CN108535205B - 体外生物瓣抗钙化处理方法、钙化评价方法 - Google Patents

体外生物瓣抗钙化处理方法、钙化评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种体外生物瓣抗钙化处理方法、钙化评价方法。包括步骤：将生物瓣膜浸入抗钙化因子溶液中，抗钙化因子溶液为醇类、碱溶液、油脂及其衍生物、缓冲溶液组成的混合液；以及加热，使得抗钙化因子的化学物质与生物瓣膜中游离的基团进行化学结合，封闭生物瓣膜中游离的醛基和羧基，得到抗钙化的生物瓣膜。再将得到的抗钙化的生物瓣膜浸入血浆含钙溶液中，使得抗钙化的生物瓣膜与血浆含钙溶液中的钙离子反应，钙离子通过化学键结合到抗钙化的生物瓣膜中；取反应后的抗钙化的生物瓣膜进行原子吸收光谱钙含量测定，与标准对照样进行对比，得到抗钙化的生物瓣膜的钙含量。该方法快速有效，评价周期短，同时减少了工序，节省了评价费用。

Description

体外生物瓣抗钙化处理方法、钙化评价方法
本申请是名称为：体外生物瓣钙化评价的方法及抗钙化因子溶液，申请号为：201510434781.X的发明专利的分案申请，母案申请日为2015年7月22日。
技术领域
本发明涉及生物瓣膜领域，具体涉及一种体外生物瓣抗钙化处理方法、钙化评价方法。
背景技术
目前年龄超过65岁老年人中，由于主动脉瓣钙化所致的主动脉瓣狭窄发生率达2％～7％，随着年龄增长主动脉瓣狭窄比例越来越高。严重主动脉瓣狭窄的病人左心功能严重受损，病人生活质量下降且生存时间明显缩短，必须进行有效的治疗。
针对外科手术适应症的严重主动脉瓣病人，外科人工主动脉瓣置换术(无论选用机械瓣或生物瓣)仍然是首选治疗，置换后主动脉瓣口面积常大于1.5cm2。然而，对于那些高龄、主动脉瓣狭窄终末期、全身多发的严重合并症的病人，外科主动脉瓣置换术后死亡和其它严重并发症的发生率大大增加。经皮球囊主动脉瓣成形术治疗老年主动脉瓣狭窄的方法，由于术中、手术后产生死亡、中风、主动脉破裂、主动脉瓣严重关闭不全等严重并发症的发生率高，术后短期(3～12个月)内主动脉瓣又明显狭窄，所以已不作为严重主动脉瓣狭窄的治疗方法。另外，严重主动脉瓣狭窄的高龄老年病人，无外科手术适应症时，临床治疗十分困难。
现有技术中，在进行动物试验前，选取适龄的猪或者羊，经过医生超声以及健康状况观察，评价手术风险和匹配度，确定瓣架和主肺动脉口径的吻合度，要求瓣架尺寸与主动脉或者肺动脉口径相匹配，防止瓣周漏或移位等情况发生。然后根据动物临床的要求开展动物临床，将经过处理后的生物瓣植入到猪或者羊体内，经超声影像观察瓣膜正常工作，通过饲养半年到一年的观察期，解剖取出生物瓣后经原子吸收光谱法检测生物瓣组织的含钙量，从而判定生物瓣的抗钙化性能。
通过动物临床来评价生物瓣钙化的方法具有一定的局限性，对临床手术和临床医生的技术依存度要求高、对动物选择也有相应要求，同时饲养周期长、受饲养环境和个体差异的影响较大，可能出现其它症状，比如生物瓣表皮化、生长赘生物等，不能准确有效的反映生物瓣化学处理后与钙离子的化学作用。现有技术方法不仅仅在技术上增加了难度，而且时间和成本上都大幅的增加，同时在生物瓣的钙化性能评价上，受到多种因素的影响。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种体外生物瓣抗钙化处理方法和钙化评价方法。所述的抗钙化因子英文全称为：Reducing Calcium Ingredient，简称为：RCI。
一种体外生物瓣抗钙化处理方法，包括步骤：
将生物瓣膜浸入抗钙化因子溶液中，所述抗钙化因子溶液为醇类、碱溶液、油脂及其衍生物、缓冲溶液组成的混合液；以及
加热，使得所述抗钙化因子的化学物质与所述生物瓣膜中游离的基团进行化学结合，封闭所述生物瓣膜中游离的醛基和羧基，得到抗钙化的生物瓣膜。
在其中一个实施例中，所述加热为在30℃～40℃的恒温水浴锅中以120rpm～130rpm转速温浴67h～72h。
在其中一个实施例中，每配制1L所述抗钙化因子溶液包括：150mL～300mL的试剂A，所述试剂A为醇类；10mL～100mL的试剂B，所述试剂B为碱溶液；0.5g～9.0g的试剂C，所述试剂C为油脂及其衍生物；690mL～820mL的试剂D，所述试剂D为缓冲溶液，pH值8.5～9.5。
在其中一个实施例中，所述试剂A包括乙醇、异丙醇、戊醇中的任意一种。
在其中一个实施例中，所述试剂B包括KOH、NaOH中的任意一种。
在其中一个实施例中，所述试剂C包括四烯酸、亚油酸、二十碳三烯酸、亚麻酸、氨基油酸、十二酸、庚酸、软脂酸、硬脂酸、油酸、及其衍生物中的一种或任意几种。
在其中一个实施例中，所述试剂D包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸盐酸缓冲液中的一种。
在其中一个实施例中，所述抗钙化因子溶液经预加热处理，所述预加热处理为在30℃～40℃的恒温水浴锅中以5rpm～10rpm转速温浴18h～24h。对抗钙化因子溶液进行预热，让有效成分充分均匀，达到一个稳定有效的工作环境溶液。
在其中一个实施例中，所述生物瓣膜经过前处理，所述前处理为将所述生物瓣膜浸入戊二醛溶液中，使所述生物瓣膜的基因配对。具体过程为：取切割好的瓣膜，放置换于空瓶中，用戊二醛溶液完全浸泡，室温静置18h～24h。通过戊二醛浸泡所述生物瓣膜，达到饱和过交联的作用，使所述生物瓣膜的基团充分配对。
在其中一个实施例中，所述戊二醛溶液的浓度为0.25％～5.0％。
在其中一个实施例中，每配制5L所述戊二醛溶液包括：1.0g～3.0g的硫酸镁，1.0g～3.0g的氯化钾，3.0g～5.0g的磷酸氢二钠，0.6g～1.2g的磷酸二氢钾，15g～30g的氯化钠，150mL～250mL的25％戊二醛，500mL～1000mL的异丙醇。
在其中一个实施例中，经过前处理的所述生物瓣膜使用硼酸盐缓冲溶液清洗。具体过程为：将前处理的液体倒去，倒入硼酸盐缓冲溶液浸没，晃动清洗一次或数次，倒去液体。
在其中一个实施例中，每配制1L所述硼酸盐缓冲溶液包括：3.0g～15.0g的氯化钠，2.0g～5.0g的四硼酸钠。
在其中一个实施例中，所述硼酸盐缓冲溶液的pH值8.5～9.5。
上述通过抗钙化因子溶液的配合对生物瓣膜在体外进行化学处理，封闭生物瓣膜中游离的醛基和羧基，减小生物瓣膜与钙离子的结合力，从而降低生物瓣膜的挂钙量，增强生物瓣膜的抗钙化能力。
本发明还提供一种体外生物瓣钙化评价方法，包括步骤：
将上述得到的所述抗钙化的生物瓣膜浸入血浆含钙溶液中，使得所述抗钙化的生物瓣膜与所述血浆含钙溶液中的钙离子反应，所述钙离子通过化学键结合到所述抗钙化的生物瓣膜中；
取反应后的所述抗钙化的生物瓣膜进行原子吸收光谱钙含量测定，与标准对照样进行对比，得到所述抗钙化的生物瓣膜的钙含量。
在其中一个实施例中，所述抗钙化的生物瓣膜在浸入所述血浆含钙溶液之前保存于生理盐水溶液中。
在其中一个实施例中，所述的保存温度为2℃～8℃。
在其中一个实施例中，所述生理盐水溶液为0.9％生理盐水，每配制10L所述生理盐水包括：90g±0.1g的氯化钠。
在其中一个实施例中，所述血浆含钙溶液中的血浆是人工代血浆，每配制1L所述人工代血浆含钙溶液包括：10mL～15mL的10％CaCl2溶液，900mL～1000mL的羟乙基淀粉氯化钠注射液。
上述体外生物瓣膜钙化评价方法可以快速有效的判断抗钙化处理后的生物瓣膜的抗钙化性能，评价周期短，同时减少了工序，节省了评价费用。
具体实施方式
以下将对本发明的较佳实施例作详细说明。
具体方案如下：
1.钙化评价液配制
本发明的整个方案中需用到5种溶液，0.25～5.0％戊二醛溶液、0.9％生理盐水溶液、BBS溶液、RCI溶液、人工代血浆含钙溶液。其成分及含量如下所示：
Figure BDA0001641977840000051
Figure BDA0001641977840000061
Figure BDA0001641977840000062
Figure BDA0001641977840000063
上述试剂中：
试剂A为醇类，包括乙醇、异丙醇、戊醇中的任意一种；
试剂B为碱溶液，包括KOH、NaOH中的任意一种；
试剂C为油脂类及其衍生物，包括四烯酸、亚油酸、二十碳三烯酸、亚麻酸、氨基油酸、十二酸、庚酸、软脂酸、硬脂酸、油酸、及其衍生物中的一种或任意几种；
试剂D为缓冲溶液，包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸盐酸缓冲液中的一种，pH值为8.5～9.5。
Figure BDA0001641977840000071
2.RCI溶液预加热
取RCI溶液于30～40℃的恒温水浴锅中以5～10rpm转速温浴18～24h。
此过程主要是对RCI溶液进行预热，让有效成分充分均匀，达到一个稳定有效的工作环境溶液。
3.抗钙化前(PRCI)处理
取切割好的瓣膜，放置换于空瓶中，用0.25～5.0％戊二醛溶液完全浸泡，室温静置18～24h。
此过程是通过戊二醛浸泡瓣膜，达到饱和过交联的作用，基团充分配对。
4.RCI处理
将PRCI处理的液体倒去，倒入BBS溶液浸没，晃动清洗一次或数次，去液后用RCI溶液完全浸泡，在30～40℃的恒温水浴锅中以120～130rpm转速温浴67～72h。
此过程是将RCI溶液的化学物质与瓣膜中游离的基团进行化学结合，达到封闭瓣膜中游离的醛基和羧基的目的。
5.瓣膜样品保存
样品去液后，倒入0.9％生理盐水溶液完全浸泡样品，2～8℃保存。
6.体外钙化反应
取样品放入人工代血浆含钙溶液中，30～40℃，120rpm，恒温水浴中反应10天、15天、30天、60天。
此过程是评价生物瓣钙化性能的重要环节，将生物瓣与定量的钙离子溶液充分反应，钙离子通过化学键结合到瓣膜中，以评价瓣膜附着钙量。
7.钙定量检测
分别取0天、10天、15天、30天、60天的样品进行原子吸收光谱钙含量测定。
Figure BDA0001641977840000081
从以上表格测定结果可以看出，抗钙化的生物瓣膜的钙含量低于对照样，评价方法有效。
实施例1～4：
1.钙化评价液配制
本发明的5种溶液包括：0.25％～5.0％戊二醛溶液、0.9％生理盐水溶液、硼酸盐缓冲溶液、抗钙化因子溶液、人工代血浆含钙溶液。其成分及含量如下所示：
Figure BDA0001641977840000082
Figure BDA0001641977840000091
Figure BDA0001641977840000092
Figure BDA0001641977840000093
Figure BDA0001641977840000094
Figure BDA0001641977840000101
上述试剂中：
试剂A中，1#为正丙醇，2#为异丙醇，3#为乙醇，4#为正戊醇；
试剂B中，1#为K0H，2#为KOH，3#为NaOH，4#为NaOH；
试剂C中，1#为亚油酸，2#为氨基油酸，3#为软脂酸，4#为油酸；
试剂D为缓冲溶液，1#为磷酸盐缓冲液，2#为硼酸盐缓冲溶液，3#甘氨酸盐酸缓冲液，4#为硼酸盐缓冲溶液。
Figure BDA0001641977840000102
2.RCI溶液预加热
取RCI溶液于30～40℃的恒温水浴锅中以5～10rpm转速温浴18～24h。
此过程主要是对RCI溶液进行预热，让有效成分充分均匀，达到一个稳定有效的工作环境溶液。
3.抗钙化前(PRCI)处理
取切割好的瓣膜，放置换于空瓶中，用0.25～5.0％戊二醛溶液完全浸泡，室温静置18～24h。
此过程是通过戊二醛浸泡瓣膜，达到饱和过交联的作用，基团充分配对。
4.RCI处理
将PRCI处理的液体倒去，倒入BBS溶液浸没，晃动清洗一次或数次，去液后用RCI溶液完全浸泡，在30～40℃的恒温水浴锅中以120～130rpm转速温浴67～72h。
此过程是将RCI溶液的化学物质与瓣膜中游离的基团进行化学结合，达到封闭瓣膜中游离的醛基和羧基的目的。
5.瓣膜样品保存
样品去液后，倒入0.9％生理盐水溶液完全浸泡样品，2～8℃保存。
6.体外钙化反应
取样品放入人工代血浆含钙溶液中，30～40℃，120rpm，恒温水浴中反应10天、15天、30天、60天。
此过程是评价生物瓣钙化性能的重要环节，将生物瓣与定量的钙离子溶液充分反应，钙离子通过化学键结合到瓣膜中，以评价瓣膜附着钙量。
7.钙定量检测
分别取0天、10天、15天、30天、60天的样品进行原子吸收光谱钙含量测定。
Figure BDA0001641977840000111
从以上表格测定结果可以看出，经过抗钙化处理得到的抗钙化的生物瓣膜的钙含量低于对照样，评价方法有效。
本发明的体外生物瓣钙化评价方法，在时间上极大的缩短了钙化评价周期，与动物临床6个月相比，缩短了4个月时间，同时减少了工序，不再需要试验动物和临床医生的参与，从而极大的节省了科研费用。在技术上对生物瓣膜化学处理的钙化评价，形成了一套高效的评价方法，标准化的评价，不易受其它因素的影响，对因化学基团造成的生物瓣钙化现象具有很好的评价意义，也为后续动物体内生物瓣的钙化评价起到了辅助和指导作用。
应当理解的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，对本领域技术人员来说，可以对上述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而所有这些修改和替换，都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种体外生物瓣抗钙化处理方法，其特征在于，包括步骤：
将生物瓣膜浸入抗钙化因子溶液中，所述抗钙化因子溶液为醇类、碱溶液、油脂及其衍生物、缓冲溶液组成的混合液，其中，每配制1L所述抗钙化因子溶液包括：150mL～300mL的试剂A，所述试剂A为醇类，所述试剂A包括乙醇、异丙醇、戊醇中的任意一种；10mL～100mL的试剂B，所述试剂B为碱溶液，所述试剂B包括KOH、NaOH中的任意一种；0.5g～9.0g的试剂C，所述试剂C为油脂及其衍生物，所述试剂C包括四烯酸、亚油酸、二十碳三烯酸、亚麻酸、氨基油酸、十二酸、庚酸、软脂酸、硬脂酸、油酸、及其衍生物中的一种或任意几种；690mL～820mL的试剂D，所述试剂D为缓冲溶液，pH值8.5～9.5；以及
加热，使得所述抗钙化因子的化学物质与所述生物瓣膜中游离的基团进行化学结合，封闭所述生物瓣膜中游离的醛基和羧基，得到抗钙化的生物瓣膜。
2.根据权利要求1所述的体外生物瓣抗钙化处理方法，其特征在于，所述加热为在30℃～40℃的恒温水浴锅中以120rpm～130rpm转速温浴67h～72h。
3.根据权利要求1所述的体外生物瓣抗钙化处理方法，其特征在于，所述抗钙化因子溶液经预加热处理，所述预加热处理为在30℃～40℃的恒温水浴锅中以5rpm～10rpm转速温浴18h～24h。
4.根据权利要求1所述的体外生物瓣抗钙化处理方法，其特征在于，所述生物瓣膜经过前处理，所述前处理为将所述生物瓣膜浸入戊二醛溶液中，使所述生物瓣膜的基因配对。
5.根据权利要求4所述的体外生物瓣抗钙化处理方法，其特征在于，经过前处理的所述生物瓣膜使用硼酸盐缓冲溶液清洗。
6.一种体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于，包括步骤：
将权利要求1～5任一项得到的所述抗钙化的生物瓣膜浸入血浆含钙溶液中，使得所述抗钙化的生物瓣膜与所述血浆含钙溶液中的钙离子反应，所述钙离子通过化学键结合到所述抗钙化的生物瓣膜中；
取反应后的所述抗钙化的生物瓣膜进行原子吸收光谱钙含量测定，与标准对照样进行对比，得到所述抗钙化的生物瓣膜的钙含量。
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