CN105054223B - 一种北青龙衣的采收方法及北青龙衣的加工方法 - Google Patents

Abstract

一种北青龙衣的采收方法及北青龙衣的加工方法，它涉及一种中药的采收方法及该中药的加工方法。解决目前不同批次北青龙衣质量稳定性差，萘醌类有效成分的含量差异性大，以及抗癌成分胡桃醌有毒性，仅能以鲜品入药，加工过程中易被破坏，抗癌效果差的问题。采收方法：在入伏后的第15～20天间对未成熟的青胡桃皮进行采收。加工方法：一、采收；二、低温变温干燥。本发明的加工方法能够促进毒性成分胡桃醌转化成有效成分胡桃酮，从而达到增效减毒之目的。因此，利用本发明方法加工的北青龙衣制备的抗肿瘤药物其抑制肿瘤的效果得到了大幅的提升，毒性降低，使用安全性高，保证了用药安全。

Description

一种北青龙衣的采收方法及北青龙衣的加工方法

技术领域

本发明涉及一种中药的采收方法及该中药的加工方法。

背景技术

癌症是威胁人类生命的严重疾病，抗癌药物的研究与开发一直是世界医药学界关注的热点。癌症的复发和转移是癌症患者两大主要死因，标志着治疗失败。中医药通过多途径综合治疗及调动机体整体防御体系，在癌症的治疗领域展现出越来越重要的作用。

北青龙衣又称核桃青皮，为胡桃科植物核桃揪(juglans mandshurica Maxim)的未成熟外果皮。主要分布在我国黑龙江省东部，小兴安岭、完达山、老爷岭及张广才岭等山区。作为一种民间药在我国的应用由来己久，最初记载于《开宝本草》，称之为胡桃青龙，《救急方》中称之为青胡桃皮，自《山东中草药手册》称之为“青龙衣”后，现多延用此名。其药性苦、涩，古代医家多以其清热解毒、祛风疗癣、止痛止痢功效入药，近年来因其抗肿瘤效果突出而备受国内外学者的广泛关注。青龙衣含有萘醌及其苷类、黄酮及其苷类、鞣质、二芳基庚烷类、萜类、有机酸类等化学成分，具有显著的抗肿瘤活性，对胃癌、肝癌、淋巴癌、乳腺癌、白血病的肿瘤细胞均具有较好的体内外抑瘤作用。

2001年，北青龙衣药材收载于《黑龙江省中药材标准》，2004年黑龙江省中医药科学院以其为主要原料开发了医院制剂复方青龙衣胶囊(药制字(2004)Z第0061)，并且经大量临床病例证明其抗肿瘤疗效确切。该药物具有抗肿瘤、调节免疫、止癌痛、抗转移与化药协同增效五种疗效。

研究发现不同批次北青龙衣的质量稳定性差，有效成分萘醌类物质的含量差异性大。

北青龙衣药材(鲜品)标准收载于2001年版《黑龙江省中药材标准》，但其毒性问题一直是学者关注和医生担心的，研究表明北青衣水煎液无毒，而醇提物尤其是乙酸乙酯萃取部位则表现出强烈的毒性，乙酸乙酯萃取部位主要是萘醌类成分，其中胡桃醌(5-羟基-1,4-萘醌)是其代表性化合物。胡桃醌(5-羟基-1,4-萘醌)既是抗肿瘤主要有效成分，也是毒性成分，具有一定的神经抑制毒性和刺激性。正因如此，临床患者在服用核桃青皮后往往会出现头晕，心慌，咽喉、食管、胃部烧灼感，恶心呕吐，民间亦有超剂量服用核桃青皮药酒后出现呼吸困难、休克、心律失常、昏迷，甚至死亡的病例。所以，2001版《黑龙江省中药材标准》中规定北青龙衣有小毒，仅以鲜品入药，且仅用于制剂。在制剂加工过程中萘醌类成分被破坏，虽然其毒性被降低，但抗肿瘤效果也大幅降低，严重的限制了北青龙衣的临床应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前不同批次北青龙衣质量稳定性差，有效成分萘醌类物质的含量差异性大，抗癌成分胡桃醌(5-羟基-1,4-萘醌)有毒性，仅能以鲜品入药，加工过程中抗肿瘤成分被破坏，抗癌效果差的问题，而提供的一种北青龙衣的采收方法及北青龙衣的加工方法。

本发明北青龙衣的采收方法，根据中国农历在入伏后的第15～20天间对未成熟的青胡桃皮进行采收。

本发明北青龙衣的加工方法按以下步骤进行：

一、入伏后的第15～20天间对未成熟的青胡桃皮进行采收；

二、先将青胡桃皮放入25～30℃的环境中干燥8±1h，然后放入40～45℃的环境中干燥8±1h，再放入48～52℃的环境中干燥8±1h，完成低温变温干燥；即获得加工好的北青龙衣。

本发明在入伏后的第15～20天采收的青胡桃皮具有单枚质量重，总萘醌含量高，单枚总萘醌量多的特点，而且多年统计发现，按照本发明采收获得青胡桃皮的质量稳定，有效成分北青龙衣萘醌类物质的含量差异性小。

二十四节气是中国古代订立的一种用来指导农事的历法，能够准确反映季节和气候的变化，每年相同节气的气候条件基本相同。而公历每年相同时间的气候条件则变化较大，没有规律可循。

本发明的加工方法能够促进毒性成分胡桃醌转化成有效成分胡桃酮，从而达到增效减毒之目的。因此，利用本发明方法加工的北青龙衣制备的抗肿瘤药物其抑制肿瘤的效果得到了大幅的提升，毒性降低，使用安全性高，保证了用药安全。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式根据中国农历在入伏后的第15～20天间对未成熟的青胡桃皮进行采收。

具体实施方式二：本实施方式北青龙衣的加工方法按以下步骤进行：

一、入伏后的第15～20天间对未成熟的青胡桃皮进行采收；

二、先将青胡桃皮放入25～30℃的环境中干燥8±1h，然后放入40～45℃的环境中干燥8±1h，再放入48～52℃的环境中干燥8±1h，完成低温变温干燥；即获得加工好的北青龙衣。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤二先将青胡桃皮放入28℃的环境中干燥8h，然后放入42℃的环境中干燥8h，再放入50℃的环境中干燥8h，完成低温变温干燥。其它步骤及参数与实施方式二相同。

实施例1

在入伏前15～20天、入伏当天、入伏后的第15～20天、入伏后的第30～35天、入伏后的第45～50天分别对青胡桃皮进行采收(2011年)。

在相同地区第二年相同农历时间进行采收。

在相同地区第三年相同农历时间进行采收。

采收后精密称取核桃楸外果皮剪碎，精密称定1g，加入乙酸乙酯25ml，浸泡过夜，超声提取3次，每次30分钟，过滤，合并滤液，减压回收至干，残渣加甲醇溶解，并定容至25ml棕色容量瓶中，0.45um滤膜过滤，获得供试品溶液，备用。

利用纯样品胡桃醌制备标准曲线。

精密量取供试品溶液并进行稀释，再加入1ml 5％的KOH水溶液显色，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中萘醌含量(mg/ml)，通过换算计算出北青龙衣中萘醌含量。

检测结果如表1所示。

表1

实验证明依照本发明方案在农历进行采收，在入伏后的第15～20天采收的青胡桃皮具有单枚质量重，总萘醌含量高，单枚总萘醌量多；而且每年按照本发明采收获得青胡桃皮的质量、产量稳定，有效成分北青龙衣萘醌类物质的含量差异性小，而按照公历时间进行采收则历年间差异较大。

实施例2

北青龙衣的加工方法按以下步骤进行：

一、入伏后的第15～20天间对未成熟的青胡桃皮进行采收；

二、先将青胡桃皮放入25～30℃的环境中干燥8±1h，然后放入40～45℃的环境中干燥8±1h，再放入48～52℃的环境中干燥8±1h，完成低温变温干燥；即获得加工好的北青龙衣。

对比方法1：与本实施例的方法区别在于步骤二采用自然阴干法，室温25℃通风干燥72h)，其他步骤及参数相同。

对比方法2：与本实施例的方法区别在于步骤二采用高温恒温鼓风干燥法，80℃干燥12h，其他步骤及参数相同。

分别取以上三种不同方法制备的北青龙衣饮片，加甲醇25ml，超声处理(功率300W，频率40KHz)30min，放冷，补足甲醇，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm滤膜，即得测试样品。然后进行高效液相梯度检测，检测条件如表2所示。

表2

同一方法样品分5组分别进行高效液相梯度检测，检测结果如表3所示。

表3

由表3可知，自然阴干法不能促进北青龙衣中胡桃醌的转化，胡桃醌含量较高、毒性大；低温变温鼓风干燥法能够有效促进胡桃醌转化成胡桃酮，胡桃酮含量较高，毒性小；而高温恒温鼓风干燥法导致胡桃醌、胡桃酮均被破坏，不能实现转化并导致胡桃醌、胡桃酮的流失。

胡桃醌分子式为纯样品购自北京中西科仪科技有限责任公司，生产批号：10183269；胡桃酮分子式为纯样品自制，经测定其纯度大于98％。

动物实验：

取以上三种方法加工的北青龙衣样品，分别粉碎成200目细粉，加水制成一定浓度的药物混悬液；取一定量胡桃醌、胡桃酮粉末分别置于研钵中充分研磨，再精确称取细粉适量，分别用含3‰吐温的水溶液配制成一定浓度的药液，备用。经预试0.26g/mL的药物混悬液最大可灌胃浓度。

低温变温鼓风干燥法(B法)高温恒温鼓风干燥法(C法)毒性测定：

ICR小鼠(SPF级，体重18～22g，雌雄各半)72只，随机分成6组，每组12只，以最大可灌胃浓度为最高剂量，组间剂量比值为1:0.8，浓度分别为0.73g/mL、0.58g/mL、0.46g/mL的B法样品、C法样品混悬液。小鼠禁食不禁水12h，按20mL/Kg体重灌胃给药，给药后即刻及经14天的连续观察，个别小鼠给药后30min内有倦怠不动，眯眼，活动力降低，呼吸急促，竖毛，弓背现象。给药后第2天起小鼠活动、精神状态等逐渐恢复正常，饮食、外观、行为均正常，未见异常分泌物、排泄物，无小鼠死亡。各组小鼠饮食、外观、行为均正常，未见异常分泌物、排泄物。因此，不能找出引起动物0％和100％死亡的剂量范围或100％死亡的剂量。此试验无法测出B法样品、C法样品的小鼠经口给药的LD50。

ICR小鼠(SPF级，体重18～22g，雌雄各半)60只，随机分成3组，分别为B法样品组、C法样品组、空白对照组，每组20只，试验前禁食12小时，不禁水，实验室温度22℃，湿度40％。各组小鼠分别灌胃最大可灌胃浓度的青龙衣鲜品、干品混悬液及蒸馏水，灌胃容积40ml/Kg，早晚各一次，两次间隔8h。计算可知，急性毒性试验小鼠的最大给药量相当于人临床用量的83倍，未见明显毒副反应，说明低温变温鼓风干燥法(B法)、高温恒温鼓风干燥法(C法)制备的样品用药安全。

A法样品、胡桃醌、胡桃酮的毒性测定

选取ICR小鼠(SPF级，体重18～22g，雌雄各半)330只，随机分为33组，每组10只。试验前禁食12小时，不禁水，以预试验中引起动物100％死亡的最低剂量为起始浓度，各组组间比1：0.85配制相应药液。A法样品、胡桃醌、胡桃酮各灌胃给药组分别设10个浓度梯度，灌胃容积20ml/Kg体重，空白对照组给予相同体积含3‰吐温的水溶液。经口给药后即刻观察，可见各组小鼠活泼程度随给药剂量的增加而降低，活动时不协调，蹒跚步行、眯眼，眼睛无神，困倦，不饮食、水。低剂量组小鼠给药后活动力降低，有竖毛、蜷缩、弓背现象，严重程度与给药剂量呈正比。高剂量组小鼠倦卧于饲养笼底部不动，呼吸急促，快而浅。个别小鼠给药后20min发生抽搐、痉挛，1～2min自行缓解，倦卧不动，30min开始可见尾静脉瘀血，翻正反射消失，1h开始有动物死亡，死亡速度与给药剂量呈正比。小鼠死亡均在灌胃后24h之内，死亡后立即解剖，可见胃部和食道充盈灌胃的药液，心、肝、脾、肺、肾、脑等其它脏器外观未见异常变化。经14天的连续观察，存活小鼠饮食、外观、行为第二天起均恢复正常，未见异常分泌物、排泄物，24h后未见中毒表现及动物死亡。各组动物死亡数量如表4～6所示，并计算LD50。

表4 胡桃醌半数致死量

回归方程y(Probit)＝-3.7889+6.9332Log(D)

半数致死量LD50＝18.521mg/Kg

LD50(Feiller校正)95％的可信限＝16.323--20.739mg/Kg

LD5＝10.725mg/Kg

LD95＝31.982mg/Kg

表5 胡桃酮半数致死量

回归方程y(Probit)＝-10.235+6.4096Log(D)

半数致死量LD50＝238.17mg/Kg

LD50(Feiller校正)95％的可信限＝211.72--271.26mg/Kg

LD5＝131.9mg/Kg

LD95＝430.05mg/Kg

表6 A法干品半数致死量

回归方程y(Probit)＝-4.5821+6.0936Log(D)

半数致死量LD50＝37.366g/Kg

LD50(Feiller校正)95％的可信限＝33.056--42.174g/Kg

LD5＝20.07g/Kg

LD95＝69.569g/Kg

动物实验表明胡桃醌半数致死量LD50＝18.521mg/Kg，胡桃酮LD50＝238.17mg/Kg，参照我国工业毒物急性毒性分级标准以及化合物经口急性毒性分级标准，胡桃醌属剧毒化合物，具有强烈的神经毒性，其转化产物胡桃酮毒性大大降低，属中等毒性化合物。因此，自然阴干法(A法)中胡桃醌含量较高，LD50＝37.366g/Kg，存在一定的用药风险。低温变温鼓风干燥法(B法)和高温恒温鼓风干燥法(C法)都具有用药是安全性，但是高温恒温鼓风干燥法(C法)中抗癌有效成分损失大、含量过低。

抗肿瘤实验

取对数生长期BGC823胃癌细胞及A549肺癌细胞，调整细胞悬液密度为5×10⁴个/mL。按100uL/每孔接种于96孔培养板。贴壁后，除空白组外，每孔加入不同浓度药物继续培养48h，每组6个复孔。孵育48h后，每孔加入20ul MTT，37℃孵育4h，弃去上清后，每孔加150ul DMSO，在摇床上低速振荡10min，酶标仪570nm波长测定吸光度(A)值，并计算对BGC823胃癌细胞及A549肺癌细胞的增殖抑制率，并通过Graphpad Prism计算IC50值，增殖抑制率％＝100-实验组/对照组*100。实验结果如表7～9所示。

表7 胡桃酮及胡桃醌抗肿瘤抑制率％及IC50值

表8 A法样品及B法样品体外抗肿瘤抑制率及IC50值

表9 C法样品体外抗肿瘤活性

由表7～9可知不同浓度的胡桃醌及胡桃酮作用于胃癌BGC823及肺癌A549后，细胞生长受到不同程度抑制，且抑制作用呈剂量依赖关系。胡桃酮的抑制作用略强于胡桃醌，低温变温鼓风干燥法(B法)强于自然阴干法(A法)说明该转化工艺起到了增效作用，而高温恒温鼓风干燥法(C法)萘醌类成分被严重破坏，基本不具备抗肿瘤作用。

Claims (2)

1.一种北青龙衣的加工方法，其特征在于北青龙衣的加工方法按以下步骤进行：

一、入伏后的第15～20天间对未成熟的青胡桃皮进行采收；

二、先将青胡桃皮放入25～30℃的环境中干燥8±1h，然后放入40～45℃的环境中干燥8±1h，再放入48～52℃的环境中干燥8±1h，完成低温变温干燥；即获得加工好的北青龙衣。

2.根据权利要求1所述的一种北青龙衣的加工方法，其特征在于步骤二先将青胡桃皮放入28℃的环境中干燥8h，然后放入42℃的环境中干燥8h，再放入50℃的环境中干燥8h，完成低温变温干燥。