CN107468684B - 鞣花酸及与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鞣花酸及与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用，所述鞣花酸不仅发挥作用较好，并且作为一种天然多酚物质，在动物实验中几乎未产生任何副作用，血清指标和体重均属正常，在雷公藤红素与鞣花酸协同作用时，可以降低雷公藤红素的使用剂量，并且无明显副作用。

Description

鞣花酸及与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及天然多酚物质领域，具体涉及到一种鞣花酸及与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用。

背景技术

肺癌是全世界癌症死亡的主要诱因之一，每年超过一百万病人死于肺癌，目前系统的治疗方法效果并不理想，并且预后很差，肺癌5年总的生存率只有15％，是世界范围内发病率和致死率最高的癌症，已成为严重威胁人类健康的“第一杀手”，仅在2008年，肺癌就有160万新发病例(占当年所有癌症的13％)，并且死亡病例也达到140万(占所有癌症的18％)，到了2010年，肺癌的死亡人数升至150万(占当年所有癌症的19％)(Jemal A,et al,2011；Reck M,et al,2013)。在我国，最新的全国登记地区报告发病率显示，肺癌发病率为53.37/10万，死亡率为45.57/10万，其中男性肺癌发病率高达70.40/10万，死亡率为61.00/10万，肺癌死亡率40年增长近10倍(Herbst RS,et al,2008)。

目前，肺癌的起源细胞还未阐述清楚(Society AC)。实际上，许多肺癌病人在发现时已处在局部晚期或晚期阶段，多学科综合治疗是推荐的治疗模式。然而，传统的治疗模式目前看上去已进入了一个平台期，晚期非小细胞(NSCLC)病人对化疗的有效率介于30％-40％之间，中位生存期仅11个月左右，且化疗还带来很多的毒副作用，导致病人的生产质量降低，并且很多治疗肺癌的药物毒性和副作用都较大。总之，尽管目前在肺癌基础研究、诊断以及治疗方面取得很大进展，但是治疗还是很不理想(5年生存期低于15％)(Jemal A,etal,2011)。

众所周知，改善饮食被认为是预防和控制肺癌的方式之一，果酒(如葡萄酒、蓝莓酒等)中含有丰富的多酚物质，其中鞣花酸是葡萄酒中普遍存在的多酚物质，是没食子酸的一种二聚衍生物，是多元酚家族的重要成员，研究表明，鞣花酸具有一系列生物活性，如自由基清除能力，化学防护作用，抗病毒活性等等。因而，化学预防的概念对高风险肺癌患者很有益处。

鞣花酸，分子式：C₁₄H₆O₈

鞣花酸是酚酸的双内酯产物，以可水解的鞣花单宁的形式自然存在于浆果和坚果类食物中，比如葡萄，葡萄酒，覆盆子，草莓，胡桃和核桃等(Talcott ST,2003；Mullen W,2003)。在碱性条件下，鞣花酸生成螯合物二价阳离子，如锌离子，钙离子，铁离子和铜离子等，这种特性增强了鞣花酸抑制金属蛋白酶活性的能力，如MMP-1，MMP-2，MMP-9等，锌离子和铜离子的螯合作用与其抗血管生成活性有关(Pan Q,et al,2002；Sartippour M R,etal,2002；Camphausen K,et al,2003；Shian S G,et al,2003)。有研究表明，在肝癌细胞中，鞣花酸通过激活线粒体外膜渗透性来调控蛋白，如一些重要的凋亡相关蛋白Bax，bcl-2，cyt-C和caspase-9。

雷公藤红素(Celastrol，又名Tripteriene)，分子式：C₂₉H₃₈O₄

雷公藤红素是于1936年从雷公藤的根中提取出来的第一个单体化合物，属于三萜类化合物，在各种实验动物模型中呈现出抗炎活性，包括胶原诱导性关节炎，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，老年性痴呆，狼疮，哮喘，风湿性关节炎等。此外，雷公藤红素还具有潜在的抗癌作用，可以抑制多种癌细胞的增殖以及诱导凋亡。

因此，目前化学预防被认为是最有希望预防癌症的方式之一，具体地，鞣花酸在一些癌症和调查中都表现了其化学防治活性，已有一些研究表明，鞣花酸对前列腺癌、结肠癌等肿瘤具有抑制作用，但对肺癌的研究相对较少，并且尽管鞣花酸在体外有药理学活性，但鞣花酸对肺癌的抑制作用、抗肺癌活性及治疗效果的机制尚未明确，并且目前尚未有鞣花酸与雷公藤红素联合作用治疗肺癌的研究及应用。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鞣花酸及与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用，所述鞣花酸不仅能发挥较好的作用，并且作为一种天然多酚物质，在动物实验中几乎未产生任何副作用，血清指标和体重均属正常，在雷公藤红素与鞣花酸协同作用时，可以降低雷公藤红素的使用剂量，并且无明显副作用。

为实现上述目的，本发明提供了鞣花酸在制备抗肺癌药物中的应用。

上述鞣花酸的制备方法有很多种，比如水解单宁在碱性条件下水解，可以获得鞣花酸。五倍子中大约含有50％～70％的水解单宁，提取单宁后，选用碳酸氢钠或碳酸钠作添加剂，氧化制备鞣花酸。具体方法参照“鞣花酸的生产制备研究”(刘宇文，北京化工大学，2015028)。

上述鞣花酸在制备抗肺癌药物中的应用在另一种实施方式中，所述鞣花酸对肺癌细胞的施用浓度为10μM-100μM，优选的，所述鞣花酸对肺癌细胞的施用浓度为25μM-75μM。

上述鞣花酸在制备抗肺癌药物中的应用在另一种实施方式中，所述鞣花酸的有效剂量为40mg/kg，优选的，所述鞣花酸的有效剂量为80mg/kg。

上述鞣花酸在制备抗肺癌药物中的应用在另一种实施方式中，鞣花酸是通过给小鼠灌胃进行施用的，其中所述小鼠为5周龄BALB/c雌性裸鼠。

本发明还提供了鞣花酸与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用。

上述雷公藤红素的制备方法有很多，比如以有机溶剂为基础，进行提取，得到雷公藤红素的粗提物，再进行纯化。具体方法参照“苗药雷公藤资源调查及雷公藤红素提取工艺研究”(何蒙荟媛，贵州名族大学，20160408)。

上述鞣花酸与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用在另一种实施方式中，鞣花酸与雷公藤红素对肺癌细胞的施用摩尔浓度比为10-50:0.5-1，优选的，鞣花酸与雷公藤红素对肺癌细胞的施用摩尔浓度比为25-50:0.75-1。

上述鞣花酸与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用在另一种实施方式中，鞣花酸的有效剂量为40mg/kg，雷公藤红素的有效剂量为1mg/kg。

上述鞣花酸与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用在另一种实施方式中，雷公藤红素是通过给小鼠腹腔注射进行施用的，其中所述小鼠为5周龄BALB/c雌性裸鼠。

上述鞣花酸在制备抗肺癌药物中的应用和/或上述鞣花酸与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用在另一种实施方式中，检测指标包括心、肝、脾肺、肾的病变程度。

上述鞣花酸在制备抗肺癌药物中的应用和/或上述鞣花酸与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用在另一种实施方式中，检测指标还包括小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)以及肌酐(Cr)的含量。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明针对目前尚无将鞣花酸用于治疗肺癌的机理研究不明，以及鞣花酸与雷公藤红素协同作用治疗肺癌的相关研究现状，提供了一种鞣花酸用于治疗肺癌以及与雷公藤红素协同作用肺癌的机理分析及药物应用，从而为肺癌的治疗提供新的思路和开辟新的治疗途径；

2、本发明针对鞣花酸对肺癌的抑制作用机理，做了大量的研究工作，并且阐明了鞣花酸对肺癌细胞增殖抑制作用的机理，并在动物实验模型中进行了验证，通过实验证明，鞣花酸可以有效的抑制肺癌细胞增殖以及小鼠皮下荷瘤模型，并且鞣花酸对肺癌的增值抑制作用无明显副作用；

3、本发明确定了鞣花酸与雷公藤红素协同治疗肺癌的效果，明晰了鞣花酸与雷公藤联合作用的机理，并在动物实验模型中进行了验证，通过实验证明，鞣花酸与雷公藤红素对肺癌细胞的增殖抑制具有协同增效的作用，并且在小鼠皮下荷瘤模型中具有显著的抑制肿瘤的协同作用；

4.由于雷公藤红素单独用于治疗肺癌时，毒性较大，并且浓度较高，而与鞣花酸联合作用治疗肺癌，降低了雷公藤红素的使用剂量，并且无明显副作用，血清指标和体重均属正常；

5.本发明的鞣花酸与雷公藤红素还可以与临床药物联合，开发具有预防癌症作用的功能性果蔬制品，为多因素饮食因子预防调控癌症和加强人类健康的研究打下坚实的理论基础，具有重要的实际意义和应用价值；

6.本发明为流行病学研究及防治提供新的思路，对人类生活健康饮食和疾病防治方面具有实际指导意义。

附图说明

图1为鞣花酸对2种肺癌细胞的细胞活性抑制作用，其中图1-1和1-3示出了鞣花酸对HOP62肺癌细胞的细胞活性抑制作用，图1-2和1-4示出了鞣花酸对H1975肺癌细胞的细胞活性抑制作用；

图2为鞣花酸在动物荷瘤模型中对肺癌的治疗效果检测，其中图2-1为施用不同剂量的鞣花酸后小鼠肿瘤组织体积的拍照对比图，图2-2为施用不同剂量的鞣花酸后小鼠肿瘤组织体积的线性对比图，图2-3为施用不同剂量的鞣花酸后小鼠体重的线性对比图，图2-4为施用不同剂量的鞣花酸后对蛋白表达的检测；

图3为施用鞣花酸后检测血清中的AST，ALT和Cr水平；

图4为鞣花酸与雷公藤红素协调抑制肺癌细胞活性，其中图4-1和图4-2为单独施用不同浓度的鞣花酸、单独施用不同浓度的雷公藤红素以及联合施用不同浓度的鞣花酸与雷公藤红素抑制HOP62肺癌细胞活性的柱形对比图和对应的协同指数，图4-3和图4-4为单独施用不同浓度的鞣花酸、单独施用不同浓度的雷公藤红素以及联合施用不同浓度的鞣花酸与雷公藤红素在不同浓度下抑制H1975肺癌细胞活性的柱形对比图和对应的协同指数；

图5为鞣花酸与雷公藤红素联合在动物荷瘤模型中对肺癌的治疗效果检测，其中图5-1为施用不同剂量的鞣花酸与雷公藤红素后小鼠肿瘤组织体积的拍照对比图，图5-2为施用不同剂量的鞣花酸与雷公藤红素后小鼠肿瘤组织体积的线性对比图，图5-3为施用不同剂量的鞣花酸与雷公藤红素后小鼠体重的线性对比图；

图6为鞣花酸与雷公藤红素联合施用后检测血清中的AST，ALT，Cr水平。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

如下实施例中的鞣花酸的产品具体信息为：E2250,Sigma,St Louis,MO,USA，雷公藤红素的产品具体信息为L/N:PICL0906-2，广州牌牌生物科技有限公司。

实施例1

鞣花酸对肺癌细胞增殖抑制作用效果

采用MTT实验(又称MTT比色法)，以原代培养的人体肺癌细胞系(美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，VA，USA)为实验对象，建立体外培养人体肺癌细胞模型，胰酶消化肺癌计数后，调整细胞密度至5×10⁴细胞/mL，用96孔板铺板，每孔加入100μL细胞悬液，待细胞完全贴壁后换上含有相应鞣花酸浓度梯度(10，25，50μM)的新鲜培养基，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养48h，测前3h左右加10μL MTT试剂，用酶标仪测量570nm波长处吸光度并计算抑制率与半数抑制率，从A549，H460，LLC，H1975，HOP62五种肺癌细胞系中，筛选出了对鞣花酸最敏感的2个肺癌细胞系(HOP62，H1975)；进一步通过MTT实验，细胞增殖生长曲线实验，确定鞣花酸的最佳施用剂量，具体地，设置不同实验组，即：对照组(不施用鞣花酸)和鞣花酸施用组(鞣花酸施用剂量为10uM，25uM，50μM，75μM和100μM)，并通过不同处理时间(24，48，72h)观察HOP62及H1975肺癌细胞系的活细胞情况，检测鞣花酸对HOP62及H1975肺癌细胞系的增值抑制的影响，如附图1所示，鞣花酸对HOP62及H1975肺癌细胞系具有非常显著的抑制作用。

实施例2

鞣花酸对小鼠荷瘤模型急性毒性实验及抗肿瘤作用

本次实验采用5周龄BALB/c雌性裸鼠，HOP62细胞收取后用PBS洗三次，重悬于PBS中，调整密度为1×10⁷/mL，每只裸鼠右侧皮下接种细胞100μL。当肿瘤体积达到可以触摸大小时(约为100mm³)，小鼠被随机分成3组：空白溶剂对照组(5％氢化蓖麻油，5％乙醇，90％PBS)，共6只，鞣花酸施用组(40,80mg/kg)，每组6只，进行灌胃施用，每隔一天施用一次，连续施用22天。每隔一天用游标卡尺测量肿瘤长和宽、体重等变化。肿瘤体积计算公式：V＝1/2(长×宽²)。实验结束后将裸鼠脱颈处死，剥离肿瘤组织拍照后保存在-80℃冰箱中。肿瘤组织剪碎后用液氮研磨的方法提取总蛋白，用RIPA裂解液裂解后进行western blot检测蛋白表达。如附图2所示，鞣花酸对小鼠体重没有明显改变，鞣花酸显著抑制裸鼠皮下荷瘤模型体内肿瘤生长，并且高剂量组的效果更加显著。

检测小鼠生理行为特征以及生存状况，实验结束时采取小鼠血清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等肝功能指标，以及肌酐(Cr)肾功能指标，并解剖观察并检测心肝脾肺肾等器官是否病变。实验结束时未见小鼠死亡以及异常反应。7天后取小鼠血清，检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和肌酐(Cr)含量，如附图3所示，结果表明鞣花酸没有显著升高血清中的AST，ALT和Cr水平，说明鞣花酸对小鼠的肝脏和肾脏没有造成损伤，鞣花酸通过灌胃施用安全可行，不具有明显的体内毒性。

实施例3

鞣花酸与雷公藤红素联合作用对肺癌细胞增殖抑制作用效果

将鞣花酸选取三个低浓度：10，25和50μM，雷公藤红素选取三个低浓度：0.5，0.75和1μM，通过MTT实验，将单独施用不同浓度的鞣花酸、单独施用不同浓度的雷公藤红素以及联合施用不同浓度的鞣花酸与雷公藤红素抑制鞣花酸和雷公藤红素分别处理肺癌细胞(实施例1中所述的HOP62和H1975肺癌细胞系)，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养48h，用酶标仪测量570nm波长处吸光度并计算抑制率与半数抑制率，检测鞣花酸与雷公藤红素之间的协同作用，如附图4所示，实验结果显示：相比单独施用鞣花酸以及单独施用雷公藤红素，不同剂量的鞣花酸与雷公藤红素联合施用后更显著的抑制HOP62和H1975肺癌细胞系的增殖，通过计算协同系数发现鞣花酸与雷公藤红素联合施用具有非常显著的协同效果。

实施例4

鞣花酸与雷公藤红素协同作用对小鼠荷瘤模型急性毒性实验及抗肿瘤效果

本次实验采用5周龄BALB/c雌性裸鼠，HOP62细胞收取后用PBS洗三次，重悬于PBS中，调整密度为1×10⁷/mL，每只裸鼠右侧皮下接种细胞100μL。当肿瘤体积达到可以触摸大小时(约为100mm³)，小鼠被随机分成4组：空白溶剂对照组(5％Cremophor，5％Ethanol，90％PBS)，共6只，鞣花酸单独施用组(40mg/kg)，雷公藤红素单独施用组(1mg/kg)，鞣花酸与雷公藤红素联合施用组(40mg/kg+1mg/kg)，每组6只，鞣花酸进行灌胃施用，雷公藤红素进行腹腔注射，每隔一天施用一次，连续施用22天。每隔一天用游标卡尺测量肿瘤长和宽、体重等变化。肿瘤体积计算公式：V＝1/2(长×宽²)。实验结束后将裸鼠脱颈处死，剥离肿瘤组织拍照后保存在-80℃冰箱中。肿瘤组织剪碎后用液氮研磨的方法提取总蛋白，用RIPA裂解液裂解后进行western blot检测蛋白表达。如附图5所示，实验组对小鼠体重均没有明显改变，鞣花酸和雷公藤红素联合作用可以显著抑制裸鼠皮下荷瘤模型体内肿瘤生长，比单组施用组的效果更加显著。

检测小鼠生理行为特征以及生存状况，实验结束时采取小鼠血清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)等肝功能指标，以及肌酐(Cr)肾功能指标，并解剖观察并检测心肝脾肺肾等器官是否病变。实验结束时未见小鼠死亡以及异常反应。7天后取小鼠血清，检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天门冬氨酸转氨酶(AST)和肌酐(Cr)含量，附图6所示，结果表明鞣花酸与雷公藤红素联合作用没有显著升高血清中的AST，ALT和Cr水平，说明鞣花酸与雷公藤红素联合作用对小鼠的肝脏和肾脏没有造成损伤，不具有明显的体内毒性。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (4)

1.鞣花酸与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用，其中，所述鞣花酸与雷公藤红素对肺癌细胞的施用摩尔浓度比为25∶0.75、50∶0.75、25∶1。

2.根据权利要求1所述的鞣花酸与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于，雷公藤红素是通过给小鼠腹腔注射进行施用的。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的鞣花酸与雷公藤红素协同在制备治疗抗肺癌药物中的应用，其特征在于，检测指标包括心、肝、脾肺、肾的病变程度。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的鞣花酸与雷公藤红素协同在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于，检测指标还包括小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶以及肌酐的含量。