CN102319287B

CN102319287B - 一种薄荷酚酸提取物及其在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN102319287B
Application number: CN 201110229166
Authority: CN
Inventors: 刘斌; 姜艳艳; 石任兵; 张凡
Original assignee: 刘斌
Priority date: 2011-08-11
Filing date: 2011-08-11
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2031-08-11
Also published as: CN102319287A

Abstract

本发明公开了一种薄荷酚酸提取物及其制备方法以及其在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用。本发明薄荷酚酸提取物通过水或乙醇加热回流提取，再通过弱极性或中等极性大孔吸附树脂分离纯化得到薄荷酚酸提取物；该薄荷酚酸提取物具有良好的抗呼吸道合胞病毒作用，可以制备成任何常用剂型。

Description

一种薄荷酚酸提取物及其在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种薄荷酚酸提取物及其在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是婴幼儿和低龄儿童急性下呼吸道感染的重要病原体，超过90％的儿童在2岁以前感染过RSV。RSV感染也是成人特别是老年人下呼吸道感染的重要病因，65岁以上老年人的下呼吸道和循环系统死亡中多与RSV相关者高达78％。而目前对RSV感染缺乏特异有效的治疗方法。抗病毒药物病毒唑(利巴韦林，Ribavirin)是目前FDA批准的唯一用于防治RSV感染的化学治疗药物，但该药由于存在骨髓细胞毒性，可引起头痛、白细胞减少、不可逆贫血、血清胆红素升高等副作用，其临床应用受到限制，只严格用于高危和病情严重的患儿，且近年来其疗效倍受争议。人类单克隆抗体palivizumab(Synagis)和静脉用免疫球蛋白(RSV-IGIV)虽已经注册使用，疗效较好，但由于存在治疗费用和血清制品的安全问题，在预防和治疗RSV感染时，仍需谨慎考虑，而不能普遍应用于临床。迄今临床还没有疫苗用于预防RSV感染。因此开发研制药效可靠、毒副作用小的防治RSV感染的药物，仍是目前国际上有待解决的重要课题之一。

中医药在预防和治疗RSV感染方面具有一定优势。临床多根据辨证论治原则，选择解表药、清热解毒药等治疗RSV感染疾病，具有良好疗效。薄荷为唇形科植物Mentha haplocalyx Briq的干燥地上部分，为传统的辛凉解表药，味辛，性凉，具有疏风、散热、疏肝、辟秽、解毒的功效。薄荷中含有大量的酚酸类成分，如咖啡酸、迷迭香酸、顺式丹酚酸、反式丹酚酸J、紫草酸、丹酚酸B、丹参素、丁香酸、香草酸、原儿茶酸等成分。

申请人研究发现，薄荷提取物具有良好的抗RSV作用，其抗RSV作用的主要药效成分为酚酸类物质。目前，未见薄荷酚酸类成分及其制备工艺，以及抗RSV作用的相关研究报道和专利文献。

发明内容

本发明的目的在于提供一种薄荷酚酸提取物，本发明的另一个目的在于提供其制备方法，本发明的第三个目的在于提供其质量检测方法，本发明的第四个目的在于提供其在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明薄荷酚酸提取物的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取薄荷药材，水或乙醇回流提取；

步骤2：弱极性或中等极性大孔吸附树脂纯化；

该薄荷酚酸提取物中总酚酸含量为30～90％；该薄荷酚酸提取物中总酚酸含量优选为50～80％。

将以上所得提取物，加入常规辅料，按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂、口服液、注射剂。

上述步骤1中，薄荷药材用0～70％乙醇回流提取2～4次，每次提取0.5～2小时，合并提取液，减压回收溶剂至干，得薄荷水或乙醇提取物，其中，优选的方法为薄荷药材用16倍量30％乙醇提取3次，每次1.5h；

上述步骤2中，将步骤1所得薄荷水或乙醇提取物加水分散溶解，以薄荷药材计，上样液浓度为0.05～0.2g/mL，以2000～4000r/min的转速离心20～40min，离心后取上清液，使用冰醋酸调节上样液pH值为2～4，通过弱极性或中等极性大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为1∶4～8，吸附流速为1～3BV/h，树脂柱径高比为1∶6～10，用0～30％乙醇洗脱1～3BV进行除杂，除杂流速为1～3BV/h，弃去，用50～90％乙醇洗脱3～7BV，洗脱流速为3～5BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥，即得薄荷酚酸提取物；优选的方法为薄荷水或乙醇提取物加水分散溶解，以薄荷药材计，上样液浓度为为0.1g/mL，以3000r/min的速度离心30min，取上清液，使用冰醋酸调节上样液pH值为3，上样于HPD-400型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶6，吸附流速为2BV/h，树脂柱径高比为1∶9，待吸附结束后，用20％乙醇洗脱2BV进行除杂，除杂流速为2BV/h，弃去，再用70％乙醇洗脱3BV，洗脱流速为4BV/h，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得薄荷酚酸提取物；

上述步骤2中大孔吸附树脂为D101、AB-8、HPD-400型大孔吸附树脂，优选为HPD-400型大孔吸附树脂；

上述制备方法中，优选的方法为薄荷药材用16倍量30％乙醇提取3次，每次1.5h，合并乙醇提取液，减压回收溶剂，得到薄荷乙醇提取物，加水分散溶解，以薄荷药材计，上样液浓度为0.1g/mL，以3000r/min的速度离心30min，取上清液，使用冰醋酸调节上样液pH值为3，上样于HPD-400型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶6，吸附流速为2BV/h，树脂柱径高比为1∶9，待吸附结束后，用20％乙醇洗脱2BV进行除杂，除杂流速为2BV/h，弃去，再用70％乙醇洗脱3BV，洗脱流速为4BV/h，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得薄荷酚酸提取物；

本发明薄荷薄荷酚酸提取物为薄荷经水或乙醇提取再通过大孔吸附树脂纯化得到，经抗呼吸道合胞病毒活性实验表明，具有良好的抑制呼吸道合胞病毒活性的作用。

实验例1实施例1薄荷酚酸提取物抑制呼吸道合胞病毒活性实验

1.细胞毒性试验

HEp 2细胞接种于96孔细胞培养板，置37℃ CO₂培养箱中培养2天，待细胞长成单层后，去掉培养液，加入0.1mL维持液对半稀释的供试品溶液，同时设0.1mL维持液作为空白对照。继续置37℃CO₂培养箱培养2～5天，每天在光镜下观察细胞病变情况，包括细胞单层的脱落、变圆、皱缩、胞浆中颗粒和空泡的形成。

计算半毒性浓度(TC₅₀)。

2.抗病毒试验

HEp 2细胞培养方法同上，去掉培养液，加入0.1mL(100TCID₅₀/0.1mL病毒)病毒悬液和0.1mL的最大细胞无毒浓度(指在光镜下观察检测到的对细胞不产生毒性的供试品最大浓度)为最高浓度对半稀释后的供试品溶液，同时以不含供试品的维持液作为空白对照。96孔细胞培养板置37℃CO₂培养箱中培养2～5天。光镜下检测病毒引起的细胞病变情况。以病毒唑为阳性对照药物，病毒繁殖的减少以病毒对照的百分数计算。

计算半数抑制浓度(EC₅₀)和治疗指数TI＝TC₅₀/EC₅₀。

3.薄荷酚酸提取物抗呼吸道合胞病毒活性

(1)薄荷酚酸提取物TC₅₀为0.31mg/mL，病毒唑TC₅₀为0.18mg/mL。

(2)薄荷酚酸提取物对呼吸道合胞病毒的抑制作用见表1，计算其EC₅₀为4.23μg/mL，TI为73.29；病毒唑EC₅₀为5.26μg/mL，TI为34.22。

表1薄荷酚酸提取物对呼吸道合胞病毒的抑制作用

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：胶囊剂

取薄荷1kg，采用16L30％乙醇提取3次，每次1.5h，合并提取液，减压回收溶剂至干，得水或乙醇提取物，加水分散，以3000r/min的速度离心30min，取上清液，即为浓度为0.1g/mL(以生药量计)的上样液，使用冰醋酸调节上样液pH值为3，上样于HPD-400型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶6，树脂柱径高比为1∶9，吸附流速为2BV/h，吸附结束后，20％乙醇洗脱2BV进行除杂，除杂流速为2BV/h，弃去，继而用70％乙醇洗脱3BV，洗脱流速为4BV/h，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得本发明薄荷酚酸提取物，加入常规辅料，按照常规工艺制成胶囊剂。

总酚酸含量测定方法

对照品溶液的制备：取迷迭香酸对照品适量，精密称定，置100mL容量瓶中，50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

样品溶液制备：取薄荷酚酸提取物适量，精密称定，置100mL容量瓶中，50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得样品溶液；

测定方法：精密吸取适量迷迭香酸对照品溶液和样品溶液，置25mL容量瓶中，依次加入50％乙醇5.0mL，0.3％SDS溶液1.0mL，混合显色剂(按体积比0.6％铁氰化钾溶液∶0.9％三氯化铁溶液＝1∶1配制)2.0mL，摇匀，于暗处静置5min；加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，于暗处放置60min，760nm处测定吸光度，外标两点法计算含量，经测定总酚酸含量为80％。

实施例2：片剂

取薄荷1kg，采用12L50％乙醇提取3次，每次1.0h，合并提取液，减压回收溶剂至干，得水或乙醇提取物，加水分散，以4000r/min的速度离心20min，取上清液，即为浓度为0.12g/mL(以生药量计)的上样液，使用冰醋酸调节上样液pH值为3，上样于HPD-400型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶7，树脂柱径高比为1∶10，吸附流速为1.5BV/h，吸附结束后，10％乙醇洗脱4BV进行除杂，除杂流速为4BV/h，弃去，继而用60％乙醇洗脱4BV，洗脱流速为4BV/h，收集60％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得本发明薄荷酚酸提取物，加入常规辅料，按照常规工艺制成片剂。

总酚酸含量测定方法

测定方法：精密吸取适量迷迭香酸对照品溶液和样品溶液，置25mL容量瓶中，依次加入50％乙醇5.0mL，0.3％SDS溶液1.0mL，混合显色剂(按体积比0.6％铁氰化钾溶液∶0.9％三氯化铁溶液＝1∶1配制)2.0mL，摇匀，于暗处静置5min；加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，于暗处放置60min，760nm处测定吸光度，外标两点法计算含量，经测定总酚酸含量为65％。

实施例3：丸剂

取薄荷1kg，采用14L40％乙醇提取2次，每次2.0h，合并提取液，减压回收溶剂至干，得水或乙醇提取物，加水分散，以2000r/min的速度离心40min，取上清液，即为浓度为0.08g/mL(以生药量计)的上样液，使用冰醋酸调节上样液pH值为3，上样于HPD-400型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶8，树脂柱径高比为1∶8，吸附流速为3BV/h，吸附结束后，20％乙醇洗脱2BV进行除杂，除杂流速为2BV/h，弃去，继而用80％乙醇洗脱3BV，洗脱流速为3BV/h，收集80％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得本发明薄荷酚酸提取物，加入常规辅料，按照常规工艺制成丸剂。

总酚酸含量测定方法

测定方法：精密吸取适量迷迭香酸对照品溶液和样品溶液，置25mL容量瓶中，依次加入50％乙醇5.0mL，0.3％SDS溶液1.0mL，混合显色剂(按体积比0.6％铁氰化钾溶液∶0.9％三氯化铁溶液＝1∶1配制)2.0mL，摇匀，于暗处静置5min；加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，于暗处放置60min，760nm处测定吸光度，外标两点法计算含量，经测定总酚酸含量为58％。

实施例4：口服液体制剂

取薄荷1kg，采用15L30％乙醇提取3次，每次1.0h，合并提取液，减压回收溶剂至干，得水或乙醇提取物，加水分散，以3200r/min的速度离心30min，取上清液，即为浓度为0.12g/mL(以生药量计)的上样液，使用冰醋酸调节上样液pH值为3，上样于HPD-400型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶6，树脂柱径高比为1∶7，吸附流速为2BV/h，吸附结束后，10％乙醇洗脱3BV进行除杂，除杂流速为3BV/h，弃去，继而用60％乙醇洗脱5BV，洗脱流速为2BV/h，收集60％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得本发明薄荷酚酸提取物，加入常规辅料，按照常规工艺制成口服液体制剂。

总酚酸含量测定方法

实施例5：注射剂

取薄荷1kg，采用12L50％乙醇提取2次，每次1.5h，合并提取液，减压回收溶剂至干，得水或乙醇提取物，加水分散，以3500r/min的速度离心40min，取上清液，即为浓度为0.10g/mL(以生药量计)的上样液，使用冰醋酸调节上样液pH值为2.5，上样于HPD-400型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶7，树脂柱径高比为1∶8，吸附流速为1BV/h，吸附结束后，15％乙醇洗脱2BV进行除杂，除杂流速为4BV/h，弃去，继而用70％乙醇洗脱3BV，洗脱流速为3BV/h，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得本发明薄荷酚酸提取物，加入常规辅料，按照常规工艺制成注射剂。

总酚酸含量测定方法

测定方法：精密吸取适量迷迭香酸对照品溶液和样品溶液，置25mL容量瓶中，依次加入50％乙醇5.0mL，0.3％SDS溶液1.0mL，混合显色剂(按体积比0.6％铁氰化钾溶液∶9％三氯化铁溶液＝1∶1配制)2.0mL，摇匀，于暗处静置5min；加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，于暗处放置60min，760nm处测定吸光度，外标两点法计算含量，经测定总酚酸含量为60％。

实施例6：

取薄荷1kg，采用12L40％乙醇提取2次，每次1.5h，合并提取液，减压回收溶剂至干，得水或乙醇提取物，加水分散，以3000r/min的速度离心40min，取上清液，即为浓度为0.15g/mL(以生药量计)的上样液，使用冰醋酸调节上样液pH值为3，上样于HPD-400型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶8，树脂柱径高比为1∶10，吸附流速为2BV/h，吸附结束后，20％乙醇洗脱3BV进行除杂，除杂流速为3BV/h，弃去，继而用50％乙醇洗脱6BV，洗脱流速为5BV/h，收集50％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得本发明薄荷酚酸提取物。

总酚酸含量测定方法

测定方法：精密吸取适量迷迭香酸对照品溶液和样品溶液，置25mL容量瓶中，依次加入50％乙醇5.0mL，0.3％SDS溶液1.0mL，混合显色剂(按体积比0.6％铁氰化钾溶液∶9％三氯化铁溶液＝1∶1配制)2.0mL，摇匀，于暗处静置5min；加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，于暗处放置60min，760nm处测定吸光度，外标两点法计算含量，经测定总酚酸含量为55％。

实施例7：

取薄荷5kg，采用70L20％乙醇提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收溶剂至干，得水或乙醇提取物，加水分散，以2000r/min的速度离心40min，取上清液，即为浓度为0.08g/mL(以生药量计)的上样液，使用冰醋酸调节上样液pH值为4，上样于HPD-400型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶4，树脂柱径高比为1∶6，吸附流速为1BV/h，吸附结束后，10％乙醇洗脱2BV进行除杂，除杂流速为2BV/h，弃去，继而用60％乙醇洗脱5BV，洗脱流速为3BV/h，收集60％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得本发明薄荷酚酸提取物。

总酚酸含量测定方法

测定方法：精密吸取适量迷迭香酸对照品溶液和样品溶液，置25mL容量瓶中，依次加入50％乙醇5.0mL，0.3％SDS溶液1.0mL，混合显色剂(按体积比0.6％铁氰化钾溶液∶9％三氯化铁溶液＝1∶1配制)2.0mL，摇匀，于暗处静置5min；加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，于暗处放置60min，760nm处测定吸光度，外标两点法计算含量，经测定总酚酸含量为65％。

实施例8：

取薄荷10kg，采用120L30％乙醇提取2次，每次1.5h，合并提取液，减压回收溶剂至干，得水或乙醇提取物，加水分散，以3000r/min的速度离心40min，取上清液，即为浓度为0.15g/mL(以生药量计)的上样液，使用冰醋酸调节上样液pH值为3，上样于HPD-400型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶8，树脂柱径高比为1∶10，吸附流速为2BV/h，吸附结束后，20％乙醇洗脱3BV进行除杂，除杂流速为2BV/h，弃去，继而用80％乙醇洗脱4BV，洗脱流速为4BV/h，收集80％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得本发明薄荷酚酸提取物。

总酚酸含量测定方法

实施例9：

取薄荷10kg，采用160L70％乙醇提取3次，每次1.0h，合并提取液，减压回收溶剂至干，得水或乙醇提取物，加水分散，以2000r/min的速度离心40min，取上清液，即为浓度为0.06g/mL(以生药量计)的上样液，使用冰醋酸调节上样液pH值为3.5，上样于D101型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶5，树脂柱径高比为1∶8，吸附流速为3BV/h，吸附结束后，10％乙醇洗脱2BV进行除杂，除杂流速为3BV/h，弃去，继而用90％乙醇洗脱3BV，洗脱流速为3BV/h，收集90％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得本发明薄荷酚酸提取物。

总酚酸含量测定方法

测定方法：精密吸取适量迷迭香酸对照品溶液和样品溶液，置25mL容量瓶中，依次加入50％乙醇5.0mL，0.3％SDS溶液1.0mL，混合显色剂(按体积比0.6％铁氰化钾溶液∶9％三氯化铁溶液＝1∶1配制)2.0mL，摇匀，于暗处静置5min；加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，于暗处放置60min，760nm处测定吸光度，外标两点法计算含量，经测定总酚酸含量为70％。

实施例10：

取薄荷10kg，采用140L60％乙醇提取2次，每次1.5h，合并提取液，减压回收溶剂至干，得水或乙醇提取物，加水分散，以4000r/min的速度离心20min，取上清液，即为浓度为0.12g/mL(以生药量计)的上样液，使用冰醋酸调节上样液pH值为3，上样于AB-8型大孔吸附树脂柱，生药量与树脂体积比为1∶7，树脂柱径高比为1∶9，吸附流速为2BV/h，吸附结束后，20％乙醇洗脱2BV进行除杂，除杂流速为2BV/h，弃去，继而用60％乙醇洗脱6BV，洗脱流速为3BV/h，收集60％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得本发明薄荷酚酸提取物。

总酚酸含量测定方法

测定方法：精密吸取适量迷迭香酸对照品溶液和样品溶液，置25mL容量瓶中，依次加入50％乙醇5.0mL，0.3％SDS溶液1.0mL，混合显色剂(按体积比0.6％铁氰化钾溶液∶9％三氯化铁溶液＝1∶1配制)2.0mL，摇匀，于暗处静置5min；加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，于暗处放置60min，760nm处测定吸光度，外标两点法计算含量，经测定总酚酸含量为44％。

Claims

1.一种具有抗呼吸道合胞病毒作用的薄荷酚酸提取物，其特征在于该提取物的制备方法包括如下步骤：

步骤1：取薄荷药材，用0～70％乙醇回流提取2～4次，每次提取0.5～2小时，合并提取液，减压回收溶剂至干，得薄荷水或乙醇提取物；

步骤2：将步骤1所得水或乙醇提取物加水分散溶解，以薄荷药材计，上样液浓度为0.05～0.2g/mL，以2000～4000r/min的转速离心20～40min，离心后取上清液，使用冰醋酸调节上样液pH值为2～4，通过弱极性或中等极性大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为1∶4～8，树脂柱径高比为1∶6～10，吸附流速为1～3BV/h，用0～30％乙醇洗脱1～3BV进行除杂，除杂流速为1～3BV/h，弃去，用50～90％乙醇洗脱3～7BV，洗脱流速为3～5BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥，即得薄荷酚酸提取物；

该薄荷酚酸提取物中总酚酸含量为30～90％。

2.如权利要求1所述的薄荷酚酸提取物，其特征在于为加入常规辅料，按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型。

3.如权利要求2所述的薄荷酚酸提取物，其特征在于所述常规剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、口服液体制剂、注射剂、颗粒剂或凝胶剂。

4.如权利要求2所述的薄荷酚酸提取物，其特征所述常规剂型为缓释剂。

5.如权利要求1所述的薄荷酚酸提取物的制备方法，其特征在于步骤1中，薄荷药材用0～70％乙醇回流提取2～4次，每次提取0.5～2小时，合并提取液，减压回收溶剂至干，得薄荷水或乙醇提取物。

6.如权利要求1所述的薄荷酚酸提取物的制备方法，其特征在于步骤2中，将步骤1所得水或乙醇提取物加水分散溶解，以薄荷药材计，上样液浓度为0.05～0.2g/mL，以2000～4000r/min的转速离心20～40min，离心后取上清液，使用冰醋酸调节上样液pH值为2～4，通过弱极性或中等极性大孔吸附树脂，生药量与树脂体积比为1∶4～8，树脂柱径高比为1∶6～10，吸附流速为1～3BV/h，用0～30％乙醇洗脱1～3BV进行除杂，除杂流速为1～3BV/h，弃去，用50～90％乙醇洗脱3～7BV，洗脱流速为3～5BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥，即得薄荷酚酸提取物。

7.如权利要求1所述的薄荷酚酸提取物的制备方法，其特征在于步骤2中所用大孔吸附树脂为D101、AB-8或HPD-400型大孔吸附树脂。

8.如权利要求1所述的薄荷酚酸提取物在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用。