DE69534671T2

DE69534671T2 - Verkalkungswiderstandsfähiges bioprothetisches gewebe und herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE69534671T2
Application number: DE69534671T
Authority: DE
Inventors: J. Robert LEVY; Eyal Lerner
Original assignee: University of Michigan Ann Arbor
Current assignee: University of Michigan Ann Arbor
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-10-20
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2015-10-21
Also published as: CN1200655C; AU713605B2; IL115708A0; EP0786970B1; EP0786970A1; EP0786970A4; NZ296283A; US5674298A; JPH10507673A; WO1996013227A1; IL115708A; CA2202247A1; NO971744L; NO971744D0; ATE311832T1; BR9509473A; ZA958900B; AU4003795A; DE69534671D1; CN1162252A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Materialien, welche gegenüber eine in vivo Verkalkung resistent sind, und besonders bevorzugt auf Verfahren zur Herstellung verkalkungsresistenter Biomaterialien, welche für die Implantation in ein Lebewesen geeignet sind, indem Epoxid vernetzende Mittel verwendet werden.
Mehr als 100.000 Herzklappenprothesen werden jedes Jahr in Patienten platziert. Häufig ist die Klappenaustausch-Chirurgie das einzige Mittel, um eine Herzklappenerkrankung zu behandeln. Gegenwärtig verwendete Austauschklappen umfassen mechanische Klappen, welche gänzlich aus einem synthetischen Polymermaterial zusammengesetzt sind, wie z. B. Polyurethan; bioprothetische Klappen, erlangt aus Rinder-Perikard oder Schweine-Aortenklappen; und Aorten Allotransplantaten.
Die Verwendung von mechanischen Klappen ist häufig aufgrund von Thrombose und Gewebeüberwucherung schwierig, welche zu Klappenfehlfunktionen führen. Bioprothetische Herzklappen haben im Vergleich zu mechanischen Klappenprothesen eine verbesserte Thrombogenität und hämodynamische Vorteile. Jedoch ist die Verkalkung die meist häufigste Ursache von dem klinischen Versagen von bioprothetischen Herzklappen, welche aus Schweine-Aortenklappen oder Rinder-Perikard hergestellt sind. Auch bei humanen Aorten Allotransplantaten wurde beobachtet, dass sie einer pathologischen Verkalkung unterliegen, die sowohl das Klappengewebe als auch die benachbarten Aortenwände betreffen, obwohl zu einem geringeren Anteil als die bioprothetischen Herzklappen. Die pathologische Verkalkung, welche zu Klappenversagen führt, solche wie in der Art von Stenose und/oder Regurgitation, erfordert eine Re-Implantation. Daher wurde die Verwendung von bioprothetischen Herzklappen und Allotransplantaten beschränkt, weil solche Gewebe der Verkalkung unterliegen. In der Tat wurde gefunden, dass pädiatrische Patienten eine beschleunigte Rate von Verkalkung haben, so dass die Verwendung von bioprothetischen Herzklappen für diese Gruppe kontraindiziert ist.
Ferner erschwert die pathologische Verkalkung unglückerweise die Verwendung von synthetischen vaskulären Transplantaten und anderen künstlichen Herzeinheiten, wie z. B. ventrikuläre Hilfssysteme, weil sie die Flexibilität von den synthetischen Polymeren, welche verwendet wurden, um die Einheiten herzustellen, beeinflussen.
Der Mechanismus der pathologischen Verkalkung von kardiovaskulärem Gewebe ist nicht vollständig verstanden. Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff "pathologische Verkalkung" auf die unerwünschte Ablagerung von Kalziumphosphat Mineralsalz. Die Verkalkung kann auf Wirtseinflüsse, Implantateinflüsse und äußeren Einflüssen, wie z. B. mechanischer Stress, zurückzuführen sein. Es gibt einige Hinweise, die nahe legen, dass die Ablagerungen von Kalzium zu devitalisierten Zellen in Beziehung stehen, und insbesondere Zellmembranen, wo die Kalziumpumpe (Ca⁺²-Mg⁺²-ATPase), welche für die Aufrechterhaltung geringer intrazellularer Kalziummengen verantwortlich ist, nicht länger funktionsfähig ist oder gestört ist. Es wurde beobachtet, dass die Verkalkung mit einer Akkumulation von Kalzium und Phosphor, welches als Hydoxylapatit vorliegt, beginnt,. welche sich zu Knötchen entwickelt, welche möglicherweise zu Klappendefekten führen können.
Die Herstellung von bioprothetischem Gewebe umfasst vor der Implantation üblicherweise eine Behandlung, um es gegen einen späteren enzymatischen in vivo Abbau zu stabilisieren, üblicherweise durch vernetzende Moleküle, insbesondere Collagen, auf und in dem Gewerbe. Für diesen Zweck wurden verschiedene Aldehyde verwendet, einschließlich Glyoxal, Formaldehyd und Glutaraldehyd. Dennoch ist Glutaraldehyd der Wirkstoff der Wahl. Zusätzlich zu der Fixierung des Gewebes ist Glutaraldehyd ein gutes sterilisierendes Mittel und vermindert die Antigenität des Gewebes. Bis heute ist Glutaraldehyd für die Vorbereitung von Geweben für die Implantation der einzige wirksame vernetzende Wirkstoff, welcher bei einem physiologischen pH-Wert unter wässrigen Bedingungen verwendet werden kann. Leider ist Glutaraldehyd dafür bekannt, die Verkalkung zu fördern. Deshalb besteht auf dem Fachgebiet das Bedürfnis nach einem Mittel, welches bioprothetisches Gewebe vernetzt, ohne die Verkalkung zu fördern.
Nicht-Aldehyd vernetzende Mittel sind untersucht worden, wie z. B. Polyepoxide (z. B. Polyglycerol Polyglycidylether, welches unter der Marke Denacol durch Nagasi Chemicals, Osaka, Japan, verkauft wurde), aber es gibt keine schlüssigen Studien, welche die Wirksamkeit von Polyepoxid-vernetzten Geweben in vivo zeigen.
Untersuchungen hinsichtlich der Inhibition der Verkalkung von bioprothetischem Gewebe sind in erster Linie auf die Gewebevorbehandlung mit entweder Detergentien oder Diphosphonat Anti-Verkalkungsmittel konzentriert. Es wurde für die Detergentien Vorbehandlung mit nicht-kovalent gebundenen Detergentien, wie z. B. Natrium Dodecyl Sulfat (SDS), und kovalent gebundenen Detergentien, wie z. B. Amino Ölsäure gezeigt, wirksam in Materialien zu sein, die zirkulierendem Blut ausgesetzt sind. Allerdings neigen sowohl Detergentien als auch Diphosphonate dazu, mit der Zeit aus dem implantierten bioprothetischen Gewebe aufgrund von Wechselbeziehungen mit Blutstoffen auszuwaschen. Auf diese Weise verzögern diese Behandlungen lediglich den Beginn des unvermeidlichen Verkalkungsprozesses. Folglich besteht auch ein Bedürfnis nach einem Mittel, welches eine langfristige Verkalkungsresistenz von bioprothetischen Herzklappen und anderen implantierbaren Biomaterialien oder Mittel bereitstellt, welche der pathologischen in vivo Verkalkung unterworfen sind. Des Weiteren wirken Detegentien unvorteilhaft auf das Gewebe ein, was in einer Abnahme der Kollagen-Denaturierungs-Temperatur oder Schrumpftemperatur (T) resultiert, welche ein wichtiges Maß für die Materialfestigkeit, Dauer und Integrität ist. In einigen Fällen resultiert die Verwendung von Detergentien in lokaler Toxizität. Daher besteht ein Bedürfnis nach einem weitgehend effektiven Verfahren für die Verleihung von Anti-Verkalkungseigenschaften an bioprothetischen Geweben, welche nicht von den schädlichen Effekten der Detergentien begleitet werden.
Sämtliche der vorangehenden Techniken resultieren dennoch in ein Ausmaß einer pathologischen Verkalkung in vivo, wie durch den Kalziumgehalt von explantierten Proben gemessen wurde. Daher besteht ein Bedürfnis für eine Behandlung, welche in einem größeren Ausmaß der Inhibition der Verkalkung resultiert.
Die systemische Verwendung von Antiverkalkungsmitteln, wie z. B. Diphosphonaten, hat signifikante Nebenwirkungen auf die Knochen und dem Gesamtwachstum zur Folge. Daher besteht ein Bedürfnis für eine lokalspezifische Therapie für die Prävention der pathologischen Verkalkung, welche geringe, örtlich begrenzte Arzneimengen und minimale Nebeneffekte ermöglicht.
Die US-Schrift US 5080670 von Ima Mura und anderen offenbart die Verwendung von Polyepoxid-Verbindungen als hydrophil vernetzende Mittel für bioprothetische Gewebe, um die Verkalkung davon zu inhibieren oder vorzubeugen. Im speziellen lehrt dieses Dokument die Verwendung von Polyepoxid-Verbindungen, wie z. B. "Polyglycidylether von Polyglycerolen, welche einen Polymerisierungsgrad von 1 bis 3 haben und/oder Polyglycidylether von Polyalkoholen", wie z. B. Denacol EX-313 oder 314. Die durch dieses Dokument offenbarten Polyepoxyd-Verbindungen sind folglich hochmolekulare Verbindungen.
Die US-Schrift US 5296583 nach Levy und andern beschäftigt sich im Wesentlichen mit der Inhibition oder Prävention der Verkalkung von synthetischen Biomaterialien, welche biokompatible Elastomere sind, wie z. B. Polyurethan und Polydimethylsiloxan. Die Verwendung von polyfunktionalen Epoxiden, um eine Brücke zu bilden, um irreversibel ein Antiverkalkungsmittel, wie z. B. Polyphosphonat, zu inkorporieren, wird diskutiert. Eine Ersatzbeschreibung von diesem Prozess ist, dass ein phosphoniertes Epoxid (oder Monoaddukt) in das synthetische Biomaterial während der anfänglichen Polymerisation eingeschlossen wird oder in ein prä-polymerisiertes synthetisches Biomaterial.
Daher ist es eine Aufgabe dieser Erfindung Biomaterialien für die Implantation in ein Säugetier bereitzustellen, welche eine erhöhte Resistenz hinsichtlich der pathologischen in vivo Verkalkung aufweisen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Biomaterialien für die Implantation in ein Säugetier bereitzustellen, welche eine Langzeit- oder verlängerte Resistenz hinsichtlich der pathologischen in vivo Verkalkung aufweisen.
Es ist auch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Biomaterialien für eine weitreichende Implantation in einem Säugetier bereitzustellen, welche eine lokalisierte Inhibition der Verkalkung aufweisen und daher die toxischen Nebenwirkungen, welche mit den systemischen Verabreichungen von Antiverkalkungsmitteln verbunden sind, zu vermeiden.
Zusätzlich ist es eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren der Fertigstellung und/oder Behandlung von Biomaterialien für die Implantation in einem Säugetier bereitzustellen, welche Epoxid vernetzende Mittel verwenden, um die Biomaterialien noch resistenter gegenüber der pathologischen in vivo Verkalkung zu machen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorangehenden und andere Aufgaben werden durch die Erfindung erreicht, welche in einer Hinsicht ein Verfahren zur Behandlung eines biologisch erlangten Biomaterials für die Implantation in das Inneres eines Körpers eines Lebewesens bereitstellt, das Biomaterial im Wesentlichen unlöslich im Inneren des Körpers des Wirts-Lebewesens ist, das Verfahren die Schritte der Inkubation des Biomaterials umfasst, in einer Lösung von einem Epoxid vernetzenden Mittel, bei einem geeigneten pH für eine Zeitdauer ausreichend, um eine Vernetzung des Biomaterials und eine Blockade der Verkalkungsstellen zu ermöglichen, dadurch gekennzeichnet, dass das Epoxid vernetzende Mittel ein polyfunktionales Epoxid ist, das mindestens zwei Epoxid-Hälften pro Molekül hat, und die Lösung ferner ein Polyphosponat enthält, welches mindestens eine funktionale Gruppe derart hat, welche mit einer Expoxid-Funktionalität reagiert, so dass ein Monoaddukt zwischen diesen beiden Verbindungen in besagter Lösung gebildet wird, das polyfunktionale Anti-Verkalkungs-Mittel in einem molaren Verhältnis von mindestens 1:2 bereitgestellt wird, so dass ein Überschuss von freiem polyfunktionalem Epoxid vorliegt, die Lösung, welche das Monoaddukt enthält, vor der Inkubation mit dem Biomaterial mit Wasser verdünnt wird.
Bevorzugt wird das Biomaterial mit Glutaraldehyd vorbehandelt oder in Glutaraldehyd gelagert.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "derivatisiert", dass ein Anti-Verkalkungs-Mittel, wie z. B. das vorgenannte Polyphosphonat, kovalent an die Oberfläche von dem Biomaterial Gewebe durch eine Epoxid-Verbindung geknüpft ist.
Der Begriff "Biomaterial" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf kollagenes Material, welches aus verschiedenen Tierarten erlangt werden kann, üblicherweise Säugetiere. Das Biomaterial ist üblicherweise für die Implantation geeignet, wie z. B. bioprothetisches Gewebe oder Ähnliches, aber die Erfindung soll dadurch nicht eingeschränkt werden. Genau bezeichnete Beispiele umfassen, sind aber nicht limitiert auf diese, Herzklappen, insbesondere Schweine Herzklappen; Aorten-Wurzeln, Wände und/oder Klappensegel; Rinder Pericard; Bindegewebe, erlangt aus Materialien wie z. B. Dura Mater, Allotransplantat Gewebe, wie z. B. Aorten Allotransplantate und saphene Bypass-Transplantate; Sehnen, Bänder, Hautstückchen, Arterien, Venen; und Ähnliches. Natürlich sind sämtliche anderen biologisch erlangte Materialien, welche als geeignet für die Dauer-Verwendung in dem Körper von Lebewesen bekannt sind, oder bekannt werden, innerhalb der Kontemplation der Erfindung.
Jede Epoxid-Verbindung, welche bevorzugt wasserlöslich ist und als Kalzium-Antagonist wirken kann, ist innerhalb der Kontemplation der Erfindung. Beispiele von geeigneten Epoxid vernetzenden Mitteln umfassen, ohne Limitierung, Mono- oder Diepoxide, wie z. B. Diglycidyl Butandiol Esther, Ethandiol Diglycidyl Esther, Erythritolanhydrid (EDE), Butandiol Diglycidyl Ether (GAB) und Epichlorhydrin, ebenso wie polyfunktionale Epoxide, wie z. B. die Epoxide, welche unter der Handelsmarke Denacol durch Nagasi Chemicals, Osaka, Japan, verkauft werden. Die Denacol Epoxide sind polyfunktionale Polyglycerol Polyglycidyl Ether. Zum Beispiel hat Denacol 512 vier Epoxide pro Molekül und Denacol 521 hat 5 Epoxide pro Molekül. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Polyepoxid" reaktive polyfunktionale Epoxide, welche mindestens 2 Epoxidhälften pro Molekül haben.
Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "Polyphosponat" Verbindungen, welche mindestens zwei Phosphonate pro Molekül haben. Solche Polyphosphonate sind kommerziell erhältlich oder können durch den Fachmann synthetisiert werden. Beispielhafte Polyphosphonate umfassen 3-Amino-1-Hydroxypropan 1,1-diphosphonsäure (APD) und Ethanhydroxydiphosponat (EHGP). In einigen Ausführungen sind andere Polyphosponate, wie z. B. Aminomethyltriphosponsäure und Butylpentaphosponsäure bevorzugt. Zusätzliche veranschaulichende Beispiele umfassen, ohne Einschränkung, Hexamethylendiamintetra (Methylenphosphonsäure) und Dieethylentriaminpenta (Methylenphosponsäure).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Monoaddukt von einem Polyphosphonat und einem Polyepoxid unter Bedingungen gebildet, wo ein Überschuss an Polyepoxid verbleibt. Das überschüssige Epoxid vernetzt das Gewebe und die reaktive Epoxidfunktionalität von dem Monoaddukt bindet an die Aminogruppen von den Gewebeproteinen, um das Phosponat enthaltende Addukt kovalent permanent an das Gewebe zu binden.
Kurze Beschreibungen der Abbildung
Das Verständnis der Erfindung ist durch das Lesen der folgenden ausführlichen Beschreibung erleichtert, in Verbindung mit der beiliegenden Abbildung, in welcher:
1 eine grafische Darstellung von dem Kalziumgehalt (μg/mg) von Proben von Schweineaortenklappen ist, welche in Übereinstimmung mit den Verfahren der Erfindung behandelt worden sind, im Anschluss an 21 Tagen subdermaler Implantation in Ratten;
2 eine grafische Darstellung von dem Kalziumgehalt (μg/mg) von Proben von Schweineaortenklappen ist, welche mit hochmolekularen Polyepoxiden in Übereinstimmung mit den Verfahren der Erfindung vernetzt worden sind, nach 21 Tagen subdermaler Implantation in Ratten;
3 ist eine grafische Darstellung von dem Kalziumgehalt (μg/mg) von Proben von Schweineaortenklappen, welche einem Katalysator ausgesetzt worden sind;
4 ist eine grafische Darstellung von dem Kalziumgehalt (μg/mg) von Proben von Schweineaortenklappen, welche Epoxid vernetzenden Mitteln bei hohen pH-Werten (10 bis 11) in der Gegenwart eines weiteren Katalysators ausgesetzt worden sind;
5 ist eine grafische Darstellung der Kollagendenaturierungstemperatur (°C) von Proben von Schweineaorten Klappensegel, welche einem Epoxid vernetzendem Mittel bei einem pH von 10 oder 11 unterworfen worden sind;
6 ist eine grafische Darstellung der Kollagendenaturierungstemperatur (°C) von Proben von Schweineaorten Klappensegel, welche einem Polyepoxid vernetzendem Mittel, Denacol, in der Gegenwart von einem Katalysator bei pH-Werten sich erstreckend von 6 bis 12 unterworfen worden sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Unten ist eine genaue veranschaulichende Technik (siehe Punkt II) für die Herstellung verkalkungsresistenter bioprothetischer Biomaterialien in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Erfindung gegeben. Obwohl die gegebenen Beispiele in erster Linie auf die Herstellung von verkalkungsresistenten Herzklappenkomponenten gerichtet sind, sind die hierin beschriebenen Techniken für die Herstellung aller sonstigen Vorrichtungen, Prothesen oder Implantate geeignet, welche Biomaterialien von der Art umfassen, die als Dauer- oder chirurgisch implantierte Hilfsmittel verwendet werden.
I. Mit Epoxiden vernetzte bioprothetische Gewebe
A. Verfahren bei hohen pH-Werten
Bei einer Methode wird das frische bioprothetische Gewebe in einer wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Epoxid vernetzenden Mittel bei einem pH von 10 oder größer für eine Zeitdauer inkubiert, die ausreichend ist, um eine irreversible Vernetzung und Blockierung der Verkalkungsstellen zu ermöglichen. Die Konzentration des Epoxid vernetzenden Mittels, welches ein reaktives polyfunktionales Epoxid oder Diepoxid sein kann, reicht bevorzugt von ungefähr 0.01 M bis 1.0 M, und noch bevorzugter von ungefähr 0.05 M bis 0.5 M. Die Lösung ist auf einen pH von größer als 10, und bevorzugter in dem Bereich von 10 bis 11 auf eine auf dem Fachgebiet bekannten Art und Weise gepuffert, beispielsweise mit 0.5 M Natriumborat.
In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Inkubationszeit zwischen ungefähr 24 Stunden und 21 Tagen, üblicherweise 7 Tage. Dennoch ist die Zeitdauer, welche für die Inkubation in den hierin beschriebenen Ausführungsformen zugewiesen wurde, veranschaulichend und kann durch den Fachmann verändert werden. Wie auch immer, es sollte beachtet werden, dass keine schädlichen Wirkungen auf das bioprothetische Gewebe während der vorgeschlagenen Dauer von 7 Tagen beobachtet worden sind. Die Inkubationstemperatur kann von ungefähr 4°C bis 63°C reichen, so dass Proteine in dem Gewebe nicht denaturieren. Bevorzugt ist die Temperatur höher als 20°C, und am meisten bevorzugt in dem Bereich von 25°C bis 37°C.
Bioprothesen, wie zum Beispiel Schweine Aorten Klappensegel oder Rinder Perikard sind üblicherweise im Anschluss an das Ernten in Glutaraldehyd stabilisiert und konserviert, veranschaulichend in einer 0,2%-igen Lösung von Glutaraldehyd in 0,05 Hepes Puffer (N-2-Hydroxyethylpiperzin-N'-2-Ethynsulfonsäure, erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Glutaraldehyd-konservierte Bioprothesen können dann bei 4°C für längere Zeitperioden gelagert werden. Glutaraldehyd-konservierte bioprothetisches Gewebe, welches in einer wässrigen Lösung von Epoxid vernetzenden Mitteln inkubiert wird, zeigt eine bessere Verkalkungsresistenz.
In einem Beispiel werden Schweine Aorten Klappensegel in einer Lösung eines niedermolekularen Epoxid, mit einem hohen pH (> 10, und bevorzugt in dem Bereich von 10,5 und 11,5), bevorzugt 4 bis 6 Kohlenstoffatome in der Kernkettenlänge, wie z. B. Butandiol Diglycidylether bei 0,1 M, bei einer Temperatur von 25°C, für 7 Tage stabilisiert und konserviert, um Stabilität zu verleihen und die Verkalkungsstellen zu blockieren.
B. Verfahren bei physiologischen pH-Werten
In einem noch weiteren Verfahren ist das bioprothetische Gewebe einer wässrigen Lösung von einem wasserlöslichen Epoxid vernetzenden Mittel ausgesetzt, welche auf einen physiologischen pH gepuffert ist, d. h. einem pH in dem Bereich von 7,0 bis 8,0, bevorzugt 7,4. Die vernetzende Lösung enthält ein tertiäres oder quaternäres Amin, welches als ein "Katalysator" agiert, um die Polyepoxid Vernetzung von dem bioprothetischen Gewebe bei einem physiologischen pH unter wässrigen Bedingungen zu ermöglichen. Geeignete tertiäre oder quaternäre Amine, welche in dem Verfahren der Erfindung verwendbar sind, umfassen, ohne Einschränkung, Tris (Hydroxymethyl) Aminomethanhydrochlorid (Tris) und Imidazol. In einigen Ausführungsformen puffert auch der Katalysator die Lösung.
Das Epoxid vernetzende Mittel ist in der wässrigen Lösung in einem Konzentrationsbereich von 0,005 M bis 0,5 M vorhanden. Die Konzentration des Katalysators ist üblicherweise ungefähr 0,01 M, aber kann relativ zu der Konzentration von dem Epoxid vernetzenden Mittel variieren. Die anderen Reaktionsbedingungen, wie z. B. Zeit und Temperatur, sind in Übereinstimmung mit der Ausführungsform bei hohem pH hierin beschrieben.
In einer speziellen veranschaulichenden Ausführungsform ist ein Polyepoxid, wie z. B. Denacol 521 bei einer Konzentration von 0,1 M auf einen pH von 7,4 mit 0,01 M Imidazol oder Tris gepuffert. Eine Probe vom bioprothetischen Gewebe ist der Epoxidlösung für 7 Tage bei 25°C ausgesetzt.
II. Vernetzung und Derivatisierung von bioprothetischem Gewebe
Mit Polyphosphonat : Polyepoxid Monoaddukten
In Übereinstimmung mit einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können bioprothetische Gewebe gleichzeitig mit einem Polyphosphonat : Polyepoxid Monaddukt vernetzt und derivatisiert werden. Polyphosphonat wird unverdünnt mit einem Stock von reinem Polyepoxid in einem molaren Verhältnis von mindestens 1:2, und bevorzugt 1:10, kombiniert. Und diesen Bedingungen wird bevorzugt ein Monoaddukt von Polyphosphonat Polyepoxid gebildet, wobei ein Überschuss von nicht-reagiertem Polyepoxid hinterbleibt. Die Monoaddukt enthaltende Mischung wird mit Wasser bis auf eine Konzentration in dem Bereich von 0,005 M bis 0,5 M verdünnt, und bevorzugt auf ungefähr 0,1 M. In einigen Ausführungsformen kann die Monoaddukt enthaltende Mischung mit den katalytischen Aminen, Tris oder Imidazol, wie oben beschrieben, auf einen physiologischen pH gepuffert werden.
Bioprothetisches Gewebe, entweder frisches oder mit Glutaraldehyd vorbehandeltes, wird der verdünnten Monoaddukt enthaltenden Mischung für eine Zeitdauer, welche ausreichend ist, um sowohl zu vernetzen als auch reaktiv Polyphosphonate an das bioprothetische Gewebe zu binden, ausgesetzt. Noch spezieller, die Monoaddukt enthaltende Mischung, welche auch überschüssiges, nicht-reagiertes Polyepoxid enthält, vernetzt das Gewebe mit dem nicht-reagierten Polyepoxid, während die reaktive Epoxidfunktionalität von dem Monoaddukt die Aminogruppen von den Gewebeproteinen bindet, um das Phosphonat enthaltende Addukt kovalent an das Gewebe zu binden. Das Ergebnis ist eine dauerhafte Verkalkungsresistenz.
In einer veranschaulichenden Ausführungsform von diesem Aspekt der Erfindung wird 1 M APD zu 10 M eines reaktiven Polyepoxid zugefügt, wie z. B. GAB, und für 30 Minuten stehen gelassen, um ein Monoaddukt zu bilden. Die Monoadduktlösung wird mit Wasser auf eine Konzentration von 0,1 M verdünnt und auf einen pH zwischen 7,5 und 10 gepuffert. Frisches bioprothetisches Gewebe ist der verdünnten Monoadduktlösung einer Dauer von 24 h bis 21 Tage bei einer Temperatur von 25°C ausgesetzt, um die Vernetzung und Derivatisierung zu verleihen.
Es sollte erwähnt, dass der Konzentrationsbereich für das Diphosphonat Salz (in der reinen sauren Form) lediglich für Zwecke der Veranschaulichung gegeben ist, und kann durch den Fachmann variiert werden, um sowohl die Bindung als auch die Vernetzung zu optimieren. Ferner ist die zugewiesene Temperatur und Dauer für die Inkubation in den hierin beschriebenen Ausführungsformen veranschaulichend und kann durch den Fachmann variiert werden.
Darüber hinaus sind organische Lösungsmittel sicherlich innerhalb der Kontemplation der Erfindung, obwohl eine wässrige Lösung für bioprothetisches Gewebe empfohlen ist, insofern, als organische Lösungsmittel schädliche Effekte auf biologisch basierendes Gewebe haben,. Zum Beispiel wurden Isopropanol und Ethanol sicher in Verbindung mit bioprothetischen Geweben verwendet.
Experimenteller Abschnitt:
Bioprothetisches Gewebe im subdermalen Rattenmodell
Proben von bioprothetischem Gewebe wurden in Form von Rinder parietal Perikard aus reifen Rindern bei der Schlachtung erhalten und sofort in Lösungen von einem niedermolekularen Epoxid, Diglycidylbutandiolesther (GAB), und einen hochmolekularen Epoxid, Denacol 521 (DEN), bei pH Werten von 10 und 11 für 7 Tage bei 37°C platziert. Zum Vergleich wurden einige Proben auch in 0,6% Glutaraldehyd bei pH 11 für 7 Tage bei 37°C inkubiert.
Die Proben von dem Rinder Pericard wurden in zwei subkutane Haut Pouches implantiert, welche in der ventralen abdominalen Wand von frisch entwöhnten Ratten (Männchen, CD, SPRAGUE-DAWLEY, Gewicht 50–60 g) präpariert worden sind. Nach einer Zeitdauer (21 Tage und 60 Tage) wurden die Gewebeproben entfernt und auf die Verkalkung durch das Messen der Mengen von Ca⁺²-Ionen in dem Gewebe hin untersucht. Die Ergebnisse sind in der unteren Tabelle I berichtet.
Tabelle I
Anmerkungen:

GAB

= Diclycidylbutandiolester

DEN

= Denacol 521 (Polyglycidyl Ether-Pentaepoxide)

GLT

= Glutaraldehyde

Die Tabelle 1 zeigt eine signifikante Inhibition der Antiverkalkung der Proben von Proben vom Rinder Pericard, welche mit niedermolekularen Epoxiden bei hohen pH-Werten behandelt worden sind.
Bioprothetische Gewebeproben in der Form von Schweineaorten Klappensegel wurden Lösungen von GAB und Denacol 521 bei pH-Werten von 10 und 11 für 7 Tage bei 25°C ausgesetzt. Andere Proben wurden den Monoaddukt enthaltenden Lösungen von APD GAB und APD : Denacol (1 M Polyphosphonat bis 10 M Polyepoxid) bei pH 10 für 7 Tage bei 25°C ausgesetzt.
Nach dem Kontakt mit den Epoxid vernetzenden Mitteln wurden die Klappensegelproben von der vernetzenden Lösung freigewaschen und in zwei subkutane Pouches implantiert, welche in die ventrale abdominale Wand von frisch entwöhnten Ratten präpariert worden sind. Nach 21 Tagen wurden die Gewebeproben entfernt und auf die Verkalkung durch das Messen der Mengen an Ca⁺²-Ionen in dem Gewebe hin untersucht. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, welche eine grafische Darstellung des Kalziumgehaltes, in μg/mg Gewebe, für jede Probenart ist. Nicht vernetztes Gewebe (frisch) ist für vergleichende Zwecke gezeigt.
2 ist eine grafische Darstellung von dem Kalziumgehalt (μg/mg) von Proben von Schweine Aortenklappen, vernetzt mit hochmolekularem Polyepoxid, Denacol 521 in Übereinstimmung mit den zwei Methoden dieser Erfindung. In dem ersten Verfahren wurden die Proben Denacol 521 in wässriger Lösung, mit Imidazol auf pH 7,4 gepuffert, ausgesetzt. Im zweiten Verfahren wurden die mit Glutaraldehyd vorbehandelten Proben einer wässrigen Lösung von dem Monoaddukt APD: Denacol 521 (1:10) ausgesetzt, mit Imidazol auf pH 7 gepuffert. Kontrollproben sind, in Übereinstimmung den üblichen Methoden auf diesem Gebiet, mit Glutaraldehyd vernetzt. Für vergleichende Zwecke wurden mit Glutaraldehyd vorbehandelte Proben dem Diphosphonat, APD, bei einem pH von 7,4 ausgesetzt. Wie in 2 gezeigt, enthalten die Proben, welche in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt sind, nach 21 Tagen der Implantation in subdermalen Pouches in Ratten signifikant weniger Kalzium als die Kontrollen.
Um zu zeigen, dass das Epoxid vernetzende Mittel für die Verkalkungsresistenz verantwortlich ist, wurden mit Glutaraldehyd vorbehandelte Schweine Aorten Klappensegel in wässrigen Lösungen von Imidazol bei pH 7,4 und Denacol 521, mit Imidazol auf pH 7,4 gepuffert, bei 25°C für 7 Tage platziert. Glutaraldehyd vorbehandelte Schweineaortenklappengewebe bilden die Kontrolle. 3 ist eine grafische Darstellung von dem Kalziumgehalt (μg/mg) der Proben, welche nach 21 Tagen explantiert wurden. Die Imidazolkatalysierte Denacol-Lösung erzeugte signifikante Abnahmen im Kalziumgehalt.
4 ist eine grafische Darstellung von dem Kalziumgehalt (μg/mg) von Proben von Schweineaortenklappen, welche einem niedermolekularen Epoxid (GAB) und einen hochmolekularen Epoxid (Denacol) bei hohen pH-Werten (10–11, gepuffert mit NaOH) bei 25°C für 7 Tage in der Gegenwart von 0,1 M Tris ausgesetzt worden sind. Die inhibitorischen Effekte der Tris-Katalyse ist klar zu sehen, wenn die Ergebnisse von 4 mit denen von 1 und Tabelle 1 verglichen werden.
5 zeigt Daten, welche die Kollagendenaturierungstemperatur oder die Schrumpftemperatur, T_s zeigen, äquivalent zu denen, welche aus der Verwendung von Glutaraldehyd für Schweine Aorten Klappensegel abgeleitet sind, welche GAB oder Denacol bei einem pH von 10 oder 11 unterworfen worden sind. Die Kollagendenaturierungstemperatur von frischen, unbehandelten Klappensegel und mit Glutaraldehyd behandelten Kontrollklappensegel sind zum Vergleich gezeigt.
Weiterhin können ebenso befriedigende Schrumpftemperaturen durch die Verwendung von Epoxid vernetzenden Mitteln bei physiologischem pH durch die Verwendung von 0,1 M Tris oder Imidazol erlangt werden. 6 zeigt die Schrumpftemperatur von Schweine Aorten Klappensegel, welche 7 Tage bei 25°C einer wässrigen Lösung von 0,1 M Denacol mit 0,01 M Imidazol, mit NaOH auf verschiedene pHs gepuffert, welche von 6 bis 12 variieren, ausgesetzt worden sind. Mit Glutaraldehyd behandelte Gewebe haben eine Schrumpftemperatur von annähernd 87°C.

Claims

Verfahren zur Behandlung eines biologisch erlangten Biomaterials für die Implantation in ein Lebewesen, das Verfahren umfasst die Schritte der Inkubation des Biomaterials in einer Lösung eines Epoxid vernetzenden Mittels, bei einem geeigneten pH für eine Zeitdauer ausreichend um eine Vernetzung des Biomaterials und eine Blockade der Verkalkungsstellen zu ermöglichen, dadurch gekennzeichnet, dass das Epoxid vernetzende Mittel ein polyfunktionales Epoxid ist, das mindesten zwei Epoxid-Hälften pro Molekül hat, und die Lösung ferner ein Polyphosphonat enthält, welches mindestens eine funktionale Gruppe derart hat, welche mit einer Epoxid-Funktionalität reagiert, so dass ein Polyphophonat : Polyepoxid Monoaddukt zwischen diesen zwei Verbindungen in besagter Lösung gebildet wird, das polyfunktionale anti-Verkalkungs-Mittel in einem molaren Verhältnis von mindestens 1:2 bereitgestellt wird, so dass ein Überschuss von freiem polyfunktionalem Epoxid vorliegt, die Lösung, welche das Monoaddukt enthält, vor der Inkubation mit dem Biomaterial mit Wasser verdünnt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das polyfunktionale anti-Verkalkungs-Mittel in einem molaren Verhältnis von 1:10 bereitgestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das polyfunktionale Epoxid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Diglycidyl Butandiol Ester, Ethandiol Diglycidyl Ester, Butandiol Diglycidyl Ether, Polyepoxide und Polyglycerol Polyglicidyl Ether.
Das Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das biologisch erlangte Material mit Glutaraldehyd vorbehandelt oder in Glutaraldehyd gelagert worden ist.
Das Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH Wert aus dem Bereich von 7.5–10.0 gewählt ist.
Das Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Monoaddukt enthaltende Lösung mit Wasser bis auf eine Konzentration in dem Bereich von 0.005 M bis 0.5 M verdünnt ist.
Das Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Monoaddukt enthaltenden Lösung 0.1 M ist.
Das Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die verdünnte Monoaddukt enthaltende Lösung mit einem katalytischen Amin bis auf einen physiologischen pH in dem Bereich von 7.0–8.0 gepuffert ist.
Das Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das katalytische Amin entweder Tris oder Imidazol ist.
Das Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeit, die ausreichend ist, die Vernetzung zu ermöglichen, zwischen ungefähr 24 Stunden und 21 Tagen beträgt.
Das Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte biologisch erlangte Material ein bioprothetisches Gewebe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rinder-Perikard, Schweine-Herzklappensegel, saphene Bypass-Transplantationen, Aorten Allotransplantate und Dura Mater.
Ein biologisch erlangtes Material, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte biologisch erlangte Material eine bioprothetisches Gewebe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rinder-Perikard, Herzklappen, einschließlich Schweine-Herzklappen, Aorten-Wurzel, Wände und/oder Klappensegel, Allotransplantat Gewebe, einschließlich saphene Bypass-Transplantationen, Aorten Allotransplantate, aus Bindegewebe erlangte Materialien, einschließlich Dura Mater und Sehnen; Bändern, Haut-Stücken, Arterien und Venen und einschließlich einem Monoaddukt von Polyepoxid/Polyphosphonat, welches kovalent an das Biomaterial gebunden ist, besagtes Biomaterial im Wesentlichen im Inneren des Körpers eines Wirts-Lebewesens unlöslich ist und nach einem Verfahren der vorangehenden Ansprüche erhältlich ist.