JP7255785B2 - Trpv2アンタゴニスト - Google Patents
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Description
Q1は、O又はSであり、
-Arは、任意に置換されたアリール基であり、
-D-は、-C(O)-、-C(S)-、-CH(OH)-及び-CH(SH)-から選択され、かつ、
-R1及び-R2は、それらが結合している-N-D-と一緒になって、任意に置換されたヘテロ環式環を形成する、又は-R1及び-R2は、それぞれ独立して、水素並びに任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから選択される)並びにその塩、溶媒和物及び保護形を有することができる。
Q1は、O又はSであり、
-Arは、任意に置換されたアリール基であり、
-D-は、-C(O)-、-C(S)-、-CH(OH)-及び-CH(SH)-から選択され、かつ、
-R1及び-R2は、それらが結合している-N-D-と一緒になって、任意に置換されたヘテロ環式環を形成する、又は-R1及び-R2は、それぞれ独立して、水素並びに任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから選択される)並びにその塩、溶媒和物及び保護形を有することができる。
方法
標的予測
SPiDERによる標的予測は、以前に報告2,11,14,20されているように公的に利用可能なウェブサーバ(www.modlab-cadd.ethz.ch/software/spider)において実施した。要するに、ピペルロングミンをCOBRAデータベース31からの参照化合物と一緒に自己組織化マップに投影した。化学構造を、CATS232及びMOE2D記述子で記述する前に、Molecular Operating Environment(MOE、Chemical Computing Group社、カナダ、モントリオール)の「wash」機能で処理する。COBRAにおける参照化合物に対する分子のユークリッド距離を計算することにより、予測が行われる。出力はp<0.05の信頼水準での標的ファミリーを含む。異なる標的を結合するとアノテーションされた分子間の距離の事前に計算されたバックグラウンド分布に従って、距離をp値に変換する。これらのp値の算術平均は、標的予測のための信頼スコアとしての役割を果たす。信頼スコアのバックグラウンド分布により、各予測を、予測の統計学的有意性を示す別のp値に関連付けることができる14。
ヒト一過性受容体電位(TRP)チャネルにアノテーションされたリガンドをChEMBL2333から収集し、先に記載したようにフィルタリングした。CATS2記述子32及びECFP4様のMorganフィンガープリント(半径2、2048ビット)を、MOE2018(Chemical Computing Group社、カナダ)及びRDKitをそれぞれ用いて、全てのTRPリガンド及びピペルロングミンについて計算した。主成分分析をCATS2記述子及び拡張フィンガープリントについて個別に行った。データ分散の少なくとも80%を記述する主成分を多様体学習のために保持した。t-SNEのために、確率解析(1000回の反復及び600~1000の学習率)に先立って主成分をスケーリングした。解析はNumPy 1.13.3、Pandas 0.21.0及びScikit-learn 0.18.1のライブラリを用いてPython 2.7.13において行った。Matplotlib 1.5.3を用いてプロットを計算した。
このアッセイは、SB Discovery社(英国、グラスゴー)でフィー・フォー・サービスに基づいて実施した。ヒトTRP細胞をトリプシン処理し、計数し、そして100μLの容量において1ウェル当たり50000個の細胞の密度で黒い透明底の96ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。翌日、細胞にcalcium5色素又は膜電位色素を加えた。TRPV1-5、TRPA1、TRPM2、TRPM3及びTRPM8を、calcium5色素を用いて試験した。TRPC1、TRPC3-7、TRPM4-5を、膜電位色素を用いて試験した。両方の色素溶液は、HEPES緩衝化ハンクス平衡塩溶液(HBSS)中で作製した。色素溶液(90μL)をウェルに加えて、37℃で1時間インキュベートした。次に、試験化合物及び標準阻害剤(10μL)をウェルに加え、室温で10分間インキュベートした。次いで、プレートをflexstationに配置し、1.52秒ごとに蛍光をモニタリングした。20秒後にアゴニストを添加し、calcium5色素及び膜電位色素についてそれぞれ485nm/525nm及び530nm/565nm(Ex/Em)で蛍光を2分間モニタリングした。コントロール-TRPV1:カプサゼピン、TRPV2:トラニラスト、TRPV3:ルテニウムレッド、TRPV4:ルテニウムレッド、TRPV5:Gd3+、TRPA1:ルテニウムレッド、TRPC1:Gd3+、TRPC3:Pyr3、TRPC4:ML204、TRPC5:ML204、TRPC6:ML204、TRPC7:SKF96365、TRPM2:2-APB、TRPM3:メフェナミン酸、TRPM4:クロトリマゾール、TRPM5:TPPO、TRPM8:2-APB。コントロールデータは、全ての場合において履歴範囲内であった。
このアッセイは、SB Discovery社(英国、グラスゴー)でフィー・フォー・サービスに基づいて実施した。手動パッチクランプ法を使用して、濃度応答曲線及びウォッシュアウトアッセイを実施した。HEK-293細胞を、SB Discovery社でのhTRPV2安定細胞系統のために適合された手順に従って増殖させ調製した。細胞を約24時間血清飢餓状態にした後に、電気生理学的検査の前に血清含有培地に取り替えた。手動パッチクランプアッセイは、従来の電気生理学的ユニットを使用して室温で実施した。細胞は、細胞に血清含有培地を添加した後に2時間~3時間以内に使用した。標準細胞外溶液は、145mMのNaCl、4mMのKCl、2mMのCaCl2、1mMのMgCl2、10mMのHEPES及び10mMのグルコースを含んでいた。pHをNaOHで7.4に調整したところ、浸透圧は311mOsm/Lとして測定された。標準細胞内溶液は、50mMのKCl、10mMのNaCl、60mMのKF、2mMのMgCl2、20mMのEGTA及び10mMのHEPESを含んでいた。pHをKOHで7.2に調整したところ、浸透圧は286mOsm/Lとして測定された。コントロール溶液(細胞外溶液)及び化合物溶液の添加時の電流をモニタリングするために、標準的なランププロトコルを使用した。電圧プロトコルは、-60mVの保持電位から、5秒ごとに-100mVから+100mVまでの一連の電圧ランプからなっていた。解析のために+100mVでの記録の間の最大外向き電流値を使用した。手動パッチクランプ実験は、Axon Instruments社のAxon 200B増幅器及びDigidata 1440A取得システム(Molecular Devices社、米国)を使用して実施した。電気活動を刺激して記録するために、Axon Instruments社のソフトウェアプログラムpClamp(バージョン10)を使用した。容量的過渡現象は電子的に記録から補償されているが、直列抵抗にわたる電圧降下及び液間電位差は補償されなかった。直列抵抗は一般的に10MΩ未満であり、平均セル容量は約25pFであった。全てのグラフの分析及びプロットには、GraphPad Prism(バージョン5)ソフトウェアを使用した。アゴニスト(カンナビジオール;Abcam社の番号ab120448)を100%DMSO中の100mMストックとして調製し、試験前に生理溶液中で4μM又は10μMに希釈した。ピペルロングミンを100%DMSO中の100mMストックとして調製し、4μM又は10μMカンナビジオールも含んでいる生理溶液(100μM、50μM、10μM、1μM及び0.1μM)中で規定の濃度に希釈した。ルテニウムレッド(Sigma社、番号R2751)を10mMのストックイオン蒸留水として毎日調製し、生理溶液中で100μMに希釈した。
細胞(ATCC)を、10%FBS(Gibco社)、GlutaMax(Gibco社)、MEM及びNEAA(Gibco社)、4.5g/Lのグルコース及び0.11g/Lのピルビン酸ナトリウムを補充したDMEM(Gibco社)中で50%のコンフルエンシーまで増殖させた。細胞を、μ-ibidiの8ウェルプレートに播種し、TRPV2-RFP34(日本の群馬大学の小島至教授の厚意による寄贈)でトランスフェクションした。48時間インキュベートした後に、細胞をカルシウムイメージングにかけた。細胞内カルシウム測定は、Fura-2AM(Life Technologies社)を用いて、以前に記載された研究12からは修正して実施した。要するに、測定の1時間前に、45分間かけて5μMのFura-2-AMを細胞に負荷した。細胞培地をタイロード液(119mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのCaCl2、2mMのMgCl2、6g/Lのグルコース、25mMのHEPES(pH7.4))で置き換えた。同時にそれぞれの処理剤(最終濃度1%のDMSO(コントロール)、5μMのピペルロングミン及び10μMのトラニラスト)を細胞に加え、細胞を15分間再調節させた。4μM又は20μMのカンナビジオール(CBD)の添加によりTRPV2を活性化する前に、340nm及び380nmでの励起からのFura-2AM発光を1分間記録した。画像解析はMetaFluor Analystソフトウェアを使用して行った。統計分析はastatsa.comで行った。カルシウムイメージングの取得後に、細胞を直ちに4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した。細胞をPBSで2回洗浄し、Fluoromount G内に包埋した。試料をLSM Zeiss 880顕微鏡を用いてイメージングした。
HEK293細胞をTRPV2-RFPでトランスフェクションし、ネガティブコントロールのsiRNA(5nM)又はTRPV2のsiRNA(5nM)のいずれか一緒に同時トランスフェクションし、48時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、溶解バッファー(20mMのHEPES(pH7.4)、150mMのNaCl、1%のTriton-X100、1mMのEDTA、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社))で溶解させ、25gのニードルを備えたシリンジに10回通過させ、氷上で30分間インキュベートし、18000g及び4℃で20分間遠心分離した。上清を3容量のアセトンを用いて-20℃で一晩沈殿させた。沈殿したタンパク質ペレットを適切な容量の溶解バッファー中に再懸濁し、5×還元性SDSサンプルバッファーと混ぜて、10分間煮沸した。タンパク質をTris-グリシン緩衝化SDS PAGEを用いて分離し、PVDFメンブレンに一定の350mAで90分間転写した。メンブレンを0.1%のTween20を含むTris緩衝生理食塩水中の10%粉乳により1時間ブロッキングし、TRPV2に対する抗体(Atlas antibodies社)及びチューブリンに対する抗体(Thermofisher社)を用いて免疫検出を行った。
動的光散乱(Zetasizer Nano S、Malvern社、英国)を使用して、化合物のコロイド凝集を測定した。粒子サイズは25℃で測定した。水溶性は、他の文献の記述に従い60分以内での連続的測定で測定した35。ピペルロングミンの100mMのストック溶液をDMSO中で調製し、引き続き脱イオン水で希釈した後に100μM(0.1%のDMSO)の分析物溶液を得た。コロイド凝集を、連続希釈を通じて測定した。
ピペルロングミンをNCI-60 Human Tumor Cell Lines Screenにかけることで、その活性を5つの濃度レベル(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM及び100μM)で、59種のNCI-60細胞系統において4つの用量応答パラメーター(GI50、IC50、LC50及びTGI)で測定した。NCI-60細胞系統におけるTRPV2の正規化された遺伝子発現(5つのマイクロアレイプラットフォームから組み合わせたプローブ強度の平均値)を、CellMinerデータベース36,37からダウンロードした。スピアマンの相関を使用して、57種の癌細胞系統に対するTRPV2の発現レベルとピペルロングミンのIC50値との間の相互依存性を検定した。
Cancer Therapeutics Response Portal(CTRP)v2から775種のヒト癌細胞系統についてのTRPV2ロバストマルチアレイ平均法(RMA)で正規化された発現及びピペルロングミン感受性データを取得した23。用量応答曲線下面積(AUC)を、16点の濃度範囲にわたって測定されたピペルロングミンに対する細胞系統の感受性の尺度として使用した。AUC値が低いほど、より高い薬物活性を意味する。スピアマンの相関を使用して、TRPV2の発現レベルとピペルロングミンのAUCとの間の相互依存性を検定した。
正規化されたTRPV2遺伝子発現(RNA-seqを通じて期待値最大化-RSEMによって定量化される)38及びThe Cancer Genome Atlas(TCGA)からの30のコホートに属する9785個の腫瘍サンプルについての臨床データをFirebrowseからダウンロードした。TRPV2の中央値発現を使用して患者を2つのサブグループに分割することで、Rパッケージのsurvival39によって、癌のタイプごとにカプラン・マイヤープロット及びログランク検定を用いて予後の有意性を推定した。
TCGAからの脳腫瘍(507個の低悪性度神経膠腫(LGG)試料及び153個の多形膠芽細胞腫(GBM)試料)とGenotype-Tissue Expression(GTEx)プロジェクトからの正常脳組織(1141個の試料)との間でのTRPV2遺伝子発現の比較を、Toil40により計算されたTPM(百万当たりの転写物)値を用いて行った。
TIMER(Tumor IMmune Estimation Resource)41を使用して、LGG試料及びGBM試料にわたるTRPV2遺伝子発現(RSEMのlog2)と腫瘍純度との間の相関解析を行った。
4個のヒトGBM試料から得られた3589個の単一細胞における正規化されたTRPV2遺伝子発現(百万当たりのカウントのlog2)を公開データベース26から取得した。成人のヒト脳の健康組織から種々の純化された細胞型における正規化されたTRPV2発現(Fragments Per Kilobase Million-FPKM)を、(Gene Expression OmnibusデータセットアクセッションGSE73721)42から取得した。
5000個の細胞/ウェルを、2%FBSを含むDMEMを有する96ウェルプレートに播種した。翌日、ピペルロングミンを様々な濃度で添加した。各ウェルにおける総DMSO濃度は1%を超過しなかった。24時間、48時間及び72時間に培地を除去し、CellTiter-Blue(Promega社、培地中1:20)と置き換えた。プレートを90分間インキュベートした後に、蛍光強度を測定した。
パラフィンで包埋された試料を切片化し、抗原賦活化を行った(Dako PT link、pH6、95℃、20分)。MeOH中の3%H2O2で30分間ブロッキングした後に、切片を抗TRPV2(Atlas antibodies社のHPA044993、1:300)と一緒に室温で1時間インキュベートし、引き続きHRPコンジュゲート型二次抗体(Dako envision anti-rabbit ready to use)と一緒に室温で30分間インキュベートした。切片をDABクロモゲン(3,3’-ジアミノベンジジン、Dako社)で現像し、ハリスヘマトキシリンで対比染色した。スライドガラスをNanoZoomer SQ(浜松ホトニクス株式会社)を用いてデジタル化した。
75000個のHEK293細胞を24ウェルプレートの各ウェルに播種した。翌日、細胞をhTRPV2-RFPプラスミド(日本の群馬大学の小島至教授の厚意による寄贈)でトランスフェクションした。24時間インキュベートした後に培地を交換し、5μM及び10μMでPLを添加した。24時間後に、細胞生存率をCellTitre-Blue(Promega社)又はAnnexin V、7-AAD染色を用いて評価した。トランスフェクション効率はフローサイトメトリーを用いて評価した。
細胞を採取し、-20℃、10分間メタノールで固定してから、PBS(0.05%のTween 20)で洗浄した。試料を、抗TRPV2(Atlas Antibodies社、PBS中1:100)と一緒に20分間インキュベートした後に、ヤギ抗ウサギAlexa 488(Abcam社、ab150077、PBS中1:500)二次抗体と一緒にインキュベートした。解析のためにFACS Divaソフトウェアを搭載したBD LSRFortessa X-20を使用した。
培地(HEK293)又はTrypLE express(Gibco社)で洗浄することにより、プレートから細胞を採取した。遠心分離後に培地を除去し、細胞を結合バッファーで2回洗浄してから、Annexin V-APC(eBiosciences社、1:100)及び7-AAD(Pharmigen社、1:50)と一緒に室温で30分間インキュベートした。試料を結合バッファーで希釈し、FACS Divaソフトウェアを搭載したBD LSRFortessa X-20を用いてフローサイトメトリーにより分析した。単一の染色による試料をコントロールとして使用した。
エタノール中のピペルロングミン(abcr GmbH社)を、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(Carbosynth Ltd社)と一緒に水中で1:2の比率でインキュベートし、室温で1時間撹拌した。次いで、溶液を蒸発乾固させた。
ヒドロゲル足場は、以前に記載27~30されたように開発した。要するに、当量の12.5%の固形分のデンドリマーアミン及び固形分5%のデキストランアルデヒドを混合して、予備硬化されたディスクを形成させた。ドープされた足場のために、ヒドロゲル形成の前に、β-シクロデキストリンで予め封入された50mg/kgのピペルロングミンをデキストラン溶液に添加した。予備硬化されたディスクを形成させて、GBM腫瘍を有するマウスの右大脳半球に頭蓋内に埋没させた又はin vitroアッセイのために使用した。
ヒドロゲル足場単独又はβ-デキストリンで予め封入されたピペルロングミンでドープされたヒドロゲル足場の予備硬化されたディスクを、PBS中、37℃でインキュベートした。種々の時点でPBSから試料を収集し、放出されたピペルロングミンを液体クロマトグラフィー-質量分析法を使用して、ピペルロングミンに対応するピーク下面積を積分することにより定量化した。データを、各時間点について、ヒドロゲル中に封入された総ピペルロングミンのパーセンテージとしてプロットした。
24ウェルプレートに、1ウェル当たり50000個のU251細胞を播種した。24時間後に、ヒドロゲル足場単独又はβ-デキストリンで予め封入されたピペルロングミンでドープされたヒドロゲル足場の予備硬化されたディスクを含むtranswellパーミアブルサポート挿入物(6.5mm挿入物、8.0μmのPETメンブレン、Costar)をウェルに加えた。24時間後、48時間後及び72時間後に、CellTiter-Blue試薬(Promega社、培地中1:20)を使用して細胞生存率を測定した。
50000個の細胞/ウェルを、6ウェルプレートに播種した。翌日、3mLのレンチウイルス-GFP-ルシフェラーゼ(Carlos Custodiaにより2016年11月に製造された)及び4μLのポリブレンをウェルに加えた。ウイルスを含む培地を48時間後に除去し、10%FBSを含む新鮮なDMEMで置き換えた。細胞を増殖させ、FACSを使用してソーティングした。コンフルエントな細胞のバイアルを、in vivo実験に必要とされるまで凍結させた。
全てのマウスの研究は倫理委員会により承認され、実験はその規定及び方針に従って行った。神経膠芽細胞腫の異種移植片を、8週齢の雄の胸腺欠損ヌードマウス(Charles River Laboratories社)において樹立させた。マウスをイソフルランで麻酔し、定位フレームに固定したら、右大脳の上のブレグマの2.5mm側方及び1.5mm後方に直径2.7mmの穿頭孔を空けた。3μL容量のPBS中の250000個の神経膠芽細胞腫細胞(U251-GFP-luc)を、鈍端のニードル及びハミルトン注射器を使用して2.5mmの深さ(ニードルを3mm下げた後に、0.5mm後退させて細胞のためのポケットを作製した)で脳内に注射した。細胞の還流を最小限にするために、ニードルを5分間そのままにした。ニードルを取り出したら、切開部を縫合し、動物を回復させた。腫瘍導入の8日後に、マウスをIVIS Luminaシステムを使用してイメージングした。マウスをそれらの生物発光シグナルに応じてランク付けし、2つの等しい群に分けた。腫瘍導入の9日後にマウスをメデトミジン及びケタミンの腹腔内注射により麻酔し、縫合を再び開いた。頭蓋骨内に孔を配置して、表面の組織を破壊した後にヒドロゲル(コントロール群のためのヒドロゲル足場単独又はβ-シクロデキストリンで予め封入されたピペルロングミン(50mg/kg)でドープされたヒドロゲル足場の予備硬化されたディスク)を適用することで、該ヒドロゲルが脳組織と接触することを確実にした。皮膚を再縫合し、アチパメゾールで麻酔を拮抗した。マウスの体重評価を介したin vivoでの毒性の評価を、実験の間に全ての動物群に対して行った。ヒドロゲル埋没の3週間後に、腫瘍サイズが人道的エンドポイントを超えないようにマウスを屠殺した。脳及び脊髄を含む器官を組織学的評価のために採取した。腫瘍の組織切片(n=5)をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、免疫組織化学分析のために、腫瘍(n=5)を抗TRPV2抗体(Atlas antibodies社、HPA044993、希釈1:200)及び抗Ki67抗体(Abcam社 ab15580、希釈1:200)で染色した。生存曲線は、腫瘍導入の8日後にIVIS luminaによって測定された当初の腫瘍サイズの554%増加のカットオフ値に基づいてプロットした。この値は以前の実験と同様に設定され、腫瘍は頭蓋骨が歪むほどの体積まで増殖し得た。これは、頭部の組織学的セクションが分析された後にのみ認識することができ、エンドポイントが人道的かつ臨床的に適切であることを確実にするために値を設定することに決めた。
腫瘍の進行を非侵襲的に縦断的にモニタリングした後に、IVIS Lumina-生物発光及び蛍光イメージングシステム(Xenogen IVIS Lumina、Perkin Elmer社)でマウスをスキャンした。イメージングの15分前に、PBS(Lonza社)中の150μLのD-ルシフェリン(30mg/mL、Perkin Elmer社)をマウスに皮下注射した。動物全体のイメージングは、示された時点(ヒドロゲルのディスクの頭蓋内埋没の-1日後、3日後、6日後、10日後、13日後、18日後及び21日後)に実施した。
トータルRNAを、TRIzol(商標)試薬を使用して製造業者のプロトコル(Sigma社、ドイツ、ダルムシュタット)に従って単離した。500ngのRNAを、Superscript III(Promega社、ドイツ、マンハイム)を用いてcDNAに変換し、定量的PCRの鋳型として25ngのcDNAを、GoTaq qPCR Master Mix(Promega社、ドイツ、マンハイム)とともに使用した。StepOneplus検出システム(Applied Biosystems社、米国、フォスターシティー)を使用して、TRPV2について定量的PCRを実施した。サーマルサイクラーの条件は、95℃で20分間、次に95℃で3分間の40サイクル、その後に60℃で30秒間であった。mRNAの発現を2-ΔCT法を使用して計算し、内部コントロールPGK1に対して正規化した。
他の文献の記述に従い、凍結組織切片からタンパク質を抽出した(Poschmann et al.[1])。要するに、尿素バッファー中でTissueLyser(Qiagen社、ドイツ、ヒルデン)を用いて細胞を均質化し、引き続き超音波処理を行った。14000×g及び4℃で15分間遠心分離した後に、上清を回収し、含まれるタンパク質を-20℃で1:4(容量/容量)の比率でアセトンを用いて一晩沈殿させた。タンパク質濃度をPierce 660nm Protein Assay(Fischer Scientific社、ドイツ、シュベルテ)により測定し、試料当たり10μgのタンパク質を4%~12%のBis-Trisポリアクリルアミドゲル(Novex NuPAGE、Thermo Scientific社、ドイツ、ダルムシュタット)において50Vで10分間の電気泳動により脱塩した。銀染色後に、タンパク質バンドを切り出し、還元させ、アルキル化し、そしてトリプシンで消化した後に、超音波処理を介してペプチド抽出を行った。ペプチドを16μLの0.1%TFA(容量/容量)中に溶解し、o-フタルジアルデヒドアッセイを適用してペプチド濃度を測定した。
質量分光分析のために、試料当たり15μLのペプチド溶液をナノ高性能液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化質量分析計で分析した。分析システムは、ナノエレクトロスプレーイオン源(Thermo Fischer Scientific社、ドイツ、ブレーメン)を介してQExactive plus質量分析計に接続されたRSLCnano U3000 HPLCから構成されていた。注入されたペプチドを、トラッピングカラム(Acclaim PepMao C18、2cm×100μm×3μmの粒子サイズ、100Åの細孔サイズ、Thermo Fischer Scientific社、ドイツ、ブレーメン)で0.1%のTFA(容量/容量)を用いて6μL/分の流速で10分間濃縮及び脱塩した。引き続き、ペプチドを分析カラム(Acclaim PepMap RSLC C18、25cm×75μm×2μmの粒子サイズ、100Åの細孔サイズ、Thermo Fischer Scientific社、ドイツ、ブレーメン)で300nL/分の一定の流速で120分間の勾配にわたり60℃で分離した。4%→40%の溶剤Bの勾配(溶剤A:水中で0.1%(容量/容量)のギ酸、溶剤B:水中で0.1%(容量/容量)のギ酸、84%(容量/容量)のアセトニトリル)を通じて分離が達成された。その後に、ペプチドを1400Vの電圧でイオン化し、ポジティブモードで動作する質量分析計に導入した。MSスキャンを70000の解像度、350m/z~2000m/zの範囲内でプロファイルモードにて記録し、一方でタンデム質量スペクトルを17500の解像度で記録した。タンデム質量スペクトルを、データ依存型Top10法及び30%の正規化された衝突エネルギーで記録した。動的排除をリピートカウント1で100msにわたりアクティブにした。
Proteome Discoverer(バージョン2.1.0.81、Thermo Fischer Scientific社、ドイツ、ブレーメン)を、ペプチド/タンパク質同定のために、UniProtデータベース(ヒト、アイソフォームを含む、日付2018年5月1日)を使用してサーチエンジンとしてMascot(バージョン2.4.1、Matrix Science、英国、ロンドン)を用いて適用した。ペプチドレベルで1%(p≦0.01)の偽発見率を同定閾値として設定した。Progenesis QI for Proteomics(バージョン2.0、Nonlinear Dynamics社、Waters Corporation社、英国、ニューカッスル・アポン・タイン)を用いてタンパク質を定量化した。
遺伝子セットは、GO、Reactome、KEGG(2016年3月24日)を含む幾つかのデータベースからの精選された経路から構成され、Cytoscape(www.cytoscape.org、p≦0.001、q≦0.05、類似度のカットオフ0.5)を使用して視覚化した。質量分析データを原発性と再発性とのペアにおいて分析し、T値を使用してランク付け分析を実施した。インジェヌイティー・パスウェイ・アナリシス(Ingenuity Pathway Analysis)(IPA)は、対応ありのT検定からの有意な遺伝子を使用した(p≦0.05及び倍率変化±2)。IPAの有意性はp≦0.05に基づいて決定した。ヒートマップ及び階層的クラスタリングを、標準偏差1で平均発現を0に正規化してPartek Genomic Suite(Partek Incorporated社、米国、ミズーリ州)においてピアソンの非類似度アルゴリズム及び平均連結法を使用して実施した。
ピペルロングミン(PL)の抗増殖効果に対するhTRPV2の役割を実証するために、PLによって誘発される細胞増殖抑制効果とhTRPV2のmRNA発現との間の相関を求めた。そのために、癌細胞系統のNCI-60パネルに対してPLをスクリーニングし、公的に利用可能なCTRPデータを分析した23。喜ばしいことに、hTRPV2を発現する細胞系統は、両方の薬物スクリーニングにおいてPLに対して非常に感受性が高く、これは、癌における薬物標的としてのhTRPV2の重要性を示唆している(NCI-60パネル及びCTRPパネルのそれぞれについて、スピアマンの相関係数、ρ=0.29及び0.24、p=0.03及び1.5×10-11、図4d)。
in silicoでhTRPV2発現とGBMグレードとの間の相関が特定されたので、hTRPV2が関与するシグナル伝達経路を悪化させることを目的として、TRPV2+神経膠腫U251細胞にhTRPV2の一過性の過剰発現をもたらした。CellTiter Blue、Annexin V及び7-AAD染色で評価した場合に、トランスフェクションされた細胞を5μMのPLで処理することで、トランスフェクションされていないコントロールと比較して生存率の減少が示された(p=0.0002、n=9、マン・ホイットニー検定)(図8の右パネル)。このデータは、本発明者らの分析を完全に裏付けており、hTRPV2がPLの細胞標的であるだけでなく、リガンド-標的の結合により細胞死がもたらされることも確認している。重要なことに、U251細胞は、用量依存的かつ時間依存的にPLに感受性であり、それには、hTRPV2の調節を考慮に入れることができる。TRPV2で一過性トランスフェクションされたHEK細胞でも同じ結果を得ることができた。
次に、本発明者らは、GBMの異種移植マウスモデルにおいてPLの治療効果を調査した。PLを1:2の比率でシクロデキストリン中に封入したところ、その水溶性が劇的に改善した。さらに、治療効果を高めるために、本発明者らは、術後の投与に適した療法を編み出した。この目的のために、本発明者らは、β-シクロデキストリンに封入されたPLでドープされた埋没可能なヒドロゲルを考案した。この新しい材料を脳への局所的で持続的なPL送達のために使用することで、腫瘍部位でPLの濃度が高いこと、並びに健康な組織及び器官への漏洩が最小限に抑えられることが達成された。腫瘍組織へのPL放出を可能にし、隣接部位への物質移動及び放出を避けるために、以前に報告27~30されているように、組織のアミンと相互作用して接着結合を形成するアルデヒド基でヒドロゲルを修飾した。生理学的条件下(PBS、pH7.4、37℃)でのPL放出率に関する本発明者らのヒドロゲル材料のプロファイリングにより、最初の4時間での有意な排出放出に続いて、少なくとも192時間にわたり少量のPL(全体の3%)の安定した放出が示された。このデータにより、PLでドープされたヒドロゲルが、U251細胞と一緒にちょうど24時間インキュベートした後にほぼ完全な細胞死を誘発することができたというin vitro毒性実験に対する根拠が得られる。空のヒドロゲルは細胞生存率に対して一切影響を与えなかった。
TRPV2はより悪性の表現型に関連付けられているため、GBMの原発性と再発性とのペアをTRPV2について試験することに決めた。11個の原発性と再発性とのペアの試料を、ナノ高性能液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化質量分析計で分析した。TRPV2の調節は、原発性試料と再発性試料との間で相違がなかった。実際に、質量分析ではペプチドは検出されなかった。アーカイブされたデータを見ると、TRPV2が3299の保管されたヒトの研究のうち88でのみ検出されることが分かるが、GAPDHは336回見ることができる。TRPV2は6つの膜貫通ドメインを有し、それらは疎水性が高いため、疎水性の特異的溶解バッファーを使用した研究でのみTRPV2を検出することができる。したがって、mRNAレベルを試験するためにqRT-PCRを実施したところ、実際、TRPV2は再発性集団でより高度に発現している(図12)。シグナルの正規化後に、欠損値のあるタンパク質を除いて、対応ありのT検定を実施した。ランク付けされたT値は、プレランク付けされた遺伝子セット濃縮分析(GSEA)を使用して分析したが、有意なタンパク質(p≦0.05及び倍率変化±1.5)は、インジェヌイティー・パスウェイ・アナリシス(IPA)を使用して処理した。原発性試料において、遺伝子及びmRNAの調節並びに接着及びタンパク質局在化に関する期間を観察した。両方ともカルシウム輸送に関与する酸化的リン酸化及び神経伝達物質シグナル伝達は、再発性試料において上方調節されたことから、TRPV2が再発性試料でより活性であることが示唆される。上位ランクの遺伝子セットである特徴的酸化的リン酸化のヒートマップが表示されており、こうして発現が実際に、但し個々の試料レベルで増加することが示される。次に、IPAの結果を確認することで、同様の調節されるカノニカル経路が観察された(図13)。表2に見られるように、ミトコンドリア機能障害及び酸化的リン酸化がトップヒットである。次いで、上流分析を行い、ミトコンドリア機能障害に関与する上位4つの候補を選択した。RICTORが原発性試料において活性であることが観察され、それにより、酸化的リン酸化に関与する遺伝子の抑制が引き起こされることが考えられる。しかしながら、タンパク質の約3分の1は下方調節されていないことから、RICTORがミトコンドリア機能障害の上流レギュレーターではあり得ないことが示唆される。代わりに、本発明者らの結果は、ミトコンドリア生合成に関与するPPARGC1A(図14及び図15のヒートマップに示される)が、再発性腫瘍におけるミトコンドリアの機能障害及び酸化的リン酸化の増加の原因となる潜在的な上流レギュレーターであることを示している。
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Claims (18)
- 一過性受容体電位バニロイド2チャネル(TRPV2)発現を特徴とする神経膠芽細胞腫を治療するための組成物であって、ヒドロゲル中に封入されているピペルロングミン化合物を含み、
該組成物は、それを必要とする患者に手術後の埋没物として投与され、
前記ピペルロングミン化合物は、TRPV2の可逆的アンタゴニストであり、式1:
Q1は、O又はSであり、
-Arは、任意に置換されたフェニル基であり、
-D-は、-C(O)-、-C(S)-、-CH(OH)-及び-CH(SH)-から選択され、かつ、
-R1及び-R2は、それらが結合している-N-D-と一緒になって、任意に置換されたヘテロ環式環を形成する、又は-R1及び-R2は、それぞれ独立して、水素並びに任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから選択される)を有するか、或いはその塩、又は溶媒和物である、
組成物。 - Q1はOである、請求項1に記載の組成物。
- -D-は、-C(O)-又は-C(S)-、例えば-C(O)-である、請求項1又は2に記載の組成物。
- -R1及び-R2は、それらが結合している-N-D-と一緒になって、任意に置換されたヘテロ環式環、例えばヘテロ環式環を形成する、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ヘテロ環式環は、部分的に不飽和である、請求項4に記載の組成物。
- -D-は、-C(O)-又は-C(S)-であり、前記不飽和は-C(O)-又は-C(S)-と共役している、請求項5に記載の組成物。
- 前記ヘテロ環式環は、単環、例えば4員環~9員環、例えば4員環~6員環、例えば5員環又は6員環、例えば6員環である、請求項4~6のいずれか一項に記載の組成物。
- -R1及び-R2は、それらが結合している-N-D-と一緒になって、α,β-不飽和δ-ラクタムを形成し、例えば-R1及び-R2は、それらが結合している-N-D-と一緒になって、5,6-ジヒドロピリジン-2-オン-1-イルである、請求項4~7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ピペルロングミン化合物は、ピペルロングミンである、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記患者は、TRPV2発現を特徴とする神経膠芽細胞腫を有する又はそのリスクがあると以前に特定されている、請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記神経膠芽細胞腫は、原発性又は再発性である、請求項1~10のいずれかに記載の組成物。
- 前記ピペルロングミン化合物は、第2の治療剤と組み合わせて投与される、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の治療剤は、抗癌化合物である、請求項12に記載の組成物。
- 前記抗癌化合物は、アントラサイクリン、シタラビン、ビンクリスチン、L-アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、フィブロムン、ダカルバジン、メトトレキサート及び6-メルカプトプリン、クロラムブシル、アルキル化剤、シクロホスファミド、コルチコステロイド類、イマチニブ、クラドリビン、ペントスタチン、リツキシマブ、クロラムブシル、タキサン及びドキソルビシンから選択される、請求項13に記載の組成物。
- 前記ピペルロングミン化合物は、放射線照射と組み合わせて投与される、請求項1~14のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ヒドロゲルはシクロデキストリンである、請求項1~15のいずれかに記載の組成物。
- 請求項1~16のいずれか一項に記載の組成物の製造における前記ピペルロングミン化合物の使用。
- ピペルロングミン化合物での治療のための癌患者を選択するための方法であって、
癌患者から取得した神経膠芽細胞腫細胞中のTRPV2発現の存在を測定することを含み、
TRPV2を発現する癌細胞を有する神経膠芽細胞腫患者が、前記ピペルロングミン化合物での治療に適しており、
前記ピペルロングミン化合物は、TRPV2の可逆的アンタゴニストであり、式1:
Q 1 は、O又はSであり、
-Arは、任意に置換されたフェニル基であり、
-D-は、-C(O)-、-C(S)-、-CH(OH)-及び-CH(SH)-から選択され、かつ、
-R 1 及び-R 2 は、それらが結合している-N-D-と一緒になって、任意に置換されたヘテロ環式環を形成する、又は-R 1 及び-R 2 は、それぞれ独立して、水素並びに任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールから選択される)を有するか、或いはその塩、又は溶媒和物である、
方法。
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