CN102552369B

CN102552369B - 一种金银花叶提取物作为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒剂的用途

Info

Publication number: CN102552369B
Application number: CN201210032337.1A
Authority: CN
Inventors: 陈剑锋; 邹坤; 邰源临; 胡建忠; 杨进; 汪鋆植
Original assignee: 陈剑锋; 邹坤
Current assignee: China Three Gorges University CTGU
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2032-02-14
Also published as: CN102552369A

Abstract

本发明涉及一种金银花叶提取物作为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒剂的用途，所述的金银花叶提取物是金银花叶经干燥、粉碎处理，然后使用乙醇提取，大孔树脂分离等处理步骤得到的。该金银花叶提取物具有良好的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性，对PRRSV感染细胞最小保护浓度为6.25μg/mL，能使PRRSV病毒滴度从10^5.8TCID₅₀降低至10^0.3TCID₅₀，使PRRSV ORF7mRNA含量降低1000多倍。

Description

一种金银花叶提取物作为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒剂的用途

【技术领域】

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种金银花叶提取物作为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒剂的用途。

【背景技术】

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)的病原体，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员。它是有囊膜、二十面体对称的单股RNA病毒。猪繁殖与呼吸综合征是近年发现的一种新的动物病毒性传染病，临床上以母猪的繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸系统疾病和高死亡率为特征。

金银花(Lon icera japonica Thunb)为忍冬科植物，其干燥花蕾或带初开的花入药。味甘性寒，具有清热解毒、凉散风热之功效，主治痈肿、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症，应用历史悠久。CN200810054995公开了一种金银花叶药用提取物。其提取方法是取金银花叶，切段或粉碎，按质量份加蒸馏水煮提，过滤，合并滤液，滤液浓缩，用盐酸调pH，离心，其上清液上大孔吸附树脂柱吸附，乙醇洗脱，回收乙醇，干燥，得到金银花叶药用提取物。该方法提取的金银花叶药用提取物辅以药剂学接受的辅料可以制成临床可使用的多种剂型，如片剂、胶囊剂等剂型。CN200810111737公开了一种治疗腹泻、肠炎的金银花叶有效部位药物组合物。该发明将金银花叶经提取、富集纯化，制成药组合物，从而使金银花叶得到充分利用。CN201110058959公开了一种从金银花叶中提取活性成分的方法，该方法包括鲜金银花叶预处理、超临界CO₂萃取、超声波强化浸提、浓缩上清液、最后制得活性成分等步骤。该方法提取金银花叶片中的活性成分，大大提高其应用价值，得到的产品可应用于制药、保健品等诸多领域。

但是，目前还没有将金银花叶提取物作为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒剂的任何报道，也没有相关的专利申请。

因此，本发明人在研究工作中发现金银花叶提取物在抗猪繁殖与呼吸综合征方面具有非常重要的作用，于是本发明人经过大量实验研究，终于完成了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种金银花叶提取物作为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒剂的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种金银花叶提取物作为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒剂的用途。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的金银花叶提取物使PRRSVmRNA含量降低1000倍以上。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的金银花叶提取物使PRRSV病毒滴度从10^5.8TCID₅₀降低至10^0.3TCID₅₀。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的金银花叶提取物对PRRSV感染细胞的最小保护浓度是6.25μg/mL。

根据本发明，所述的金银花叶提取物是采用下述制备方法得到的。

该制备方法的步骤如下：

称取金银花叶在温度40-60℃下烘干1.0-2.0h后，按照所述金银花叶以g计重量与所述乙醇水溶液以ml计体积之比1∶100-400，使用以体积计60-85％乙醇水溶液在温度40-80℃与常压的条件下加热回流提取2-5次，分离得到的提取液合并；

合并的提取液经过滤后进行浓缩与干燥得到一种黑色浸膏；

将所述的黑色浸膏与蒸馏水按照重量比1∶5充分混匀得到一种溶液，然后让这种溶液通过大孔离子交换树脂柱进行吸附，再顺序地用水与乙醇水溶液进行梯度洗脱，取以体积计55-65％乙醇水溶液洗脱液进行浓缩，然后真空冷冻干燥，得到所述的金银花叶提取物。

根据本发明的另一种优选实施方式，合并的提取液在温度40-60℃与0.1-0.5MPa的条件下进行浓缩下进行浓缩直至干燥。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的大孔离子交换树脂选自AB-8大孔吸附树脂。

根据本发明的另一种优选实施方式，水洗脱时水的使用量是大孔离子交换树脂柱体积的2-4倍。

根据本发明的另一种优选实施方式，在乙醇水溶液梯度洗脱时，乙醇水溶液浓度分别是以体积计25-35％、55-65％与85-95％，而它们的使用量分别是大孔离子交换树脂柱体积的1-2、3-4与2-3倍。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的55-65％乙醇水溶液洗脱液在温度60-80℃与0.1-0.5MPa的条件下进行浓缩2.5-3.5h，然后在温度-5～-10℃与压力0.01-0.1MPa下进行真空冷冻干燥22-26h。

下面将更详细地描述本发明。

猪繁殖与呼吸综合征是猪群发生以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的一种急性、高度传染的病毒性传染病。目前临床上没有特效药物，只能采取对症治疗的办法加以控制。体温升高病猪可以使用安乃近注射液、地塞米松、青霉素等进行控制。产后无乳母猪可以使用洁霉素、葡萄糖等进行控制。对于继发支原体肺炎的仔猪，可以使用壮观霉素或利高霉素进行控制。对于继发胸膜肺炎的仔猪，可以使用速解灵2进行控制。但这些方法都不是非常有效。

根据本发明，抗猪繁殖与呼吸综合征病毒剂应该理解是一种能够杀灭猪繁殖与呼吸综合征病毒或使其活性减弱的药剂，或是一种能够减轻繁殖与呼吸综合征症状的药剂。

根据本发明，所述的金银花叶提取物使PRRSV mRNA含量降低1000倍以上，这意味着该金银花叶提取物能有效的抑制PRRSV病毒的增殖。

所述的金银花叶提取物使PRRSV病毒滴度从10^5.8TCID₅₀降低至10^0.3TCID₅₀。

根据本发明，所述的病毒滴度应该理解是病毒的毒力或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)和半数致死量(LD₅₀)，其中以LD₅₀最常用。它是指在一定时间内能使半数试验动物致死的病毒量。TCID₅₀表示试验材料为细胞时培养的组织细胞中半数细胞被感染的量。病毒滴度从10^5.8TCID₅₀降低至10^0.3TCID₅₀，这意味着该金银花叶提取物能有效地抑制PRRSV病毒的增殖。

所述的金银花叶提取物对PRRSV感染细胞的最小保护浓度是6.25μg/mL。

根据本发明，所述的金银花叶提取物是采用下述制备方法得到的，该制备方法的步骤如下：

称取金银花叶在温度40-60℃下烘干1.0-2.0h后，按照所述金银花叶以g计重量与所述乙醇水溶液以ml计体积之比1∶100-400，使用以体积计60-85％乙醇水溶液在温度40-80℃与常压的条件下加热回流提取2-5次，分离得到的提取液合并。

本发明使用的金银花叶是三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室种植的4年生树型金银花“中银一号”叶片，也可以是目前市场上销售的金银花叶，例如宜宾县安兴金银花开发有限公司、济南广纳科技发展有限公司销售的金银花叶。

金银花叶在处理前需要使用在目前市场上销售的烘干机进行烘干，在温度40-60℃下烘干1.0-2.0h，使其金银花叶的水含量降低到以金银花叶重量计1％以下。金银花叶烘干温度应该控制在温度40-60℃，如果烘干温度低于40℃，则需要非常长的烘干时间才有可能达到含水量要求，这样会浪费大量的能源；如果烘干温度高于60℃，则会使金银花叶中的有效成分损失太多，因此，烘干温度40-60℃是合适的，优选地是45-55℃，更优选地是48-52℃。

然后，所述的金银花叶使用乙醇水溶液提取有效成分，提取时，使用化工技术领域里通常使用的提取设备，按照所述金银花叶以g计重量与所述乙醇水溶液以ml计体积之比1∶100-400在温度40-80℃与常压下进行提取2-5次，优选地，在其比例1∶150-350与温度50-70℃的条件下提取2-4次，更优选地，在其比例1∶180-320与温度55-65℃的条件下提取2-3次。

在提取后，采用常规分离方法，例如使用化工技术领域里通常使用的过滤器进行分离，最后的提取残留物弃去，多次得到的提取液合并起来，搅拌混合均匀，待后续进行处理。

合并的提取液首先在真空减压浓缩器中在温度40-60℃与0.1-0.5MPa的条件下进行浓缩至干燥。所述的真空减压浓缩器是目前市场上销售的产品，例如上海予华仪器设备有限公司、上海砥实机械设备有限公司生产的真空减压浓缩蒸发仪。

合并的提取液经过滤后进行浓缩与干燥得到一种黑色浸膏。

将所述的黑色浸膏与蒸馏水按照重量比1∶5充分混匀得到一种溶液，然后让这种溶液通过大孔离子交换树脂柱进行离子交换吸附，再顺序地用水与乙醇水溶液进行梯度洗脱，取以体积计55-65％乙醇水溶液洗脱液进行浓缩，然后真空冷冻干燥，得到所述的金银花叶提取物。

所述的大孔离子交换树脂选自AB-8大孔吸附树脂，也可以使用在性能上与AB-8大孔吸附树脂相同的市场销售的大孔吸附树脂。

该大孔离子交换树脂在预处理后装柱，然后让黑色浸膏水溶液通过大孔离子交换树脂柱进行离子交换，即在离子交换过程中，黑色浸膏水溶液中的一些粒子与离子交换树脂的活性基团发生反应而被固定在树脂上，其它一些粒子通过离子交换柱排出，这样达到分离。让黑色浸膏水溶液在室温的条件下通过该大孔离子交换树脂柱，该大孔离子交换树脂与该黑色浸膏水溶液的体积比是1∶4-10。

在该黑色浸膏水溶液通过大孔离子交换树脂柱后需要顺序地用水和乙醇水溶液进行洗脱。

在水洗脱时，水的使用量是大孔离子交换树脂柱体积的2-4倍。

在乙醇水溶液梯度洗脱时，乙醇水溶液浓度分别是以体积计25-35％、55-65％与85-95％，而它们的使用量分别是大孔离子交换树脂柱体积的1-2、3-4与2-3倍。

所述的55-65％乙醇水溶液洗脱液首先在真空减压浓缩器中在温度60-80℃与0.1-0.5MPa的条件下进行浓缩2.5-3.5h。所述的真空减压浓缩器是目前市场上销售的产品，例如上海予华仪器设备有限公司、上海砥实机械设备有限公司生产的真空减压浓缩蒸发仪。优选地，所述的55-65％乙醇水溶液洗脱液在温度45-55℃与0.2-0.4MPa的条件下进行浓缩2.8-3.2h。更优选地，所述的55-65％乙醇水溶液洗脱液在温度48-52℃与0.2-0.4MPa的条件下进行浓缩3h。

然后，得到的浓缩物在温度-5～-10℃与压力0.01-0.1MPa下进行真空冷冻干燥22-26h，得到所述的金银花叶提取物。所述的干燥箱是目前市场上销售的产品，例如杭州创意真空冷冻干燥设备厂、上海精密仪器仪表有限公司销售的产品。

使用所述的金银花叶提取物进行了细胞安全浓度测定、PRRSV感染细胞保护效果、PRRSV感染细胞最小保护浓度、病毒感染滴度、对PRRSV病毒mRNA含量的影响的研究，确定金银花叶提取物60％乙醇/水洗脱部位对PRRSV感染细胞最小保护浓度为6.25μg/mL。6.25μg/mL60％的乙醇/水洗脱部位能使PRRSV病毒滴度从10^5.8TCID₅₀降低至10^0.3TCID₅₀左右，使PRRSV ORF7mRNA含量降低1000多倍。

[有益效果]

本发明的金银花叶提取物具有良好的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性，对PRRSV感染细胞最小保护浓度为6.25μg/mL。6.25μg/mL金银花叶提取物能使PRRSV病毒滴度从10^5.8TCID₅₀降低至10^0.3TCID₅₀，使PRRSVORF7mRNA含量降低1000多倍。因此，本发明的金银花叶提取物在防治猪繁殖与呼吸综合征方面具有非常好的应用前景。

【附图说明】

图1表示不同浓度乙醇/水洗脱部位对PRRSV感染细胞的保护效果；

a：正常细胞孔，未加PRRSV感染的marc-145细胞，细胞生长正常，界限清晰；

b：PRRSV感染孔，10TCID₅₀PRRSV感染marc-145细胞后，细胞变圆，破碎，死亡；

c：90％乙醇水溶液洗脱部位孔，细胞变圆，破碎，死亡；

d：60％乙醇水溶液洗脱部位孔，细胞生长正常，界限清晰；

e：30％乙醇水溶液洗脱部位孔，细胞变圆，破碎，死亡；

f：水洗脱部位孔，细胞变圆，破碎，死亡。

图2表示金银花叶总提物60％乙醇水溶液洗脱部位对PRRSV感染细胞的保护效果

b：PRRSV感染孔，10TCID₅₀PRRSV感染marc-145细胞后，细胞变圆，破碎，死亡)

c：25μg/mL 60％乙醇水溶液洗脱部位，细胞生长正常，界限清晰；

d：12.5μg/mL60％乙醇水溶液洗脱部位，细胞生长正常，界限清晰；

e：6.25μg/mL60％乙醇水溶液洗脱部位，细胞生长正常，界限清晰；

f：3.125μg/mL60％乙醇水溶液洗脱部位，细胞变圆，破碎，死亡。

图3表示60％乙醇/水洗脱部位对病毒感染滴度的影响；

图4表示60％乙醇/水洗脱部位对PRRSV病毒mRNA表达水平检测。

【具体实施方式】

通过下述实施例将更好地理解本发明。

实施例1：制备金银花叶提取物

称取三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室种植的4年生树型“中银一号”金银花叶在温度50℃下烘干1.5h后，称取所述金银花叶1kg，往其中加入以体积计75％乙醇水溶液200L，在温度60℃与常压的条件下加热回流提取3次，分离得到的提取液合并；

合并的提取液经过滤后使用上海予华仪器设备有限公司生产的旋转蒸发仪在温度50℃与0.4MPa的条件下浓缩30min，得到的浓缩物再在温度60℃的条件下干燥45min，得到296g黑色浸膏；

将所述的黑色浸膏与蒸馏水按照重量比1∶5充分混匀得到一种溶液，然后让这种溶液通过上海摩速科学器材有限公司销售的AB-8大孔离子交换树脂柱进行离子交换吸附，再顺序地用水与乙醇水溶液进行梯度洗脱。

在水洗脱时，水的使用量是大孔离子交换树脂柱体积的3倍。

在乙醇水溶液洗脱时，乙醇水溶液的浓度分别是以体积计30％、60％与90％，而它们的使用量分别是大孔离子交换树脂柱体积的1、3与2倍。

这些洗脱液分别使用上海予华仪器设备有限公司生产的旋转蒸发仪在温度80℃与0.2MPa的条件下进行浓缩3h，然后使用杭州创意真空冷冻干燥设备厂生产的真空冷冻干燥设备在温度-8℃与压力0.04MPa下进行真空冷冻干燥24h，分别相应地得到181.6g、45.2g和33.7g金银花叶提取物。

实施例2：本发明金银花叶提取物对Marc-145细胞安全浓度的测定

称取一定量的本发明实施例1制备的金银花叶提取物，用Gibco公司生产的细胞维持液稀释成不同的浓度梯度，得到浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031mg/mL的金银花叶提取物溶液。取已长成单层marc-145细胞(武汉大学中国典型培养物保存中心(CCTCC))的96孔细胞培养板，弃去培养液，按照0.1mL/孔加入上述金银花叶提取物溶液，每个稀释度重复6孔，另设细胞对照，在5％CO₂培养箱(美国Thermo3111)中在温度37℃下培养16-48小时。培养结束后吸去培养基，用新鲜培养基洗涤以除去这些金银花叶提取物，接着每孔加入100μL MTT(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液(以重量计0.5％MTT)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，置于摇床上快速振荡10min，使结晶物充分溶解，使用上海川翔生物科技有限公司销售的酶联免疫检测仪在OD490nm处测量多孔吸光值。根据这些吸光值计算细胞抑制率。

抑制率＝(1-金银花叶提取物孔OD值)/空白孔OD值×100％

根据细胞抑制率判断该提取物对Marc-145细胞安全浓度是1mg/mL及以下浓度。

采用上述MTT法，在培养96h后发现，浓度高达1mg/mL的30％、60％、90％乙醇水溶液洗脱部位对Marc-145细胞均不表现毒性，与未加药的正常细胞相比，细胞生长状况不受影响，表明金银花提取物各乙醇水溶液洗脱部位对Marc-145细胞的最大安全浓度应该在1mg/mL以上。这些结果表明金银花提取物为无毒药物。

实施例3：不同乙醇水溶液洗脱部位对PRRSV感染细胞保护效果的研究

收集对数生长期的marc-145细胞悬液，在96孔板中每孔加入100μL(5×10³个细胞/孔)，待细胞单层生长至80％的汇合度时移去培养基，用不含FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)的DMEM培养基洗涤3次，然后加入2MOI(感染复数)的PRRSV病毒量，在温度37℃下感染1h后移去病毒液，再加入25μg/mL的待测药物，每个浓度设5个复孔。在NIKON显微镜下观察细胞病变(CPE)情况，其观察结果列于附图1和2中。

附图1的结果清楚地表明，本发明采用的60％乙醇水溶液洗脱部位对PRRSV感染细胞具有较好的保护效果，其它浓度的乙醇水溶液洗脱部位对PRRSV感染细胞无保护效果。

附图2的结果清楚地表明，6.25μg/mL 60％乙醇水溶液洗脱部位对PRRSV感染细胞仍具有较好的保护效果。

实施例4：60％乙醇水溶液洗脱部位对病毒感染滴度的影响

收集对数生长期的marc-145细胞悬液，在24孔板中每孔加入250μL(2×10⁴个细胞/孔)，待细胞单层生长至80％汇合度时移去培养基，用不含FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)的DMEM洗涤3次，然后加入2MOI(感染复数)的PRRSV病毒量，在温度37℃下感染1h后移去病毒液，然后加入250μL 6.25μg/mL待测药物，每个浓度设5个复孔。在72小时后将培养板移至冰箱中，在温度-20℃下冻融3次，移取细胞上清液，作为待测样本测定病毒感染滴度。在青霉素瓶中使用细胞培养液将待测样本连续进行10倍稀释，即取1单位体积待测样本用10单位体积细胞培养液进行稀释，按照这种方式进行连续稀释。将稀释病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度设8个复孔，每孔接种100μl。然后在每孔加入100μl marc-145细胞悬液，使细胞量达到3×10⁵个/ml。设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。逐日观察并纪录结果。按Reed-Muech两氏法进行计算，以-lgTCID₅₀值表示病毒的感染力。试验结果列于附图3。

附图2的结果清楚地表明，6.25μg/mL60％乙醇水溶液洗脱部位能使PRRSV病毒滴度从10^5.8TCID₅₀降低至10^0.3TCID₅₀，因此，60％乙醇水溶液洗脱部位具有极好的抗病毒作用。其它浓度的乙醇/水洗脱部位对PRRSV病毒感染滴度无影响。

实施例5：real time PCR方法检测药物对PRRSV病毒mRNA含量的影响

收集对数生长期的marc-145细胞悬液，在6孔板中每孔加入1.5mL(10⁶个细胞/孔)，待细胞单层生长至80％汇合度后移去培养基，用不含FBS(FetalBovine Serum，胎牛血清)的DMEM洗涤3次，然后加入2MOI(感染复数)的PRRSV病毒量，在温度37℃下感染1h后移去病毒液，然后加入500μL6.25μg/mL待测药物，每个浓度设3个复孔。在72小时后移去培养基，加入TRIzol试剂(Omega，USA)，按生产厂家推荐的操作方法提取细胞的总RNA。提取结束后立即进行反转录，以cDNA为模板，β-actin作为看家基因，real time PCR检测PRRSV ORF7基因的拷贝数。以未加病毒液的正常细胞作为对照，评价ORF7mRNA的变化情况。

PRRSVORF7基因的上下游引物：

ORF7-P1：5′-CCCCTAGTGAGCGGCAATT-3′

ORF7-P2：5′-AGTCCCAGCGCCTTGATTAA-3′

β-actin基因的上下游引物：

β-actin-P1：5′-ACTGTGCCCATCTACGAG-3′

β-actin-P2：5′-GTTGCGTTACACCCTTTC-3′

试验结果列于附图4。

附图4的结果清楚地表明，相对于病毒对照组，6.25μg/mL60％乙醇水溶液洗脱部位能使PRRSV mRNA含量降低1000多倍。其它浓度的乙醇水溶液洗脱部位对PRRSV mRNA的表达均没有抑制作用。

Claims

1.一种金银花叶提取物在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒剂中的用途，其特征在于所述的金银花叶提取物是采用下述制备步骤得到的：

称取金银花叶在温度40-60℃下烘干1.0-2.0h后，按照所述金银花叶以g计重量与所述乙醇水溶液以ml计体积之比1:100-400，使用以体积计60-85%乙醇水溶液在温度40-80℃与常压的条件下加热回流提取2-5次，分离得到的提取液合并；

合并的提取液经过滤后进行浓缩与干燥，得到一种黑色浸膏；

将所述的黑色浸膏与蒸馏水按照重量比1∶5充分混匀得到一种溶液，然后让这种溶液通过AB-8大孔吸附树脂柱进行吸附，再顺序地用水与乙醇水溶液进行梯度洗脱，取以乙醇浓度计55-65%乙醇水溶液洗脱液进行浓缩，然后真空冷冻干燥，得到所述的金银花叶提取物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的金银花叶提取物使PRRSVmRNA含量降低1000倍以上。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的金银花叶提取物使PRRSV病毒滴度从10^5.8TCID₅₀降低至10^0.3TCID₅₀。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的金银花叶提取物对PRRSV感染细胞的最小保护浓度是6.25μg/mL。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于合并的提取液在温度40-60℃与0.1-0.5MPa的条件下进行浓缩直至干燥。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于在水洗脱时，水的使用量是大孔离子交换树脂柱体积的2-4倍。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于在乙醇水溶液梯度洗脱时，乙醇水溶液的浓度分别是以体积计25-35%、55-65%与85-95%，而它们的使用量分别是大孔离子交换树脂柱体积的1-2、3-4与2-3倍。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的55-65%乙醇水溶液洗脱液在温度60-80℃与0.1-0.5MPa的条件下进行浓缩2.5-3.5h，然后在温度-5～-10℃与压力0.01-0.1MPa下进行真空冷冻干燥22-26h。