CN101810646B - 一种从桑黄中提取抗病毒活性物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明所述的从桑黄中提取抗病毒活性物质的方法涉及一种从中药中提取活性物质的方法。其包括：将桑黄子实体在低温中进行脱水粉碎；向粉碎后的子实体中加入其体积2-10倍的乙酸乙酯浸提，超声波震荡，抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥成粉末A。向乙酸乙酯提取后的滤渣中加入其2-10倍体积的90％乙醇浸提，超声波震荡，抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥成粉末B。向乙醇提取后的滤渣中加入其5-30倍体积的20℃水，超声提取，过滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥成粉末C。将粉末A，粉末B，粉末C以：10％-80％∶10％-80％∶10％-80％的质量百分含量比混合均匀。本发明所获得的活性物质具有较好的抗猴艾滋病毒(SIV)，疱疹病毒(HSV)和肠道病毒(EV71)的功效。

Description

一种从桑黄中提取抗病毒活性物质的方法

【技术领域】

本发明涉及一种从中药中提取活性物质的方法。

【背景技术】

桑黄属担子菌亚门、多孔菌科、木层孔菌属，又称桑臣、桑耳、胡孙眼、鲍氏层孔菌、针裂蹄(裂蹄)，是一种珍贵的药用真菌，有“森林黄金”之美称。据《药性论》记载：桑黄味微苦，性寒。具有利五脏，软坚，排毒，止血，活血，和胃止泻的功效。主治淋病，崩漏带下，症瘕积聚，癖饮，脾虚泄泻。在我国传统中药中用于治疗痢疾、盗汗、血崩、血淋、脐腹涩痛、脱肛泻血、带下、闭经等。在古代，民间就流传有“桑树生黄，幸得之，百病可医”的说法。现代研究表明，桑黄含有多糖、黑色素、过氧化酶、麦角甾醇、芳樟醇、三萜酸、脂肪酸类、芳香酸、原儿茶醛、丁香酸、咖啡酸、柚皮素、樱花亭、香豆素等成分。随着现代分析与检测方法的不断改进及新方法的开发，对桑黄的研究也进入了一个新的阶段。已有的研究发现桑黄具有以下功效：

1.抗肿瘤

沈业寿等的研究表明桑黄胞内多糖有明显的抗肿瘤作用，并能降低化疗药物造成的免疫系统损伤。KIm.H.M等发现桑黄菌丝体的胞外多糖能使T细胞增殖，对不同类抗原的T细胞液有增殖作用。赵澜等的研究表明桑黄粗多糖能显著抑制肿瘤细胞的粘附、侵袭和迁移等肿瘤转移相关能力，即桑黄粗多糖具有抑制肿瘤细胞增殖及肿瘤转移的作用。

2.保肝抗肝

张万国等研究表明，桑黄可通过抗脂质过氧化和调节炎症因子水平起到保护肝细胞的作用，并通过改善血液动力学性能，提高肝区微循环起到抗肝纤维化的作用。

3.抗诱变与突变

Shon研究表明桑黄菌丝体水提物具有抗诱变活性，主要是通过提高醌氧化还原酶和诱变剂的活性以及诱变水平来抑制肿瘤。

4.改善骨髓损伤

王中喜等研究表明桑黄多糖对小鼠骨髓造血功能损伤具有保护作用，可较好的改善动物骨髓损伤。

5.抗菌

Jong-Moon Hur等研究发现桑黄的正丁醇浸提物能有效的抗耐甲氧基西林金黄色葡萄球菌，其抗菌机理还需要进一步研究。

6.抗氧化

Ajith，T.A.等研究发现桑黄乙酸乙酯浸提物对超氧阴离子的清除，抗坏血酸引起油脂氧化的抑制，过氧化物和一氧化氮的清除有很好的效果。

7.抗炎症

Kim，S.H等发现桑黄正丁醇提取物可以消去由巴豆油引起的小鼠耳朵水肿发炎。Beom-Su Jang等研究发现桑黄提取物能够抑制肺炎大鼠炎症细胞包括嗜中性粒细胞的数量及白介素(L)-1β的水平。

8.抗血管生成

Kim，S.H等研究发现桑黄正丁醇提取物可以强烈抑制胚鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。Song Y S等研究也表明桑黄的乙醇提取物包含有效的抗血管生成物质。这些研究让我们有理由相信桑黄的抗血管生成作用将会成为癌症治疗的辅助性治疗。

9.降血糖

Kim等研究发现桑黄多糖能降低血糖，同时减少总胆固醇、三酰甘油和天冬氨酸转氨酶。

综上所述，桑黄在抗肿瘤、护肝、抗炎症、抗诱变与突变、抗氧化、抗菌、降血糖、改善骨髓损伤、抗血管生成方面有突出功效。但在抗病毒方面的研究却鲜有报道，本发明主要对桑黄的抗病毒功效进行研究。

【发明内容】

本发明旨在提供一种从桑黄中提取抗病毒活性物质的方法，其中所获得的抗病毒活性物质可以用于预防和辅助治疗相关病毒感染疾病。

本发明所述的一种从桑黄中提取抗病毒活性物质的方法，由以下步骤组成：

(1)将桑黄子实体在低温中进行脱水粉碎；

(2)向粉碎后的桑黄子实体中加入其体积2-10倍的乙酸乙酯浸提，并使用超声波震荡，抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥成粉末A。

(3)向乙酸乙酯提取后的滤渣中加入该滤渣2-10倍体积的90％乙醇浸提，并使用超声波震荡，抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥成粉末B。

(4)向乙醇提取后的滤渣中加入该滤渣5-30倍体积的20℃水，超声提取，过滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥成粉末C。

(5)将粉末A，粉末B，粉末C以：10％-80％∶10％-80％∶10％-80％的质量百分含量比混合均匀。

其中，步骤(1)所述的低温优选为20℃以下的低温。

步骤(2)中所述的乙酸乙酯浸提，优选为其浸提1-3次，每次1-2小时。

步骤(3)中所述的乙醇浸提，优选为其浸提1-3次，每次1-2小时。

步骤(2)和(3)中所述的超声波震荡时间优选为1-4小时。

步骤(4)中所述的超声提取，优选为其浸提1-4次，每次1-4小时。

本发明有效地提取了桑黄中的抗病毒活性物质，并使获得的活性物质具有较高的抗病毒功效。通过实验验证发现此制剂副作用低，对多种病毒具有良好的抑制效果，且无耐药性的产生。

下面通过相关实验来验证本发明从桑黄中提取获得的抗病毒活性物质(下面简称为本发明)的功效。

使用本发明进行病毒感染细胞实验。

称取一定量的本发明，用1640培养基稀释成10mg/ml后，用0.22um的无菌滤器除去细菌等污染物。然后用1640培养基稀释到2mg/ml。

细胞毒性测试：

将本发明四倍梯度稀释后，各取50ml加入到在96孔板中100ml生长良好的CEM×174细胞悬液中，同时加入单独不同梯度本发明对照孔和细胞对照孔。37℃孵育24h后，加入10％的AlarmarBlue细胞活力检测试剂。孵育4h后，在酶标检测仪上读取荧光值。

实验结果见图1。

由实验结果测定桑黄的细胞毒性IC50值为603.567ug/ml，根据此结果，本实验选用的浓度远低于细胞毒性的半有效浓度，将其对细胞生长的影响降到最低，确保试验中细胞生长的变化是由病毒侵染造成的，提高试验结果的准确性。

1.抗猴艾滋病毒(SIV)实验

将不同浓度本发明溶液加入等量的细胞与病毒混合液。每个梯度有3个重复。作用4天后，出现合包体后，吹散细胞团，使之分散。计算每孔合包体数目。取这样每个梯度的6个平均值。

实验结果见图2。

根据实验结果计算得到本发明的IC50为75.0324ug/ml，表明本发明具有较好的抗SIV能力。

2.抑制疱疹病毒(HSV)实验

报告病毒测定法：用HSV-Blue报告病毒与不同浓度的本发明混合后，加入细胞中，孵育24小时检测其诱导产生的β-gal活性。由活性的高低确定抑制病毒的能力，即活性越低抑制病毒的能力越强。

实验结果见图3和图4。

图3和图4显示，本发明在6.25ug/ml的浓度下，具有很高的抗HSV能力。由于不能计算其IC50值，需要进一步降低本发明的浓度，测定其IC50值。

C.第二次本发明抗HSV活性复筛

同样利用报告病毒测定法确定本发明抑制病毒的能力。浓度从6.25ug/ml依次两倍稀释后，同病毒混合加入细胞，孵育24小时，测其β-gal活性。

实验结果见图5和图6。

由图5和图6可知，本发明抗HSV的IC50值为2.54901ug/ml，其治疗指数为＝CC50/IC50＝603.567/2.5＝241。说明其具有很好的抗HSV的能力。

3.抑制肠道病毒(EV71)实验

用不同浓度的本发明与200TCID50的EV71病毒混合后，培养3天后，出现细胞病变。吸取上清及病变细胞，然后加入MTT后孵育3-4小时后，检测其吸光率。

实验结果见图7。

由实验结果可知本发明抑制EV71的IC50值为0.87ug/ml。表明本发明具有很好的抗EV71的能力。

综合以上试验验证，本发明从桑黄中提取获得的抗病毒活性物质具有较好的抗猴艾滋病毒(SIV)，疱疹病毒(HSV)和肠道病毒(EV71)的功效。

【附图说明】

图1：AlarmarBlue测定桑黄的细胞毒性

图2：不同浓度的桑黄样品对SIV的抑制效果

图3：不同浓度的桑黄样品对HSV的抑制效果

图4：不同浓度的桑黄样品诱导细胞产生的β-gal的活性

图5：不同浓度的桑黄样品诱导细胞产生的β-gal的活性

图6：不同浓度的桑黄样品对HSV的抑制效果

图7：桑黄样品抑制EV71效果

【具体实施方式】

实施例一

1.将100克桑黄子实体在20℃以下的低温中进行脱水粉碎；

2.向粉碎后的桑黄子实体中加入其体积8倍的乙酸乙酯浸提3次，每次2小时，并使用超声波震荡1.5小时。抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥，获得3.27克粉末A。

3.向乙酸乙酯提取后的滤渣中加入该滤渣8倍体积的90％(体积浓度)乙醇浸提3次，每次2小时，并使用超声波震荡1.5小时。抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥，获得2.16克粉末B。

4.向乙醇提取后的滤渣中加入该滤渣15倍体积的20℃水，超声提取4次，每次3小时，过滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥，获得3.23克粉末C。

5.取2克粉末A，2克粉末B和2克粉末混合均匀即可。

实施例二

1.将100克桑黄子实体在20℃以下的低温中进行脱水粉碎；

2.向粉碎后的桑黄子实体中加入其体积10倍的乙酸乙酯浸提2次，每次1小时，并使用超声波震荡1.5小时。抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥，获得2.13克粉末A。

3.向乙酸乙酯提取后的滤渣中加入该滤渣10倍体积的90％(体积浓度)乙醇浸提2次，每次1小时，并使用超声波震荡1.5小时。抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥，获得1.27克粉末B。

4.向乙醇提取后的滤渣中加入该滤渣28倍体积的20℃水，超声提取2次，每次4小时，过滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥，获得3.17克粉末C。

5.取1.8克粉末A，1.1克粉末B和2.5克粉末混合均匀即可。

实施例三

1.将100克桑黄子实体在20℃以下的低温中进行脱水粉碎；

2.向粉碎后的桑黄子实体中加入其体积3倍的乙酸乙酯浸提1次，每次1.5小时，并使用超声波震荡1.5小时。抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥，获得1.15克粉末A。

3.向乙酸乙酯提取后的滤渣中加入该滤渣3倍体积的90％(体积浓度)乙醇浸提1次，每次1.5小时，并使用超声波震荡1.5小时。抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥，获得0.78克粉末B。

4.向乙醇提取后的滤渣中加入该滤渣9倍体积的20℃水，超声提取1次，每次4小时，过滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥，获得2.14克粉末C。

5.取1克粉末A，1.2克粉末B和1.8克粉末混合均匀。

Claims (7)

1.一种从桑黄中提取抗病毒活性物质的方法，由以下步骤组成：

(1)将桑黄子实体在低温中进行脱水粉碎；

(2)向粉碎后的桑黄子实体中加入其体积2-10倍的乙酸乙酯浸提，并使用超声波震荡，抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥成粉末A；

(3)向乙酸乙酯提取后的滤渣中加入该滤渣2-10倍体积的90％乙醇浸提，并使用超声波震荡，抽滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥成粉末B；

(4)向乙醇提取后的滤渣中加入该滤渣5-30倍体积的20℃水，超声提取，过滤后合并滤液，将滤液浓缩冷冻干燥成粉末C；

(5)将粉末A，粉末B，粉末C以：10％-80％∶10％-80％∶10％-80％的质量百分含量比混合均匀。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的低温为20℃以下的低温。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的乙酸乙酯浸提，其浸提次数为1-3次，每次1-2小时。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的乙醇浸提，其浸提次数为1-3次，每次1-2小时。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)和(3)中所述的超声波震荡时间为1-4小时。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的超声提取，其提取次数为1-4次，每次1-4小时。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所获得的活性物质具有抗猴艾滋病毒，疱疹病毒和肠道病毒EV71的功效。

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