。
然而根據中醫理論，牛樟芝隸屬於寒性藥材，具有很強的抗 自由基能力，可以有效消除自由基，減輕發炎症狀，因此當長期服用牛樟芝單方可能會造成體內自由基濃度過低，而導致中醫所謂的「體寒氣虛」現象產生，使得人體免疫力下降。
白鶴靈芝(Rhinacanthus nasutus)又名仙鶴草，形狀如展翅飛翔之白鶴，具有降肝火與消腫解毒等功效。而桑黃菇又簡稱桑黃，學名為鮑氏層孔菌(Phellinus lintenus)，主要的活性成分為多醣體，可以活化免疫系統，增強免疫力。
有鑑於此，基於「習知肝癌療法使用上的限制」及「牛樟芝造成免疫力下降」的問題，因此極須提供一種改良牛樟芝配方製備為肝癌藥物，以解決上述問題。
本發明之主要目的係提供一種中草藥萃取物用於製備肝癌藥物之用途，係透過該中草藥萃取物所富含之活性成分，防止肝腫瘤增大，以治療肝癌者。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：一種中草藥萃取物用於製備肝癌藥物之用途，係以每天每公斤所需個體體重投予10~30毫克之劑量，將該中草藥萃取物投予一所需個體，以抑制肝癌細胞生長，其中，該中草藥萃取物係由以下方法製備獲得：提供一混合物，該混合物係由以重量百分比計為60%之牛樟芝、20%之桑黃菇及20%之白鶴靈芝所組成；以95%乙醇於50~80℃加熱萃取該混合物，該混合物與95%乙醇之重量體積比為1：2，獲得一中草藥萃取液；及將該中草藥萃取液進行濃縮，以獲得該中草藥萃取物。
本發明之中草藥萃取物用於製備肝癌藥物之用途，其中該中草藥萃取物較佳係以口服方式投予該所需個體。
本發明之一種中草藥萃取物用於製備肝癌藥物的用途，係藉由萃取自牛樟芝、桑黃菇及白鶴靈芝所獲得的活性成分毒殺肝癌細胞，促使肝腫瘤內部組織壞死，達到使肝腫瘤無法增生之功效。
第1A圖：係本試驗第A1組中草藥萃取物之三萜類六大指標分析圖譜。
第1B圖：係本試驗第A2組中草藥萃取物之三萜類六大指標分析圖譜。
第1C圖：係本試驗第A3組中草藥萃取物之三萜類六大指標分析圖譜。
第2圖：係本試驗第E0~E3組腫瘤小鼠於30天後之腫瘤外觀圖(虛線圓圈處)。
第3A圖：係本試驗第E0組腫瘤小鼠於30天後之H&E染色結果圖。
第3B圖：係本試驗第E1組腫瘤小鼠於30天後之H&E染色結果圖。
第3C圖：係本試驗第E2組腫瘤小鼠於30天後之H&E染色結果圖。
第3D圖：係本試驗第E3組腫瘤小鼠於30天後之H&E染色結果圖。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之中草藥萃取物，係包含由以下方法製備獲得：混合適量之牛樟芝、桑黃菇及白鶴靈芝，以獲得一混合物，續以95%乙醇萃取該混合物，獲得一中草藥萃取液並濃縮該中草藥萃取液，即可獲得本發明之中草藥萃取物。
詳而言之，係取以重量百分比計為33.4~60%之牛樟芝、20 ~33.4%之桑黃菇及20~33.4%之白鶴靈芝，獲得該混合物，以60%之牛樟芝、20%之桑黃菇及20%之白鶴靈芝的混合比例為佳；且混合牛樟芝、桑黃菇與白鶴靈芝前，較佳係可以先分別碎成粉粒，並以篩網(篩號為30mesh)進行顆粒篩選，以增加其混合效率及後續萃取效率。
其中，牛樟芝又可以分為子實體及菌絲體，較佳係選用摘取自牛樟樹椴木上的牛樟芝子實體，因牛樟芝子實體所含三萜類的量較菌絲體高；桑黃菇較佳則選為取自子實體，其係含有豐富的天然氨基酸、微量元素等，能促進肝臟新陳代謝和肝細胞再生、降低血液中麩草酸轉氨基酶(GOT)、血清丙酮轉氨基酶(GPT)值以及減弱肝炎病毒的複製作用；而白鶴靈芝較佳係可以選擇其全草，係含白鶴靈芝類(rhinacanthin)的化合物，具抑制癌細胞的作用。
續使上述之混合物以重量體積比為1：2的比例與95%乙醇混合(即，每500克之該混合物與1公升之95%乙醇混合)，並於50~80℃進行萃取8~12小時，以獲得該中草藥萃取液，其中較佳係以50℃隔水加熱之方式進行萃取且萃取時間較佳係為10小時。此外，上述萃取亦可以重複數次，使牛樟芝、桑黃菇及白鶴靈芝所富含之活性成分可以完整溶出於95%乙醇，此為本領域所屬具有通常知識者所廣泛應用，在此不加以贅述。
前述之中草藥萃取液較佳係使用3號濾紙進行真空過濾、並藉由減壓濃縮去除至少一半95%乙醇，續於-60℃下冷凍乾燥，以獲得含水量小於10%之該中草藥萃取物，藉由此一程序，係可以使該中草藥萃取物之活性成分更加濃縮，是以僅需使用少量之該中草藥萃取物即可以發揮最佳療效。
本發明之中草藥萃取物係藉由所富含之三萜類及多醣體等活性成分，使該中草藥萃取物可以發揮毒殺肝癌細胞之作用，是以將該中 草藥萃取物以口服方式投予一所需個體，用以抑制肝癌細胞增生，防止肝腫瘤增大；其中該中草藥萃取物係以每天每公斤之該所需個體體重10~30毫克的劑量持續施予該所需個體30天，以縮小肝腫瘤之體積。
為證實本發明之中草藥萃取物係具有三萜類及多醣體，並可以使該中草藥萃取物對於肝癌細胞有抑制效果，遂進行以下測試：本試驗中，係取如第1表所示之中草藥重量百分比混和至總量500克，以獲得各組混合物，續將各該組混合物與1公升的95%乙醇混合，並透過50℃隔水加熱方式進行萃取8小時，再經由3號濾紙真空過濾、減壓濃縮去除至少一半的溶劑及-60℃的冷凍乾燥處理，以獲得各組之中草藥萃取物。
(A)產率
本試驗係取各該組中草藥萃取物進行測試，產率之計算係為(中草藥萃取物重量/原始總重500克)×100%；其結果如第2表所示，以第A3組之產率為最高(12.3±1.5%)。
(B)三萜類含量檢測
續秤取0.2克之各該組中草藥萃取物至一螺旋試管中，加入5毫升甲醇，以超音波震盪15分鐘，3000轉離心10分鐘，取5毫升上清液置入一乾淨試管中，再以100℃水浴加熱至乾燥。
接著選用Purospher STAR(Merk)RP-18e(5μm)250mm×4mm管柱進行分析，以47：53之體積混合乙腈(Acetonitrile，簡稱ACN)及0.085%之磷酸溶液作為流動相，流速為1mL/min，偵測波長為254nm之吸光值以進行分析，並分析各組總三萜占總面積之百分比，其結果如第3表所示，其中第A3組總三萜含量最高(22.47±1.31%)，第A1組總三萜量為最低(20.12±1.25%)。
牛樟芝三萜類係具有六大指標成分，分別為樟芝酸K(antcin K)、樟芝酸C(antcin C)、樟菇酸C(zhankuic acid C)、馬偕1號(dehydrosulphurenic acid)、樟菇酸A(zhankuic acid A)與雲鵬1號(dehydroeburicoic acid)，各組之分析結果如第4表所示，亦請分別參照第1A、1B及1C圖所示，係分別為第A1、A2及A3組之六大三萜類指標分析圖譜，其中，第A3組表現較高比例的樟芝酸K、樟芝酸C、樟菇酸C與樟菇酸A。
(C)多醣體含量檢測
本試驗係以半乳糖作為標準品，利用其濃度及吸光值製成標準曲線。續配置各組中草藥萃取溶液，取1毫升各該組之中草藥萃取溶液 加入5%酚類溶液1毫升，再加入5毫升濃硫酸，以獲得各組混合溶液，使該各組混合溶液靜置10分鐘後，震盪使其均勻混合，並利用分光光度計(Hitachi U1800 Spectrometer)，於490nm測其吸光值，藉由標準曲線計算其濃度，其結果如第5表所示。
多醣體含量分析如第5表所示，其中，以第A3組含有最高量的多醣體，係為34.92±1.18ppm，而第A1组所含多醣體的量最低，為32.15±1.28ppm。
綜合上述試驗結果，本發明之中草藥萃取物係富含三萜類及多醣體，可以抑制肝癌細胞增生。
為證明本發明之中草藥萃取物可以有效控制肝癌細胞的增生，續進行以下試驗：
(D)中草藥萃取物對人類肝癌細胞株存活率之影響
本試驗係選用購自食品工業發展研究所之人類肝癌細胞株(Hep G2細胞株，BCRC60025)，該肝癌細胞株培養於含有10%胎牛血清(FBS，購自Biological Industries，Kibbutz beit haemek)、2mmol/L L-麩氨酸(L-glutamine，購自HyClone，USA)、1×非必需氨基酸(購自HyClone，USA)、100μg/mL鏈黴素(streptomycin)及100U/mL青黴素(penicillin，購自HyClone，USA)的培養液(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，簡稱DMEM)，將該肝癌細胞株置於37℃、5%二氧化碳及95%溼度之培養箱， 每隔兩天更換一次新鮮培養液。
該肝癌細胞株於繼代培養時，係可以先將培養液與細胞以1000rpm進行離心5分鐘，去除上清液後，再加入新的培養液，並且使10公分培養皿內維持細胞數約1×105~1×106cells/mL。
試驗進行時，係可以取出已經長8至9分滿之該肝癌細胞株的10公分培養皿，去除已變色之培養液，加入8mL之PBS緩衝溶液沖洗細胞，加入胰蛋白酶/乙二胺乙酸(Trypsin/EDTA)，反應1~3分鐘後，輕搖培養皿使細胞自壁上脫落，加入已回溫的培養液，輕輕將細胞沖散，再將含細胞之培養液分別置入離心管內，使細胞分散均勻，並取出20μL該肝癌細胞株，再加入20μL、0.04%之錐蟲藍(Trypan Blue)進行染色，放入細胞計數器，並於顯微鏡下計數活細胞數，細胞存活率必須不小於85%才可以進行後續試驗。
以含血清之培養液將該肝癌細胞之濃度調整為1×105cells/mL，並取100μL之該肝癌細胞株接種於96孔盤，使每個孔槽含有1×104細胞，並於37℃、含5%二氧化碳之培養箱進行隔夜培養。
經過24小時培養後，分別加入100μL如第6表所示之4個濃度的中草藥萃取物(4個濃度分別為1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL及0.125mg/mL)，並以DMEM作為控制組，混合均勻後，於37℃，含5%的二氧化碳培養箱隔夜培養24小時。
24小時後，移除培養液，以PBS緩衝溶液沖洗後，再加入100μL含有CCK-8之新鮮培養液，置於37℃，含5%的二氧化碳培養箱反應2小時後，震搖5分鐘後，偵測每個槽孔於450nm波長下之吸光值。試驗結果之細胞存活率換算公式為「各組吸光值」/「未經任何藥物處理的控制組吸光值」×100%，細胞存活率結果如第7表所示。
請參照第7表所示，第D3組於1mg/mL的作用濃度下，該肝癌細胞存活率僅為58.13±1.16%，明顯低於第D0~D2組於1mg/mL之濃度的細胞存活率；是以，本發明之中草藥萃取物第D3組具有較佳毒殺肝癌細胞之效果。
本發明之中草藥萃取物可以有效控制肝癌細胞的增殖，其中特別係萃取以重量百分比計為60%之牛樟芝、20%之桑黃菇及20%之白鶴靈芝所獲得的中草藥萃取物效果最佳(即，上述第A3組之中草藥萃取物)，以下試驗遂僅以第A3組之中草藥萃取物進行。
(E)中草藥萃取物對腫瘤小鼠之腫瘤抑制效力評估
本試驗係選用購自國家動物實驗中心之C57BL/6雄性小 鼠，該小鼠皆在8週週齡以上，體重20~25克之間。該小鼠係飼養於大仁科技大學的SPF動物中心，維持室溫在25±1℃的動物室，光照時間與黑暗時間各為12小時。而且，小鼠可自由的進食與飲水；飼料(購自美國LabDiet,Inc.)及飲水皆由大仁科技大學動物中心供應。
本試驗係選用購自食品工業發展研究所之小鼠肝癌細胞(HEPA 1-6細胞株，BCRC60051)，該肝癌細胞株培養於含有10%胎牛血清、2mmol/L L-麩氨酸、1×非必需氨基酸、100μg/mL鏈黴素及100U/mL青黴素的培養液(DMEM)，將該肝癌細胞株置於37℃、5%二氧化碳及95%溼度之培養箱，每隔兩天更換一次新鮮培養液。
將小鼠肝癌細胞以生理食鹽水稀釋至濃度為5×106cell/mL後，將該肝癌細胞株於小鼠腋下部位進行皮下注射，以獲得腫瘤小鼠。
接著，以10、20、30mg/kg/day之劑量分別將本發明之中草藥萃取物(其牛樟芝、桑黃菇與白鶴靈芝之重量百分比分別為60%、20%及20%，即為前述第A3組)經口餵食至各組腫瘤小鼠(分別為第E1、E2及E3組)，以RO水作為控制組(第E0組)，每天餵食兩次，連續投予30天，且每週記錄腫瘤體積。各組腫瘤小鼠犧牲後，秤取腫瘤小鼠體重，並秤重切除瘤塊、脾臟及肝臟，計算抑瘤率、脾係數和肝臟係數，結果如第8表所示；續將各組腫瘤小鼠之瘤塊浸泡於10%之甲醛進行固定，切除各組瘤塊之同一位置放入包埋盒並進行脫水，以利後續石蠟包埋之進行，形成各組石蠟塊；將各該組石蠟塊於-20℃下切割成厚度約為5μm之薄片，並放入烘箱內乾燥，續進行H&E(hematoxyin-eosin)染色。
本試驗亦抽取各組腫瘤小鼠之血液透過全自動血液分析儀(sysmex F-800，Japan)進行肝腎功能之評估：血液中GOT、GPT、血尿素氮(blood urea nitrogen，簡稱BUN)及肌酸酐(creatinine)的變化，結果如第9表所示。
請參照第2圖所示，本發明之中草藥萃取物相較於控制組別係可以有效縮小腫瘤體積及其擴增速度；續參照第8表所示，隨著投予中草藥萃取物之劑量增加，腫瘤生長之抑制效果亦相對提升，於30mg/kg/day之投予劑量下，腫瘤生長抑制率高達71.40±3.27%(第E3組)，顯著高於劑量為10及20mg/kg/day之腫瘤生長抑制率(第E1及E2組)，且不同劑 量之中草藥萃取物對於體重、肝臟和脾臟重量變化與控制組間均無顯著差異，顯示本發明之中草藥萃取物不會損害其他非腫瘤區域。
請參照第9表所示，各組腫瘤小鼠體內肝功能指數GOT與GPT數值，會隨著本發明之中草藥萃取物的投予劑量增加而減少，而腎功能指數BUN及肌酸酐則無明顯差異，顯示該中草藥萃取物於投予劑量範圍內具有保護肝臟之能力，減緩肝臟受損之程度，但不會對腎臟產生任何影響。
請參照第3A圖所示，係為第E0組之H&E染色切片圖，可以明顯看出由於腫瘤體積過大因而壓迫下方的肌肉群，使得腫瘤周邊區域有脂肪細胞浸潤之現象發生，而內部腫瘤細胞則仍然呈緻密且片狀排列；請參照第3B~3D圖所示，係分別為第E1~E3組之H&E染色切片圖，與第E0組結果相比，發現腫瘤周邊至中央處均有局部至廣泛性壞死的現象產生，且腫瘤壞死區使部分腫瘤細胞排列呈島樣，其中特別係第E3組(請參照第3D圖)中，由於腫瘤壞死區所佔之面積較大，使得部分腫瘤細胞受壞死區所分散而呈離散狀分布。
綜合上述，本發明之中草藥萃取物係具有三萜類及多醣體等活性成分，可以有效縮小肝腫瘤體積，廣泛應用於各種肝癌患者，可以輔助習知肝癌療法，達到治療肝癌之功效。
再者，本發明之中草藥萃取物係可以利用所富含之多醣體，解決牛樟芝單方所造成免疫力下降之問題，強化免疫系統，活化巨噬細胞，達到減輕服用牛樟芝單方引起的副作用之功效。
並且，本發明之一種中草藥萃取物用於製備肝癌藥物的用途，係藉由萃取牛樟芝、桑黃菇及白鶴靈芝所獲得的活性成分毒殺肝癌細胞，促使肝腫瘤內部組織壞死，達到使肝腫瘤無法增生之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定 本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (2)

  1. 一種中草藥萃取物用於製備肝癌藥物之用途，係以每天每公斤所需個體體重投予10~30毫克之劑量，將該中草藥萃取物投予一所需個體30天，以抑制肝癌細胞生長，其中，該中草藥萃取物係由以下方法製備獲得：提供一混合物，該混合物係由以重量百分比計為60%之牛樟芝、20%之桑黃菇及20%之白鶴靈芝所組成；以95%乙醇於50~80℃加熱萃取該混合物，該混合物與95%乙醇之重量體積比為1：2，獲得一中草藥萃取液；及將該中草藥萃取液進行濃縮，以獲得該中草藥萃取物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之中草藥萃取物用於製備肝癌藥物之用途，其中該中草藥萃取物係以口服方式投予該所需個體。
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桑黃抗腫瘤活性成分研究 ,延邊大學論文 ,2012 仙鶴草抗肝癌SMMC-7721細胞作用之實驗研究 ,江西醫學院論文 ,2005 *

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