CN103214371B - 二咖啡酰奎宁酸制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种由金银花叶提取二咖啡酰奎宁酸的方法，还涉及所述二咖啡酰奎宁酸及其用途。该方法包括原料采收及预处理、有效成分提取、大孔吸附树脂预处理与柱层析分离等步骤。本发明的二咖啡酰奎宁酸对肉品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果，对肉品保鲜效果好，能很好地控制肉品颜色、挥发性盐基氮、细菌总数等的变化。本发明方法使用乙醇作为提取溶剂，避免使用化学防腐剂所带来的不安全性，本方法操作简单，成本低廉，便于广泛推广使用。

Description

二咖啡酰奎宁酸制备方法与应用

【技术领域】

本发明属于天然产物化学技术领域。更具体地，本发明涉及二咖啡酰奎宁酸，还涉及一种由金银花叶提取二咖啡酰奎宁酸的方法，还涉及所述二咖啡酰奎宁酸的用途。

【背景技术】

金银花（Lonicera japonica Thunb）为忍冬科植物忍冬，我国大部分地区均产，其茎叶和花是常用的抗病原微生物、抗炎解热、保肝利胆的中药，目前主要用金银花花蕾入药，而且还作为提取绿原酸的工业原料，用量较大，价格较高。金银花叶片是生产金银花的副产品，产量很大，是花蕾的10倍左右，药源丰富，应该充分利用。金银花叶片及其粗提物在临床上及现代抑菌试验中均表现出和花蕾相当，甚至好于花蕾的抑菌效果，但现有技术对金银花叶抑菌方面的研究只是基于金银花叶的粗提物，抑菌活性目标成分不清晰，杂质多，干扰重。

梅林在“秀山金银花、叶、茎中绿原酸的检测及其抑菌作用研究”，《药物研究》，第3期（2001年）中公开检测金银花花蕾、叶片和茎的绿原酸含量，并比较了不同部位抑菌活性，结果表明金银花叶提取物有较好的抑菌效果，具较高的开发价值。武雪芬、景小琦在“金银花叶药用成分的提取及抑菌试验”，《天然产物研究与开发》，第3期（2001年）中、赵彦杰在“金银花叶提取物的抑菌效果研究”，《食品科学》，第7期（2007年）中都对金银花叶提取物的抗菌作用进行了初步研究，比较了金银花叶粗提物及粗黄酮、酚酸的抑菌活性，没有对最佳的抑菌活性物进行追踪。李玉杰在“微粉化技术对金银花叶抑菌效果的研究”，《吉林农业科技学院学报》，第4期（2010年）中探讨了金银花叶粉碎粒度对抑菌活性物质提取效果的影响，认为金银花叶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果较强，没有涉及抑菌活性成分纯化。张宁、曹光群在“金银花叶的抑菌活性和抗氧化性研究”，《牙膏工业》第3期（2008年）中提出，金银花叶乙醇提取物抗菌谱较广，乙酸乙酯萃取物的抑菌效果最为显著。

食品是人类赖以生存和发展的物质基础，应当具有营养价值、安全性。近十多年随着经济日益全球化和国际食品贸易的日益扩大，由致病菌引起的重大食品安全事件屡屡发生。目前人们常使用化学防腐剂减少致病菌，尽管化学防腐剂对微生物有一定的抑制作用，但它具有一定的毒副作用，对人体健康存在潜在的危害，以我国广泛使用的食品防腐剂苯甲酸为例，苯甲酸及其钠盐因有积蕴中毒现象的报道，国际上对其使用一直存有争议，欧共体儿童保护集团认为它不宜用于儿童食品中，日本也对它的使用做出了严格限制。因此研发使用方便，效果好且无毒副作用的天然食品防腐剂已受到世界各国的普遍重视。

中草药以其独特的理念及对疾病的独特疗效而倍受世人的关注，其有效性与安全性在漫长的历史中得到了证实。将中草药用作食品防腐剂，不仅可以避免化学防腐剂的毒性危害，且病原菌不易产生耐药性，而且还可以赋予食品独特的风味，是一种深受消费者欢迎的，具有广阔前景的新型天然防腐剂。

鉴于现有食品技术存在的一些技术缺陷，针对化学防腐剂在食品保鲜中出现的问题，本发明人经过大量实验研究，终于完成了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种从金银花叶片中提取二咖啡酰奎宁酸的方法。

本发明的另一个目的是提供所述的二咖啡酰奎宁酸。

本发明的另一个目的是提供所述二咖啡酰奎宁酸的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种从金银花叶片中提取二咖啡酰奎宁酸的方法。

该提取方法的步骤如下：

A、原料采收及预处理

6-8月份采收的金银花叶，置于电热恒温鼓风干燥箱中在温度38～42℃下鼓风干燥6～10小时，干燥的绿色金银花叶片进行粉碎，通过40目筛得到金银花叶粉。

金银花为常绿植物，一年四季均可采收叶片，5月份为金银花的盛花期，收获花以后，6～8月份天气晴好，有效成分富集，有效成分含量为一年中最高。因此，6～8月份为采收金银花叶的最佳时期。将采收的叶片均匀放于电热恒温鼓风干燥箱中，其厚度约1.5cm，于温度40℃下鼓风干燥8小时，其中的多酚类成分保持完好。本发明使用的电热恒温鼓风干燥箱例如是吴江新亿阳烘箱制造厂生产的电热恒温鼓风干燥箱。

获得绿色的干燥叶片，使用中药材加工技术领域里通常使用的粉碎设备，例如青岛迈科隆粉末技术设备有限公司生产的MZ-50中药粉碎机进行粉碎，然后使用中药材加工技术领域里通常使用的筛分设备，例如华恒机械设备有限公司生产的HH-800-2S800直筛机进行筛分，收集40目筛下金银花叶粉末，然后置于杭州汇尔仪器设备有限公司、北京兴运科诺科贸中心、北京杰韦弗有限公司销售的玻璃干燥器中保存备用。

B、有效成分提取

按照以kg计金银花叶粉与以L计提取溶剂的比1:15～20，使用55～65重量%乙醇水溶液提取溶剂，对步骤A得到的金银花叶粉在温度68～72℃的条件下加热回流提取1.5～2.5h，然后进行离心分离，得到的上清液使用旋转蒸发仪在温度52～58℃与压力0.001～0.01MPa的条件下进行减压浓缩，其浓缩物在温度-55℃下再进行冷冻干燥，得到一种粗提物。

使用乙醇水溶液提取溶剂提取金银花叶粉时所使用的设备是目前化工技术领域里通常使用的设备，例如衡阳市合创药机科技有限公司销售的DTQ系列多功能提取罐等设备。

旋转蒸发仪主要用于在减压条件下连续蒸馏大量易挥发性溶剂，从而可以分离和纯化反应产物。旋转蒸发仪通常配备蒸馏烧瓶、回流蛇形冷凝管、恒温水槽、减压泵与接收烧瓶等。本发明使用的旋转蒸发仪是目前市场上销售的产品，例如上海羌强仪器设备有限公司销售的旋转蒸发仪。

冷冻干燥是将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰升华为蒸气而除去水的干燥方法。物料可先在冷冻装置内冷冻，再进行干燥。升华生成的水蒸气借冷凝器除去。冷冻干燥机是由干燥箱、凝结器、冷冻机组、真空泵、加热/冷却装置等组成。本发明使用的冷冻干燥机是目前市场上销售的产品，例如上海市比朗仪器有限公司销售的冷冻干燥机。

优选地，步骤A得到的金银花叶粉在温度70℃的条件下加热回流提取2.0h。

C、大孔吸附树脂预处理

大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡20～28小时，让其充分溶胀，然后用无水乙醇淋洗直至得到的析出液与等量蒸馏水混合后无白色浑浊现象，再用去离子水淋洗至无乙醇，然后依次用4～6重量％盐酸、纯水、4～6重量％氢氧化钠水溶液进行浸泡，流过树脂柱，其浸泡液与树脂的体积比为2～4；最后用大量纯水进行洗涤，洗涤至流出水为中性，然后沥干树脂，待用；

大孔吸附树脂是一种不含交换基团，但具有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中选择地吸附有机物，在环保、食品、医药技术等领域得到了广泛的应用。大孔吸附树脂在其内部存在一些未聚合的单体、残存的致孔剂、分散剂与引发剂等，因此在使用前需要进行预处理。

本发明使用的大孔吸附树脂是HPD500大孔吸附树脂或NKA-2大孔吸附树脂。它们都是目前市场上销售的产品，例如郑州勤实科技有限公司销售的HPD500大孔吸附树脂。

D、柱层析分离

称取25～35克在步骤B得到的粗提物溶解于18～22重量%乙醇水溶液中，让其以130～200ml/min通过5cm×60cm大孔吸附树脂层析柱进行吸附，再分别让水、40～45重量%乙醇水溶液、52～58重量%乙醇水溶液洗脱剂以流速0.8～1.2BV/h分别通过其层析柱进行梯度洗脱，各洗脱剂的总量为4～6BV，分步收集洗脱液，采用高效液相色谱法检测其成分，合并含有相似成分的洗脱液，然后进行真空浓缩，冷冻干燥，与标准物质的高效液相色谱和质谱对比确定，其52～58重量%乙醇洗脱液冻干物为二咖啡酰奎宁酸。它是一种含有3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸的混合物，即二咖啡酰奎宁酸防腐剂。

其HPLC洗脱梯度如下：

所述的高效液相色谱法在下述条件下进行检测：

高效液相色谱仪：Waters1525带双波长检测器。

色谱柱：250mm×4.6mm Alltima C₁₈柱，粒径5μm；流动相A为色谱纯乙腈，流动相B为0.2%磷酸水溶液；柱温40℃；流速0.7mL/min；检测波长238nm；灵敏度2.000AUFS；进样量10μL；每个样品平行测定3次。

二咖啡酰奎宁酸（3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸混合物）的高效液相色谱图列于附图1。该附图表明，3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸的色谱峰在44.5min，而4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸的色谱峰在47.1min。其它物质的峰很小，表明该混合物中的其它物质含量很低。

所述的质谱分析是在下述条件下进行的：

质谱检测采用Agilent6540超高解析度四级杆-飞行时间质谱仪（Q-TOF），离子极性，ESI(±)，扫描范围：130-800amu，干燥气流速（氮气）7L/min，干燥气温度400℃，负离子模式：S.V.：-4000V，O.V.：-101V,F.R.V.：-380V。

二咖啡酰奎宁酸（3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸混合物）质谱分析结果列于附图2中。该质谱图显示了分子碎片的情况及质荷比，表明两物质均为二-O-咖啡酰奎宁酸。

通过高效液相色谱图与质谱图的分析，可以确定本发明从金银花叶片中提取得到的为二咖啡酰奎宁酸（3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸），且纯度达到90%以上。

本发明还涉及采用本发明方法所得到的二咖啡酰奎宁酸。

在本发明中，所述的二咖啡酰奎宁酸应该理解是3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸与4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸的混合物。通过高效液相色谱图与质谱图分析，可以确定它们的重量比是1.2:1。

本发明还涉及所述的二咖啡酰奎宁酸在抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌中的用途。

具体地，本发明涉及所述的二咖啡酰奎宁酸作为肉品防腐剂的用途。

所述的二咖啡酰奎宁酸用作为肉品防腐剂时，一般是将所述的二咖啡酰奎宁酸水溶液或乙醇溶液加到肉品中，混匀进行保鲜。所述乙醇溶液的浓度通常是15～25重量%。二咖啡酰奎宁酸的用量是所述肉品重量的0.3%。

在本发明中，所述的肉品是猪肉或鸭肉。

本发明方法提取的金银花叶抑菌活性成分二咖啡酰奎宁酸，对肉品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果，浓度0.1g/mL二咖啡酰奎宁酸抑菌效果优于浓度0.0015g/mL苯甲酸、山梨酸（国标规定的食品中能使用的最大浓度）的抑菌效果，抑菌圈分别达到20.0±0.3、24.0±0.2mm，见附图3。本发明的二咖啡酰奎宁酸对肉品的保鲜效果好，能很好地控制肉品颜色、挥发性盐基氮、细菌总数等的变化。在从金银花叶中提取二咖啡酰奎宁酸时只使用乙醇作为溶剂，因此，避免了化学防腐剂使用时所带来的不安全性，提取操作简单，成本低廉。本发明的二咖啡酰奎宁酸天然无污染，具有保肝、利胆、益气养阴、活血健脑等功效。

[有益效果]

本发明的有益效果是：本发明的二咖啡酰奎宁酸对肉品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果，浓度0.1g/mL二咖啡酰奎宁酸抑菌效果优于浓度0.0015g/mL苯甲酸、山梨酸（国标规定的食品中能使用的最大浓度）的抑菌效果，抑菌圈分别达到20.0±0.3、24.0±0.2mm。对肉品保鲜效果好，能很好地控制肉品颜色、挥发性盐基氮、细菌总数等的变化。本发明方法以乙醇作为溶剂，避免使用化学防腐剂所带来的不安全性，操作简单，成本低廉，便于广泛推广使用。

【附图说明】

图1是3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸混合物防腐剂色谱图；

3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸色谱峰是44.5min；

4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸色谱峰是47.1min

图2是3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸（上）和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸（下）的质谱图；

图3是本发明二咖啡酰奎宁酸抑菌效果图：

a与b分别是二咖啡酰奎宁酸抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌效果图（2mg/disc）；

c与d分别是苯甲酸钠抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌效果图（0.03mg/disc）；

e与f分别是山梨酸钾抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌效果图（0.03mg/disc）。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

实施例1：提取二咖啡酰奎宁酸

该实施例的实施步骤如下：

A、原料采收及预处理

采收的金银花叶，去除杂物，将其均匀放于吴江新亿阳烘箱制造厂生产的电热恒温鼓风干燥箱中，厚度约1.5cm，在温度40℃下鼓风干燥8小时，干燥的绿色金银花叶片使用青岛迈科隆粉末技术设备有限公司生产的MZ-50中药粉碎机进行粉碎，然后使用华恒机械设备有限公司生产的HH-800-2S800直筛机进行筛分，收集40目筛下金银花叶粉末，置于杭州汇尔仪器设备有限公司销售的玻璃干燥器中保存备用。

B、有效成分提取

按照以kg计金银花叶粉与以L计提取溶剂的比1:18，使用60重量%乙醇水溶液提取溶剂18L，对步骤A得到的金银花叶粉1kg在温度70℃的条件下加热回流提取2.0h，然后以转速4000r/min进行离心分离10min，得到的上清液使用上海羌强仪器设备有限公司销售的旋转蒸发仪在温度55℃与压力0.005MPa的条件下进行减压浓缩，得到的浓缩物然后使用上海市比朗仪器有限公司销售的冷冻干燥机在温度-55℃下进行冷冻干燥，得到141g粗提物；

C、大孔吸附树脂预处理

郑州勤实科技有限公司销售的HPD500大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡24小时，让其充分溶胀，再用无水乙醇淋洗直至得到一种如此淋洗液，以致它与等量蒸馏水混合后无白色浑浊现象，然后用去离子水淋洗至无乙醇（采用酒精计方法检验），再依次用5重量％盐酸、纯水、5重量％氢氧化钠水溶液进行浸泡，其浸泡液与树脂的体积比为3，浸泡后流过树脂柱；最后用大量纯水进行洗涤，洗涤至流出水为中性（用pH试纸检查），然后沥干树脂，待用；

D、柱层析分离

让30克在步骤B得到的粗提物溶解于20重量%乙醇水溶液中，让此溶液以165ml/min通过5cm×60cm HPD500大孔吸附树脂层析柱进行吸附，再分别让水、浓度42重量%乙醇水溶液、55重量%乙醇水溶液以流速1.0BV/h通过其层析柱进行梯度洗脱，各洗脱液的总量为5BV，分步收集洗脱液，采用高效液相色谱法在说明书中描述的条件下检测其成分，合并含有相似成分的洗脱液，在与步骤B相同的条件下先进行真空浓缩，然后冷冻干燥，得到冻干物的高效液相色谱和质谱与标准物质进行对比确定，其55%乙醇洗脱液冻干物是二咖啡酰奎宁酸，它是一种含有3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸的混合物（其重量比1.2比1）防腐剂。

实施例2：提取二咖啡酰奎宁酸

该实施例的实施步骤如下：

A、原料采收及预处理

采收的金银花叶，去除杂物，将其均匀放于吴江新亿阳烘箱制造厂生产的电热恒温鼓风干燥箱中，其厚度约1.5cm，在温度38℃下鼓风干燥10小时，干燥的绿色金银花叶片使用杭州华菱机械有限公司WF万能粉碎机进行粉碎，其40目筛下金银花叶粉末，然后置于北京兴运科诺科贸中心销售的玻璃干燥器中保存备用。

B、有效成分提取

按照以kg计金银花叶粉与以L计提取溶剂的比1:15，使用65重量%乙醇水溶液提取溶剂15L，对步骤A得到的金银花叶粉1kg在温度72℃的条件下加热回流提取1.5h，然后以转速4000r/min进行离心分离10min，得到的上清液使用上海羌强仪器设备有限公司销售的旋转蒸发仪在温度52℃与压力0.01MPa的条件下进行减压浓缩，得到的浓缩物然后使用上海市比朗仪器有限公司销售的冷冻干燥机在温度-55℃下进行冷冻干燥，得到140g粗提物；

C、大孔吸附树脂预处理

沧州宝恩科技有限公司销售的HPD500大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡20小时，让其充分溶胀，再用无水乙醇淋洗直至得到一种如此淋洗液，以致它与等量蒸馏水混合后无白色浑浊现象，然后用去离子水淋洗至无乙醇（采用比重方法检验），再依次用4重量％盐酸、纯水、4重量％氢氧化钠水溶液进行浸泡，其浸泡液与树脂的体积比为2，浸泡后流过树脂柱；最后用大量纯水进行洗涤，洗涤至流出水为中性（用pH试纸检查），然后沥干树脂，待用；

D、柱层析分离

让30克在步骤B得到的粗提物溶解于20重量%乙醇水溶液中，让其粗提物水溶液以200ml/min通过5cm×60cm HPD500大孔吸附树脂层析柱进行吸附，再分别让水、浓度40重量%乙醇水溶液、52重量%乙醇水溶液以流速0.8BV/h通过其层析柱进行梯度洗脱，各洗脱液的总量为4BV，分步收集洗脱液，采用高效液相色谱法在说明书中描述的条件下检测其成分，合并含有相似成分的洗脱液，在与步骤B相同的条件下先进行真空浓缩，然后冷冻干燥，得到冻干物的高效液相色谱和质谱与标准物质进行对比确定，其52%乙醇洗脱液冻干物是二咖啡酰奎宁酸，它是一种含有3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸的混合物（其重量比1.22比1）防腐剂。

实施例3：提取二咖啡酰奎宁酸

该实施例的实施步骤如下：

A、原料采收及预处理

采收的金银花叶，去除杂物，将其均匀放于吴江新亿阳烘箱制造厂生产的电热恒温鼓风干燥箱中，其厚度约1.5cm，在温度42℃下鼓风干燥6小时，干燥的绿色金银花叶片再使用杭州华菱机械有限公司生产的B型万能粉碎机进行粉碎，其40目筛下金银花叶粉末置于北京杰韦弗有限公司销售的玻璃干燥器中保存备用。

B、有效成分提取

按照以kg计金银花叶粉与以L计提取溶剂的比1:20，使用65重量%乙醇水溶液提取溶剂20L，对步骤A得到的金银花叶粉1kg在温度68℃的条件下加热回流提取2.5h，然后以转速4000r/min进行离心分离10min，得到的上清液使用上海羌强仪器设备有限公司销售的旋转蒸发仪在温度58℃与压力0.001MPa的条件下进行减压浓缩，得到的浓缩物然后使用上海市比朗仪器有限公司销售的冷冻干燥机在温度-55℃下进行冷冻干燥，得到143g粗提物；

C、大孔吸附树脂预处理

郑州勤实科技有限公司销售的HPD500大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡28小时，让其充分溶胀，再用无水乙醇淋洗直至得到一种如此淋洗液，以致它与等量蒸馏水混合后无白色浑浊现象，然后用去离子水淋洗至无乙醇（采用酒精计方法检验），再依次用6重量％盐酸、纯水、6重量％氢氧化钠水溶液进行浸泡，其浸泡液与树脂的体积比为4，浸泡后流过树脂柱；最后用大量纯水进行洗涤，洗涤至流出水为中性（用pH计检查），然后沥干树脂，待用；

D、柱层析分离

让30克在步骤B得到的粗提物溶解于21重量%乙醇水溶液中，让其粗提物水溶液以200ml/min通过5cm×60cm HPD500大孔吸附树脂层析柱进行吸附，再分别让水、浓度45重量%乙醇水溶液、58重量%乙醇水溶液以流速1.2BV/h通过其层析柱进行梯度洗脱，各洗脱液的总量为6BV，分步收集洗脱液，采用高效液相色谱法在说明书中描述的条件下检测其成分，合并含有相似成分的洗脱液，在与步骤B相同的条件下先进行真空浓缩，然后冷冻干燥，得到冻干物的高效液相色谱和质谱与标准物质进行对比确定，其52%乙醇洗脱液冻干物是二咖啡酰奎宁酸，它是一种含有3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸的混合物（其重量比1.2比1）防腐剂。

试验实施例1：本发明制备二咖啡酰奎宁酸的抑菌试验

该实施例的实施步骤如下：

二咖啡酰奎宁酸样品配制：称取实施例1制备的二咖啡酰奎宁酸防腐剂粉末于锥形瓶中，用水溶解并稀释至0.1g/mL。

对照品配制：用水将山梨酸钾盐与苯甲酸钾盐配制成浓度0.0015g/mL水溶液，作为抑菌试验的样品。

将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌供试菌加到营养琼脂斜面培养基上进行培养活化，然后挑取菌落，以生理盐水将其配成含菌数约为1×10⁶个/mL的菌悬液。

取直径为12mm的灭菌滤纸片，加入二咖啡酰奎宁酸样品或对照品溶液20μL。往无菌培养皿内倒入约15mL的培养基，冷却后往培养基内加入供试菌悬液0.2mL，用涂布器涂布均匀，制成含菌平板。然后取浸润样品或对照品的滤纸片，贴在含菌平板上，每皿贴3片，结果取平均值。放入36℃恒温培养箱中培养24小时。培养后测量抑菌圈的大小，样品、苯甲酸钠和山梨酸钾对照品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别达到20.0±0.3、24.0±0.2mm；13.7±0.3、14.5±0.2和14.1±0.2、16.1±0.2。其结果表明样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑制作用好于大肠杆菌，在试验的浓度下，本发明二咖啡酰奎宁酸的试验结果好于苯甲酸钠与山梨酸钾的试验结果。

试验实施例2：本发明制备二咖啡酰奎宁酸的保鲜试验

该实施例的实施步骤如下：

按照猪肉重量的0.3重量%称取实施例1制备的二咖啡酰奎宁酸防腐剂，用热水溶解，然后把得到的二咖啡酰奎宁酸水溶液加入到猪肉品中，混匀，用于其猪肉抑菌保鲜。

在添加所述防腐剂后对其猪肉进行了细菌总数、挥发性盐基氮与色度的测定。

按照GB4789.2-2010《食品卫生微生物学检验细菌总数测定》进行细菌总数的测定。

按照GB／T5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》进行挥发性盐基氮(TVB—N total volatile basic nitrogen）的测定。

使用北京康光仪器有限公司WB-80型色差计在L*、A*色系统中进行色度（亮度、红色）测定。

表1：猪肉保鲜试验测定结果

表1的结果清楚地表明，本发明的二咖啡酰奎宁酸可以抑制猪肉中细菌总数、挥发性盐基氮的变化有抑制作用，而对色泽变化阻止作用不明显，具有较好保鲜猪肉效果。

试验实施例3：本发明制备二咖啡酰奎宁酸的保鲜试验

该实施例的实施步骤如下：

按照鸭肉重量的0.3重量%称取实施例2制备的二咖啡酰奎宁酸防腐剂，用20重量%乙醇水溶解，然后把得到的二咖啡酰奎宁酸乙醇溶液加入到鸭肉中，混匀，进行其鸭肉抑菌保鲜。

在添加所述防腐剂后对其鸭肉进行了细菌总数、挥发性盐基氮与色度的测定。

按照GB4789.2-2010《食品卫生微生物学检验细菌总数测定》进行细菌总数的测定。

按照GB／T5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》进行挥发性盐基氮(TVB—N total volatile basic nitrogen）的测定。

使用北京康光仪器有限公司WB-80型色差计在L*、A*系统下进行色度（亮度、红色）测定。

表2：鸭肉保鲜试验测定结果

表2的结果清楚地表明，本发明的二咖啡酰奎宁酸可以抑制鸭肉中细菌总数、挥发性盐基氮的变化，对鸭肉色泽变化的抑制作用不强，具有较好保鲜鸭肉品质作用。

Claims (4)

1.一种从金银花叶片中提取二咖啡酰奎宁酸的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、原料采收及预处理

6-8月份采收的金银花叶，置于电热恒温鼓风干燥箱中在温度38～42℃下鼓风干燥6～10小时，干燥的绿色金银花叶片进行粉碎，通过40目筛得到金银花叶粉；

B、有效成分提取

按照以kg计金银花叶粉与以L计提取溶剂的比1:15～20，使用55～65重量％乙醇水溶液提取溶剂，对步骤A得到的金银花叶粉在温度68～72℃的条件下加热回流提取1.5～2.5h，然后进行离心分离，上清液使用旋转蒸发仪在温度52～58℃与压力0.001～0.01MPa的条件下进行减压浓缩，浓缩物在温度-55℃下再进行冷冻干燥，得到粗提物；

C、大孔吸附树脂预处理

大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡20～28小时，让其充分溶胀，然后用无水乙醇淋洗直至得到的析出液与等量蒸馏水混合后无白色浑浊现象，再用去离子水淋洗至无乙醇，然后依次用4～6重量％盐酸、纯水、4～6重量％氢氧化钠水溶液进行浸泡，流过树脂柱，其浸泡液与树脂的体积比为2～4；最后用大量纯水进行洗涤，洗涤至流出水为中性，然后沥干树脂，待用；

D、柱层析分离

称取25～35克在步骤B得到的粗提物溶解于18～22重量％乙醇水溶液中，让其以130～200ml/min通过5cm×60cm大孔吸附树脂层析柱进行吸附，所述的大孔吸附树脂是HPD500大孔吸附树脂或NKA-2大孔吸附树脂；再分别让水、40～45重量％乙醇水溶液、52～58重量％乙醇水溶液洗脱剂以流速0.8～1.2BV/h分别通过其层析柱进行梯度洗脱，各洗脱剂的总量为4～6BV，分步收集洗脱液，采用高效液相色谱法检测其成分，合并含有相似成分的洗脱液，然后进行真空浓缩，冷冻干燥，与标准物质的高效液相色 谱和质谱对比确定，其52～58重量％乙醇洗脱液冻干物为二咖啡酰奎宁酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其HPLC洗脱梯度如下：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的高效液相色谱法在下述条件下进行检测：

色谱柱：250mm×4.6mm Alltima C₁₈柱，粒径5μm；流动相A为色谱纯乙腈，流动相B为0.2％磷酸水溶液；柱温40℃；流速0.7mL/min；检测波长238nm；灵敏度2.000AUFS；进样量10μL；每个样品平行测定3次。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的质谱在下述条件下进行检测：

质谱检测采用Agilent 6540超高解析度四级杆-飞行时间质谱仪，离子极性，ESI(±)，扫描范围：130-800amu，干燥气流速(氮气)7L/min，干燥气温度400℃，负离子模式：S.V.：-4000V，O.V.：-101V,F.R.V.：-380V。