CN113244276A - 桑黄或桑黄提取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂的用途 - Google Patents

桑黄或桑黄提取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了桑黄或桑黄提取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂的用途。本发明提供了桑黄或桑黄提取物的应用；所述应用为：桑黄或桑黄提取物在制备治疗新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；桑黄或桑黄提取物在制备治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；桑黄或桑黄提取物在制备预防新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；桑黄或桑黄提取物在制备预防新型冠状病毒感染的药物中的应用；桑黄或桑黄提取物在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。本发明提供了桑黄或桑黄提取物作为新型冠状病毒抗病毒药物的新用途，实现了老药新用的新思路。

Description

桑黄或桑黄提取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂 的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及桑黄或桑黄提取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂的用途，具体的所述桑黄提取物为桑黄水提取物或桑黄醇提取物。
背景技术
新型冠状病毒，是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的新发呼吸道病原体，与重症急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属于β-冠状病毒，具有较高的传染性和一定的致死率。新型冠状病毒，世界卫生组织称其为2019-nCoV，世界病毒分类委员会称其为SARS-CoV-2。
COVID-19大流行是21世纪以来人类面临的最大全球公共卫生危机，但目前仍无安全有效的药物应用于临床治疗。所以急需筛选出具有明显抗新冠病毒的药物，药物研发面临的主要挑战包括：
(1)目前的新冠相关的文献报导中，大多以综述或基于数据库的理论分析，在中医药方面体现的更为明显，这些说法只能说在理论上提供了一些参考数据，但实际上却没有确切证据证明药物可改善病毒清除率；
(2)现有的新冠相关的文献报导中，大部分都是参考药物对β冠状病毒属SARS-CoV和MERS-Cov的相关研究，虽然COVID-19也属于β冠状病毒，但序列分析显示,2019-nCoV与SARS-CoV的核苷酸同源性为79.0％,与MERS-CoV的同源性为51.8％,也明显看出COVID-19与二者在序列方面就有所不同，故药物研发上应逐一研究，不能一概而论；
(3)缺乏新药，故大多科研文章会主张使用老药新用或是多联合策略，但同时未在临床试验中显示出明显优势，没有确切证据证明哪种药物真正有效。
发明内容
本发明的目的是提供桑黄或桑黄提取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂的用途。
本发明提供了桑黄或桑黄提取物的应用；所述应用为以下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)：
(a1)桑黄或桑黄提取物在制备治疗新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；
(a2)桑黄或桑黄提取物在制备治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；
(a3)桑黄或桑黄提取物在制备预防新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；
(a4)桑黄或桑黄提取物在制备预防新型冠状病毒感染的药物中的应用；
(a5)桑黄或桑黄提取物在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。
本发明还提供了一种药物，其活性成分包括桑黄或桑黄提取物；
所述药物的功能为以下(b1)和/或(b2)和/或(b3)和/或(b4)：
(b1)治疗新型冠状病毒所致疾病；
(b2)治疗新型冠状病毒感染；
(b3)预防新型冠状病毒所致疾病；
(b4)预防新型冠状病毒感染。
本发明还提供了一种新型冠状病毒抑制剂，其活性成分包括桑黄或桑黄提取物。
以上任一所述桑黄提取物可为桑黄水提取物或桑黄醇提取物。
以上任一所述桑黄水提取物为以桑黄为原料采用水进行提取得到的。
以上任一所述桑黄水提取物为以桑黄为原料采用水提取出来的物质。
以上任一所述桑黄醇提取物为以桑黄为原料采用醇或醇溶液提取得到的。
以上任一所述桑黄醇提取物为以桑黄为原料采用醇或醇溶液提取出来的物质。
所述醇溶液具体可为醇水溶液(即由醇和水组成的溶液)。
所述醇具体可为乙醇。
所述醇溶液具体可为乙醇水溶液。
示例性的，所述醇溶液具体可为90％(体积比)以上乙醇水溶液。
示例性的，所述醇溶液具体可为95％(体积比)乙醇水溶液。
以上任一所述桑黄水提取物具体可为以下任一所述方法甲制备得到的。
以上任一所述桑黄醇提取物具体可为以下任一所述方法乙制备得到的。
本发明还提供了一种桑黄提取物的制备方法(方法甲)，包括如下步骤：以桑黄为原料采用水进行提取。
具体的，所述方法甲包括如下步骤：取桑黄，采用水进行单次提取，然后过滤并收集滤液。
具体的，所述方法甲包括如下步骤：取桑黄，采用水进行多次提取，每次提取均过滤并收集滤液，然后合并滤液。所述多次具体可为2-4次，例如3次。
每次提取中，桑黄和水的配比可为250g：1000-3000mL。
每次提取中，桑黄和水的配比可为250g：1500-2500mL。
每次提取中，桑黄和水的配比可为250g：1800-2200mL。
每次提取中，桑黄和水的配比可为250g：2000mL。
所述方法甲中，所述桑黄的量以干重计。
每次提取的条件具体可为：浸泡，然后超声提取。
具体的，浸泡的时间可为2-20h。
具体的，浸泡的时间可为2-15h。
具体的，浸泡的时间可为2-12h。
所述浸泡具体可为20-25℃浸泡。
具体的，超声提取的时间可为0.5-2h。
具体的，超声提取的时间可为1h。
所述超声提取具体可为60-100℃超声提取。
所述超声提取具体可为70-90℃超声提取。
所述超声提取具体可为80℃超声提取。
所述超声提取的参数具体可为500W，40KHZ。
所述过滤的孔径具体可为120mm。
所述方法甲还可包括如下步骤：将滤液依次进行浓缩和干燥，获得产物。
所述浓缩具体采用旋转蒸发的方法。
示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：60℃以下。
示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：55-60℃。
示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：58℃。
示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：50-60rpm。
示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：55rpm。
所述干燥具体可为冷冻干燥。
示例性的，冷冻干燥的方法具体可为：-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h。
示例性的，所述方法甲包括如下步骤：
(1)称取桑黄250g，剪碎，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡12h，然后80℃超声提取1h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；
(2)取步骤(1)得到的滤渣，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡2h，然后80℃超声提取1h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；
(3)取步骤(2)得到的滤渣，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡2h，然后80℃超声提取1h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液；
(4)将步骤(1)得到的滤液、步骤(2)得到的滤液和步骤(3)得到的滤液合并，然后用旋转蒸发仪浓缩，然后-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到桑黄水提取物。
所述方法甲制备得到的桑黄水提取物也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种桑黄提取物的制备方法(方法乙)，包括如下步骤：以桑黄为原料采用醇或醇溶液进行提取。
所述醇溶液具体可为醇水溶液(即由醇和水组成的溶液)。
所述醇具体可为乙醇。
所述醇溶液具体可为乙醇水溶液。
示例性的，所述醇溶液具体可为90％(体积比)以上乙醇水溶液。
示例性的，所述醇溶液具体可为95％(体积比)乙醇水溶液。
具体的，所述方法乙包括如下步骤：取桑黄，采用醇或醇溶液进行单次提取，然后过滤并收集滤液。
具体的，所述方法乙包括如下步骤：取桑黄，采用醇或醇溶液进行多次提取，每次提取均过滤并收集滤液，然后合并滤液。所述多次具体可为2-4次，例如3次。
每次提取中，桑黄和醇的配比可为1000g：5-15L。
每次提取中，桑黄和醇的配比可为1000g：5-12L。
每次提取中，桑黄和醇的配比可为1000g：8-10L。
每次提取中，桑黄和醇溶液的配比可为1000g：5-15L。
每次提取中，桑黄和醇溶液的配比可为1000g：5-12L。
每次提取中，桑黄和醇溶液的配比可为1000g：8-10L。
所述方法乙中，所述桑黄的量以干重计。
每次提取的条件具体可为：浸泡，然后超声提取。
具体的，浸泡的时间可为2-20h。
具体的，浸泡的时间可为2-15h。
具体的，浸泡的时间可为2-12h。
所述浸泡具体可为20-25℃浸泡。
具体的，超声提取的时间可为1-5h。
具体的，超声提取的时间可为2-4h。
具体的，超声提取的时间可为3h。
所述超声提取具体可为40-60℃超声提取。
所述超声提取具体可为50℃超声提取。
所述超声提取的参数具体可为500W，40KHZ。
所述过滤的孔径具体可为120mm。
所述方法乙还可包括如下步骤：将滤液依次进行浓缩和干燥，获得产物。
所述浓缩具体采用旋转蒸发的方法。
示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：60℃以下。
示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：50-60℃。
示例性的，所述旋转蒸发的温度具体可为：55℃。
示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：50-60rpm。
示例性的，所述旋转蒸发的转速具体可为：55rpm。
所述干燥具体可为冷冻干燥。
示例性的，冷冻干燥的方法具体可为：-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h。
示例性的，所述方法乙包括如下步骤：
(1)称取桑黄1000g，切碎，加95％乙醇溶液10L并混匀，室温浸泡12小时，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；
(2)取步骤(1)得到的滤渣，加95％乙醇溶液8L并混匀，室温浸泡2小时，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，分别收集滤液和滤渣；
(3)取步骤(2)得到的滤渣，加95％乙醇溶液8L并混匀，室温浸泡2小时，然后50℃超声提取3h，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液；
(4)将步骤(1)得到的滤液、步骤(2)得到的滤液和步骤(3)得到的滤液合并，然后用旋转蒸发仪浓缩，然后-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，得到桑黄乙醇提取物。
所述方法乙制备得到的桑黄醇提取物也属于本发明的保护范围。
本发明还保护桑黄在制备所述桑黄提取物中的应用。
桑黄是一类大型药用真菌的统称，分布于全国多省区，生长于柳树、桦树、杨树等阔叶树的树桩或树干上或倒木上，主要包括桑树桑黄、杨树桑黄和鲍姆桑黄等，药用部位为桑黄的子实体。杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)，简称杨黄，生长在杨树的活立木或倒木上，广泛分布于我国东北地区，全国多地均有人工种植，分类学地位隶属真菌界、担子菌门、层菌纲、非褶菌目、锈革孔菌科、桑黄孔菌属(Sanghuangporus)。
以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为杨树桑黄。
以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为购买的中药桑黄。
以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为采集并干燥后的桑黄。
以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为新鲜采集的桑黄。
以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为采集并干燥后的桑黄子实体。
以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为新鲜采集的桑黄子实体。
以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为桑黄孔菌的子实体和/或菌丝和/或孢子。
以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为采集并干燥后的桑黄孔菌的子实体和/或菌丝和/或孢子。
以上任一所述桑黄(作为原料的桑黄)可为新鲜采集的桑黄孔菌的子实体和/或菌丝和/或孢子。
本发明的发明人制备了桑黄提取物并检测了其细胞毒性以及其对于新型冠状病毒的抗病毒效果。结果表明，桑黄提取物的细胞毒性非常小(桑黄水提取物对Vero细胞的IC50值为3408.194μg/mL，桑黄醇提取物对Vero细胞的IC50值为1398.063μg/mL)同时抗病毒效果非常显著(可抑制病毒复制，从而提高病毒的清除率)。在安全的药物浓度下，随着桑黄提取物剂量增加Vero细胞中病毒核酸复制数呈现出递减趋势。本发明提供了桑黄或桑黄提取物作为新型冠状病毒抗病毒药物的新用途，实现了老药新用的新思路。
附图说明
图1为不同浓度的RD-1对Vero细胞的抑制率。
图2为不同浓度的LB-2对Vero细胞的抑制率。
图3为不同浓度的AS-3对Vero细胞的抑制率。
图4为不同浓度的SHS对Vero细胞的抑制率。
图5为不同浓度的RD-1对病毒RNA拷贝数的影响。
图6为不同浓度的LB-2对病毒RNA拷贝数的影响。
图7为不同浓度的AS-3对病毒RNA拷贝数的影响。
图8为不同浓度的SHS对病毒RNA拷贝数的影响。
图9为不同浓度的SHY对Vero细胞的抑制率。
图10为不同浓度的SHY对病毒RNA拷贝数的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中采用的酶标仪为荷兰雷勃MK3酶标仪。实施例中用于荧光定量PCR的为ABI QuantStudio5 Q5实时荧光定量PCR仪。实施例中的乙醇溶液均指的是乙醇水溶液，其中的％代表体积百分含量。实施例中的双抗均指的是青霉素和链霉素。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。室温的含义：20-25℃。如无特殊说明，实施例中提及的培养基均为含10％胎牛血清和2％双抗的DMEM培养基。如无特殊说明，实施例中的细胞培养条件均为：37℃，5％CO2。维持培养基：含2％(体积比)胎牛血清、3％(体积比)NaHCO3溶液、1％(体积比)HEPES溶液和1％双抗的DMEM培养基；NaHCO3溶液即市售的7.5％Sodium Bicarbonate溶液；HEPES溶液即市售的1M HEPES溶液。DMEM培养基：合肥摩尔生物科技有限公司。胎牛血清：合肥摩尔生物科技有限公司。二甲基亚砜(DMSO)：诺卓生物科技有限公司。10×PBS缓冲液(pH7.2-7.4)：诺卓生物科技有限公司。噻唑兰(MTT)：诺卓生物科技有限公司。
Vero细胞：非洲绿猴肾细胞，是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的一种细胞系。实施例中所用的新型冠状病毒均为COVID-19(SZ005)，是安徽省疾病预防控制中心实验室从病人分离出的毒株，记载于如下文献：Low dose of emetine as potentialantiSARS-CoV-2 virus therapy:preclinical in vitro inhibition and in vivopharmacokinetic evidences；Wang et al.Molecular Biomedicine(2020)1:14。实施例中所用的桑黄为杨树桑黄的干燥的子实体(计量重量为干重)，产地为安徽金寨。
瑞德西韦(Remdesivir，用RD-1表示)：上海源叶生物科技有限公司，C20A11L121820。奥司他韦(Oseltamivir，用AS-3表示)：Shanghai Macklin BiochemicalCo.,Ltd,C10057645。利巴韦林(Ribavirin，用LB-2表示)：上海源叶生物科技有限公司,N03N11W129695。
实施例1、桑黄水提取物的制备
1、称取桑黄250g，剪碎，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡12h，然后80℃超声提取1h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。
2、取步骤1得到的滤渣，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡2h，然后80℃超声提取1h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。
3、取步骤2得到的滤渣，加蒸馏水2000mL并混匀，室温浸泡2h，然后80℃超声提取1h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，收集滤液。
4、将步骤1得到的滤液、步骤2得到的滤液和步骤3得到的滤液合并(总体积约为5500-5800mL)，然后用旋转蒸发仪(负压、58℃、55rpm)浓缩至约100mL，然后-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，然后取出研磨并获得粉末状产物，即为桑黄水提取物(用SHS表示)。共获得3.655g SHS。
实施例2、桑黄水提取物对新型冠状病毒的抑制作用
一、样本液的制备
取80mg实施例1制备的SHS，溶解于500μl DMSO，得到SHS母液(SHS浓度为160mg/mL)。取SHS母液，用培养基稀释，得到各个浓度的SHS样本液。
取1mg RD-1，溶解于1000μl DMSO，得到RD-1母液(RD-1浓度为1mg/mL)。取RD-1母液，用培养基稀释，得到各个浓度的RD-1样本液。
取130mg LB-2，溶解于1000μl DMSO，得到LB-2母液(LB-2浓度为130mg/mL)。取LB-2母液，用培养基稀释，得到各个浓度的LB-2样本液。
取10mg AS-3，溶解于1000μl DMSO，得到AS-3母液(AS-3浓度为10mg/mL)。取AS-3母液，用培养基稀释，得到各个浓度的AS-3样本液。
二、细胞毒性试验
1、取96孔板，接种Vero细胞(5.0×103个细胞/孔)，采用培养基培养至70％汇合度。
2、完成步骤1后，吸弃上清，用1×PBS缓冲液冲洗2次，加入样本液(100μl/孔)，培养24小时。
样本液分别为步骤一制备的各个样本液。每种样本液设置3个平行处理。
3、完成步骤2后，吸弃上清，用1×PBS缓冲液冲洗2次，然后加入培养基(80μl/孔)和5mg/mL的MTT水溶液(20μl/孔)，培养4h。
4、完成步骤3后，吸弃上清，加入DMSO(100μl/孔)，均匀振荡以使结晶物充分融解，然后采用酶标仪在570nm波长下,测定并记录各孔光吸收值。
设置空白孔：即步骤1中不加入Vero细胞，步骤2中用等体积培养基代替样本液，其他步骤同上。
设置对照孔：即步骤2中用等体积培养基代替样本液，其他步骤同上。
Figure BDA0003132772920000081
计算半抑制浓度(IC50值)。
RD-1样本液的细胞抑制率结果见图1。RD-1的IC50值为40.865μg/mL。根据IC50值筛选出RD-1进行抗病毒试验的七个合适的药物浓度梯度如下：0.390μg/mL、0.781μg/mL、1.562μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL。
LB-2样本液的细胞抑制率结果见图2。LB-2的IC50值为2.891mg/mL。根据IC50值筛选出LB-2进行抗病毒试验的七个合适的药物浓度梯度如下：0.078125mg/mL、0.15625mg/mL、0.3125mg/mL、0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL。
AS-3样品液的细胞抑制率结果见图3。AS-3的IC50值为414.063μg/mL。根据IC50值筛选出AS-3进行抗病毒试验的七个合适的药物浓度梯度如下：7.8125μg/mL、15.625μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL。
SHS样本液的细胞抑制率结果见图4。SHS的IC50值为3408.194μg/mL。整体而言SHS对细胞的毒性很小，当药物浓度达到1600μg/mL时，细胞存活率依然大于80％。选择七个安全的药物浓度梯度：80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL、1280μg/mL和1600μg/mL进行抗病毒试验。
三、药物的体外抗病毒试验
试验在安徽省疾病预防控制中心实验室进行。
1、取96孔板，接种Vero细胞，采用培养基培养至95％汇合度(此时细胞数量约为1.0×105个细胞/孔)。
2、完成步骤1后，吸弃上清，用维持培养基洗涤2遍，然后每孔加入20μL病毒液，培养1.5h(培养过程中轻轻左右摇匀，保证病毒与细胞充分接触)。
病毒液的制备方法：将新型冠状病毒加至DMEM培养基中，得到TCID50值为10-3.5/0.1mL的病毒液(该TCID50值为针对Vero细胞的TCID50值)。
3、完成步骤2后，吸弃上清，用维持培养基洗涤2遍，然后加入含供试物的维持培养基(100μl/孔)，培养48小时。含供试物的维持培养基是将步骤一中制备的母液和维持培养基混合得到的。供试物(即SHS或RD-1或LB-2或AS-3)在培养体系中的浓度采用步骤二确定的各个浓度。每个浓度设置3个平行处理。设置用等体积维持培养基代替含供试物的维持培养基的孔，作为模型组。
4、完成步骤3后，每孔加入20μl TRIZOL，反复吹吸7-8次，充分混匀，先-80℃冷冻30min然后56℃融化30min，然后提取总RNA，即为RNA样本液。
5、采用TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测病毒核酸的拷贝数。
反应体系的组成(20μL)：RNA样本液5μL，引物探针混合液1μL、4×
Figure BDA0003132772920000092
FastVirus1-StepMasterMix 5μL、RT-PCR GradeWater 9μL。引物探针混合液提供的有效成分为上游引物N-F、下游引物N-R和探针N-P。反应体系中，上游引物N-F的工作浓度为0.2μM、下游引物N-R的工作浓度为0.2μM，探针N-P的工作浓度为0.1μM。
上游引物N-F：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；
下游引物N-R：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；
探针N-P：5’-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3’。
反应程序见表1。
表1
Figure BDA0003132772920000091
Figure BDA0003132772920000101
供试物为RD-1时的拷贝数浓度结果见图5(Virus代表模型组)。药物浓度为6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数呈现出递减趋势，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。步骤二中已确定RD-1的IC50值为40.865μg/mL，故可以选择使用12.5μg/mL药物浓度作为其他供试物的阳性对照组。
供试物为LB-2时的拷贝数浓度结果见图6(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为5mg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数呈现明显下降，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用，与模型组相比显著性差异极大。步骤二中已确定LB-2的IC50值为2.891mg/mL，故无药物浓度可供使用。
供试物为AS-3时的拷贝数浓度结果见图7(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为250μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数呈现下降趋势，当药物浓度为500μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数呈现明显下降，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。药物浓度为250μg/mL时与模型组相比具有显著性差异，药物浓度为500μg/mL时与模型组相比显著性差异极大。步骤二中已确定AS-3的IC50值为414.063μg/mL，因此药物浓度为250μg/mL可供使用，但此浓度下药物抗病毒效果较差。
供试物为SHS时的拷贝数浓度结果见图8(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL、1280μg/mL和1600μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数呈现出递减趋势，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。药物浓度为640μg/mL、960μg/mL、1280μg/mL和1600μg/mL，与模型组相比显著性差异极大。步骤二中已确定SHS的IC50值为3408.194μg/mL，因此药物浓度为160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL、1280μg/mL和1600μg/mL药物浓度可供使用。结果表明，SHS的IC50值较大，相对于Vero细胞毒性较小，但同时却具有显著的抑制新型冠状病毒增殖的作用。
实施例3、桑黄乙醇提取物的制备
1、称取桑黄1000g，切碎，加95％乙醇溶液10L并混匀，室温浸泡12小时，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。
2、取步骤1得到的滤渣，加95％乙醇溶液8L并混匀，室温浸泡2小时，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，分别收集滤液和滤渣。
3、取步骤2得到的滤渣，加95％乙醇溶液8L并混匀，室温浸泡2小时，然后50℃超声提取3h(超声参数：500W，40KHZ)，自然冷却至室温，然后用布氏漏斗(120mm孔径)抽滤，收集滤液。
4、将步骤1得到的滤液、步骤2得到的滤液和步骤3得到的滤液合并，然后用旋转蒸发仪(负压、55℃、55rpm)浓缩至约300mL，然后-20℃冷冻24h，然后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48h，获得粉末状产物，即为桑黄乙醇提取物(用SHY表示)。共获得36g SHY。
实施例4、桑黄乙醇提取物对新型冠状病毒的抑制作用
一、样本液的制备
取80mg实施例3制备的SHY，溶解于500μl DMSO，得到SHY母液(SHY浓度为160mg/mL)。取SHY母液，用培养基稀释，得到各个浓度的SHY样本液。
二、细胞毒性试验
方法同实施例2的步骤二。
SHY样本液的细胞抑制率结果见图9。SHY的IC50值为1398.063μg/mL。SHY浓度为640μg/mL时细胞存活率依然大于80％，说明SHY药物毒性较小。故选择进行抗病毒试验的七个安全的药物浓度梯度如下：40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL、1280μg/mL。
三、药物的体外抗病毒试验
方法同实施例2的步骤三。
供试物为SHY。供试物在培养体系中的浓度采用步骤二确定的各个浓度。
供试物为SHY时的拷贝数浓度结果见图10(Virus代表模型组，Remdesivir代表阳性对照组)。药物浓度为320μg/mL、640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL时Vero细胞中病毒核酸复制数呈现出递减趋势，即此时的药物浓度具有抑制病毒增殖的作用。药物浓度为640μg/mL、960μg/mL和1280μg/mL，与模型组相比显著性差异极大。步骤二中已确定SHY的IC50值为1398.063μg/mL，因此药物浓度为640μg/mL和960μg/mL药物浓度可供使用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 安徽省森湶谷药业股份有限公司
安徽医科大学
<120> 桑黄或桑黄提取物作为新型冠状病毒治疗药物或抗病毒制剂的用途
<130> GNCYX211877
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgctgctgc ttgacagatt 20

Claims (10)

1.桑黄或桑黄提取物的应用；所述应用为以下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)和/或(a5)：
(a1)桑黄或桑黄提取物在制备治疗新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；
(a2)桑黄或桑黄提取物在制备治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；
(a3)桑黄或桑黄提取物在制备预防新型冠状病毒所致疾病的药物中的应用；
(a4)桑黄或桑黄提取物在制备预防新型冠状病毒感染的药物中的应用；
(a5)桑黄或桑黄提取物在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述桑黄提取物为桑黄水提取物或桑黄醇提取物。
3.一种药物，其活性成分包括桑黄或桑黄提取物；
所述药物的功能为以下(b1)和/或(b2)和/或(b3)和/或(b4)：
(b1)治疗新型冠状病毒所致疾病；
(b2)治疗新型冠状病毒感染；
(b3)预防新型冠状病毒所致疾病；
(b4)预防新型冠状病毒感染。
4.如权利要求3所述的药物，其特征在于：所述桑黄提取物为桑黄水提取物或桑黄醇提取物。
5.一种新型冠状病毒抑制剂，其活性成分包括桑黄或桑黄提取物。
6.如权利要求5所述的抑制剂，其特征在于：所述桑黄提取物为桑黄水提取物或桑黄醇提取物。
7.桑黄提取物的制备方法，包括如下步骤：以桑黄为原料采用水进行提取。
8.桑黄提取物的制备方法，包括如下步骤：以桑黄为原料采用醇或醇溶液进行提取。
9.权利要求7或8所述方法制备得到的桑黄提取物。
10.桑黄在制备权利要求9所述桑黄提取物中的应用。
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张勐: "桑黄子实体的主要化学成分，你了解吗", 《百度》, 24 February 2019 (2019-02-24), pages 1 *
摩洛哥: "一种新冠病毒新变体已蔓延欧洲！国内会暴发第二波疫情吗？钟南山、张文宏最新判断", pages 2, Retrieved from the Internet <URL:http://www.52hrtt.com/mlg/n/w/info/D1603860386411> *
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肝癌肺癌吴氏老中医: "预防和治疗冠状病毒肺炎|全民皆用桑霍汤|尽快结束这场战斗！", 《微信公众号》, 29 January 2020 (2020-01-29), pages 1 - 3 *
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