JP2005091352A - 細胞環境下での生体用金属材料の耐久性試験法とその装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 生体用金属材料が生体内で受ける損傷および耐久性を正確に把握できる試験
方法及びその装置を提供する。
【解決手段】 細胞培養容器内で生体用金属材料の表面に細胞を付着して長期間細胞を
培養しながら生体用金属材料の耐久性を測定する。
【選択図】 図２

Description

この出願の発明は生体内に埋め込む生体用金属材料の耐久性を測定する方法とそのための装置に関するものであり、さらに詳しくは生体用金属材料の表面に細胞を付着させて細胞を長期間培養しながら生体用金属材料の耐久性試験をすることのできる新しい方法とそのための装置に関するものである。

外科や歯科の医療分野における固定具、人工骨、人工関節、人工歯根等の材料としてステンレス鋼、Ｃｏ基合金、Ｎｉ、ＴｉおよびＴｉ合金、貴金属等の金属が使用されている。これらインプラント金属と称される金属は身体の骨や歯の代用品として開発されたものであるが、使用に耐え得る強度だけでなく細胞組織や粘膜に対する親和性、アレルギー性または発ガン性等の細胞組織との適合性について色々な角度からの検討がなされている（特許文献１および２）。

一方、これらの生体用金属材料が細胞組織に与える影響とは逆に体内においては生体用金属材料が体液によって影響を受けており、この生体用金属材料が体液によって受ける影響を調べるための耐久性試験等も行われている。

生体用金属材料の耐久性試験は疑似体液を使用して生体用金属材料の耐久性を調べているが、擬似体液としては生理食塩水、リンゲル液、リン酸塩類緩衝液、ハンクス溶液などが使用されているのである。ところが、実際の体液中にはアミノ酸やタンパク質が多く含まれており、これらのアミノ酸やタンパク質が炎症性細胞やマクロファージを産出している。そして、生体内に生体用金属材料が埋入されると生体内の細胞はその生体用金属材料を異物として認識し、免疫細胞であるマクロファージが生体用金属材料の表面に付着する。この生体用金属材料の表面に付着したマクロファージが生体用金属材料の表面で消化酵素および活性酸素を産出するとともにサイトカインを産出して免疫反応に係わる他の細胞を誘因する種々の細胞を生体用金属材料の表面に付着している。

また、マクロファージを使用した耐食性試験ではマクロファージが異物反応の結果、生体用金属材料の表面にピットを形成することも報告されている。

このように、生体用金属材料表面に各種細胞が付着すると細胞間で隙間腐食が生じ生体用金属材料に損傷を与える原因となっている。ところが、従来の生体用金属材料の耐久性試験の擬似体液では細胞が含まれていないため、実際の生体内で起きているアミノ酸やタンパク質の生体用金属材料への影響が正確に把握できないという問題がある。たとえば、材料としてＳＵＳ３１６Ｌステンレス鋼（冷間加工材：引張り強度 １．１３２ＭＰa）を使用して、うさぎ頸骨中の引張りー引張り疲労試験を行なった結果、応力繰り返し速度１０Ｈzの大気中、生理食塩水中、馬血清中の５×１０⁶回の疲労強度は、８３０-８６０Ｍ
Ｐaであるのに対して，うさぎ頸骨中の疲労強度は７００ＭＰaであり、さらに応力繰り返し速度を５Ｈzにすると６６０ＭＰa程度にまで低下することが報告されている（非特許文献１）。
特開２００３−１３５５８５号公報 特開平 ０９−９９０５３号公報 林 均、笹田直、森田真史、塚本行男、西 法正「生体内における金属 材料の引張疲労特性」、生体材料、３(１９８５)１４３-１４９

そこで、この出願の発明は、以上のような従来技術の問題点を解消し、実際の生体内により近い環境で生体用金属材料材料の耐久性試験を行うことができる新しい耐久性試験方法とその装置を提供することを課題としている。

この出願の発明は、上記の課題を解決するためのものとして、第１には、表面に細胞を付着させた生体用金属材料を細胞培養容器内に挿入して、３０〜４５℃の温度範囲に保持しながら細胞培養液と接触させて、長期間の細胞培養を行い生体用金属材料の疲労測定を行う生体用金属材料の耐久性試験法を提供する。また、第２には、細胞培養液回収型の細胞培養容器内に新しい培養液を０．２〜０．４cc／ｈの供給速度で供給しながら細胞を培養する上記の生体用金属材料の耐久性試験法を提供し、第３には、細胞培養液循環型の細胞培養容器内に再生した培養液を２．０〜４．０cc／ｈの供給速度で循環しながら細胞を培養する上記の生体用金属材料の耐久性試験法を提供し、また第４には、生体用金属材料に繰り返し荷重を付与しながら細胞を培養する上記の生体用金属材料の耐久性試験法を提供する。

また、この出願の発明は、第５には、表面に細胞を付着した生体用金属材料の挿入部と覗き窓を備えた温度制御可能な割型の細胞培養容器に、細胞培養液の充填口と排出口が設けられていることを特徴とする細胞を培養しながら生体用金属材料の疲労測定を行うことが可能な生体用金属材料の耐久性試験装置を提供し、第６には、細胞培養容器には細胞培養液供給容器と細胞培養液回収容器とが連結され、培養液の供給と回収が可能とされている上記の生体用金属材料の耐久性試験装置を提供し、また第７には、細胞培養容器と細胞培養液供給容器とが循環可能に連結されている上記の生体用金属材料の耐久性試験装置を提供する。

さらに、第８には、細胞培養容器には生体用金属材料への繰り返し荷重の付与手段が設けられている上記の生体用金属材料の耐久性試験装置を提供する。

上記第１の生体用金属材料の耐久性試験法によれば、より生体に近い環境で
生体用金属材料の耐久性の測定が可能になる。

上記第２の生体用金属材料の耐久性試験法によれば、細胞培養液の供給速度を制御することによりより生体に近い環境で生体用金属材料の耐久性の測定が可能になる。

上記第３の生体用金属材料の耐久性試験法によれば、細胞培養液の供給速度
を制御することにより、さらに生体に近い環境で生体用金属材料の耐久性の測
定が可能になる。

上記第４の生体用金属材料の耐久性試験法によれば、繰り返し荷重を付与することにより生体に近い環境で生体用金属材料の耐久性の測定が可能になる。

上記第５の生体用金属材料の耐久性試験装置によれば、より生体に近い環境で測定が可能な生体用金属材料の耐久性試験装置が提供できる。

上記第６の生体用金属材料の耐久性試験装置によれば、細胞培養液の供給速度を制御することより生体に近い環境で測定が可能な生体用金属材料の耐久性試験装置が提供できる。

上記第７の生体用金属材料の耐久性試験装置によれば、細胞培養液を再生お
よび循環することにより培養液の供給速度を大きくすることができるためより
生体に近い環境で測定が可能な生体用金属材料の耐久性試験装置が提供できる。

上記第８の生体用金属材料の耐久性試験装置によれば、荷重の付与手段が設
けられていることにより、さらに生体に近い環境で測定が可能な生体用金属材料の耐久性試験装置が提供できる。

上記のとおりの特徴を有するこの出願の発明の耐久性試験法は、新しい細胞
培養液または再生された細胞培養液が絶えず細胞培養容器内に注入されるよう
になっている。そして、細胞培養容器内に注入された培養液は細胞培養容器内
に表面に細胞を付着した生体用金属材料試験片を浸して、約１週間〜６か月の
長時間に亘り、生体環境に近似する状態である３０℃〜４５℃の温度範囲で細
胞を培養させるとともに、人間の様々な生活環境に適応させるために絶えず荷
重を繰り返しながら生体用金属材料の耐久性試験を行うことを可能としている。

この生体用金属材料の耐久性試験装置は大きく分けて２つの形式がある。
その１つは図１に示されている細胞培養液回収型で、ローラーポンプ（１６）
で絶えず新しい培養液（１４）を供給しながら細胞培養容器（１）（２）内で使
用された古い培養液を回収用メジウム瓶（１５）に回収する方式のものであり、
他の１つは図２に示されている細胞培養液循環型で、ローラーポンプ（１６）
で細胞培養液（１９）を供給しながら細胞培養容器（１）（２）内で使用された古い細
胞培養液をローラーポンプ（１６）で元の細胞培養液（１９）に戻して、古い細胞培養
液に混合ガス（１７）を供給して細胞培養液を再生して循環させる方式である。この図
２に示されている細胞培養液循環型は数ヶ月継続して使用することも可能であるが、細
胞培養液の栄養の濃度や細胞培養液の循環速度等については、約１週間程度毎に確認す
る必要がある。この図１に示されている生体用金属材料の耐久性試験装置と図２に示さ
れている生体用金属材料の耐久性試験装置は、絶えず新しい細胞培養液供給するか、細
胞培養液を再生して循環させるかの違いはあるが本質的な相違点はない。

そこで、本願生体用金属材料の耐久性試験装置の発明を図１に従って、具体的に説明
すると、生体用金属材料の耐久性を測定するための細胞培養部分は、たとえば、１ｃｍ
角程度の覗き窓（４）が設けられたフッ素樹脂等からなる割型の細胞培養容器（１）（
２）とフッ素樹脂等がコーティングされたヒーター（１０）および温度センサー（９）
で構成されている。

この細胞培養容器（１）（２）、温度計（１０）、温度センサー（９）にフッ素樹脂
が好適に用いられている主な理由は使用後のエタノール滅菌、オートクレーブ滅菌、紫
外線滅菌に対して良好に対応できるようにするためである。

細胞培養容器（１）（２）内には表面に細胞（７）を付着した生体用金属材料試験片
（３）を装填し、次いで培養液（８）を充填する。そして、温度を３０〜４５℃の体温
近辺に調整する。さらに、この出願の発明では人間の生活に適応させるために細胞培養
容器（１）（２）に繰り返し荷重を付与するが、この時の荷重の程度は安静時や運動時
、あるいは種々の生活態様に適応できるように調整される。また、細胞培養容器（１）
（２）内は細胞培養液（８）で満たされるが、この発明の耐久性試験環境装置では、細
胞の培養時に絶えず新しい細胞培養液（１４）が注入されて細胞の増殖を促進させるこ
とを可能としている点にも特徴を有している。なお、図２で示される生体用金属材料の
耐久性試験装置は、図１の改良装置であるが、図１の生体用金属材料の耐久性試験装置
は絶えず新しい細胞培養液を補充することが必要なのに比較して、この図２で示される
生体用金属材料の耐久性試験装置は、新しい細胞培養液の補充が不要であり循環のパイ
プを太くして細胞培養液の循環速度を速くすることができるため必要な酸素濃度を保ち
やすいという優れた特徴を有するものである。なお、細胞は一般に雑菌等に非常に敏感
であるとされており、外部からの雑菌の進入を防ぐだけでなく滅菌可能な装置にするた
めには装置を外部と閉鎖して連結することが好ましいとされているが、本願発明は図１
および図２に示されている生体用金属材料の耐久性試験装置においても、外部とは閉鎖
して連結されている。ただ、ここで言う外部と閉鎖して連結するとは、メンブレンフィ
ルター等を通して外部と通気性を有することも含まれる。

前記の新しい細胞培養液（１４）の導入および排出は、たとえば、スターラ上に載置
した細胞培養液供給用メジュウム瓶の細胞培養液（１４）内に混合ガスを導入すること
で行われるが、この際の混合ガスの組成としては酸素、炭酸ガス、窒素からなっている
ことが考慮される。この混合ガスは酸素濃度およびｐＨ調整をコントロールするための
もので、メンブレンフィルター（１３）を通して導入されるようにしている。培養液（
１４）の泡立ちを防ぐために供給管の先端を細胞培養液（１４）（１９）面より上方に
位置させて混合ガスを吹き込み、スターラで攪拌して均質化して酸素濃度およびｐＨを
調整する。そしてガス圧抜き（１８）によって余分な混合ガスを除いて圧力が調整され
た新しい細胞培養液（１４）は低速度のローラーポンプ（１６）で細胞細胞培養容器（
１）（２）内に送り込み絶えず新しい細胞培養液（１４）が供給されるようにしている
。

細胞培養容器（１）（２）は体温近辺の温度になるようにヒーター（１０）および温
度センサー（９）で温度が制御されている。

また、新しい細胞培養液が供給されるに従って細胞培養容器（１）（２）内で使用さ
れた古い細胞培養液は順次ローラーポンプ（１６）によって排出されて回収用メジュウ
ム瓶（１５）に回収される。

図１および図２は生体用金属材料の耐久性試験装置の全体構成を例示したものである
が、前記の割型の細胞培養容器（１）（２）についてより詳しく例示したものが図３、
図４および図５である。図３は、割型の細胞培養容器（１）（２）の各々が分離されて
、細胞容器（１）内に装填された生体用金属材料試験片（３）に細胞が付着された状態
を覗き窓（４）から見た模式図であり、図４は、細胞培養容器（１）に細胞培養容器（
２）を装着した状態で生体用金属材料試験片（３）に細胞が付着された状態を覗き窓（
４）から見た模式図である。また、図５は細胞培養容器（２）に温度センサー（９）と
ヒーター（１０）を挿入装着し、培養液（８）を充填した状態の模式図である。

そして、一方の細胞培養容器（１）には生体用金属材料試験片を装填するための穴が
設けられている。また、図３に見られるように細胞培養容器（１）（２）には内部に充
填した細胞培養液（８）が漏れ出さないようにシリコンゴム製のパッキン（６）および
ステンレス等からなる押さえ板（５）で完全にシールされる。細胞培養容器（１）（２
）においてはネジ等によって生体用金属材料試験片の装填部分は、図３および図４のよ
うに完全に密閉される。

なお、細胞培養容器（１）（２）の相互の接合部においても細胞培養液の漏れを防ぐ
ためにシリコンゴム製の細胞培養容器用パッキン（１１）が設けられる。

たとえば、以上のような構成の装置を用いた試験について、その操作の手順を以下に
さらに詳しく説明する。

すなわち、まず、上記の装置において、生体用金属材料試験片（３）として図６に示
す大きさのＳＵＳ３１６Ｌステンレス鋼を使用し、この生体用金属材料試験片（３）を
細胞培養容器（１）の側面に設けられた穴から装填する。生体用金属材料試験片（３）
を装填した後に、その両側から１ｍｍ厚のシリコンゴム製パッキン（６）をステンレス
製押さえ板（５）でビス止めをして試験片を固定する。図３に例示しているように、細
胞培養容器（１）内に生体用金属材料試験片（３）が浸漬するまで細胞培養液（８）を
注入し、生体用金属材料試験片（３）上に所定の数の細胞（７）を撒き、一定時間イン
キュベーター内で放置して生体用金属材料試験片（３）に細胞を付着させる。次に、細
胞培養容器（１）に細胞培養容器（２）を、１ｍｍ厚程度のシリコンゴム製の細胞培養
容器用パッキン（１１）を介してビスで取付け固定して密閉してから細胞培養容器（２
）に細胞培養液循環用チューブを取付ける。そして、細胞培養液の入り口（１２）から
細胞培養液（８）を十分な量を注入する。一方、新しい細胞培養液供給用の細胞培養液
容器に細胞培養液（１４）を５００ｃｃ程度注入し、酸素、炭酸ガス、窒素からなる混
合ガスを吹き込むための供給管の先端を細胞培養液（１４）の液面に達しない位置に設
ける。そしてガス圧の調整用のメンブレンフィルター（１３）を付けた管をメジュウム
瓶に取付ける。なお、細胞培養液回収用のメジュウム瓶（１５）についても同様に培養
液導入用とガス抜き用の管を取付ける。

生体用金属材料試験片（３）が取付けられた細胞培養容器（１）（２）と細胞培養液
循環用チューブを新しい細胞培養液が入った細胞培養液容器（１４）および細胞培養液
回収容器（１５）を一体にして密閉型システムとする。

ヒータ（１０）および温度センサー（９）の制御用電源を入れて細胞培養液（８）の
温度を人間の体温の３７℃前後に保持する。

新しい細胞培養液（１４）供給用の細胞培養液容器に４〜２０％Ｏ₂＋５％ＣＯ₂混 合ガスを一定流量で吹き込み、しばらく放置した後スターラーで攪拌して細胞培養液を 拡散し溶存酸素濃度およびｐＨを一定に保持する。

そして、細胞培養液循環用チューブを低速度のローラーポンプ（１６）を作動させて
注入・排出速度は毎時０．２〜０．４ccに流量を調整して、覗き窓（４）で観察しなが
ら約２か月間程度、生体用金属材料の耐熱性試験が行える。さらに、生体用金属材料の
表面の腐食状態を調べることができる。

図７は細胞培養液回収型の耐久性試験装置を利用した試験片の結果を示したものであ
り、図８は細胞培養液循環型の耐久性試験装置を利用して細胞培養液の流速を約２ｃｃ
／ｍｉｎで処理した試験片の実体顕微鏡写真である。色が濃い部分が細胞培養液と接触
し、細胞が生存していた部分であり、細胞培養液接触していない部分との差は明らかで
ある。

もちろん、この出願の発明は以上の例によって限定されることはない。その細部の構
成について様々な形態が可能である。

生体用金属材料の培養液回収型の耐久性試験装置の全体を例示した構成図で ある。 生体用金属材料の細胞培養液循環型の耐久性試験装置の全体を例示した構成 図である。 細胞培養容器（１）内に細胞を付着した生体用金属が挿入された状態を例示 した側面概要図である。 上型と下型を閉じた状態の細胞培養容器（１）（２）を例示した側面概要図 である。 温度計（９）およびヒーター（１０）を装着し、細胞培養液の導入口から細 胞培養液を入れた状態の細胞培養容器（１）（２）を例示した側面概要図である。 試験用の生体用金属材料を例示した側面である。 細胞培養液回収型の耐久性試験装置を利用した試験片である。 細胞培養液循環型の耐久性試験装置を利用した試験片である。

符号の説明

１ 細胞培養容器
２ 細胞培養容器
３ 生体用金属材料試験片
４ 覗き窓
５ 押さえ板
６ パッキン
７ 細胞
８ 細胞培養液
９ 温度センサー
１０ ヒーター
１１ 細胞培養容器用パッキン
１２ 細胞培養液出入口
１３ メンブレンフィルター
１４ 新しい細胞培養液
１５ 細胞培養液回収容器
１６ ローラーポンプ
１７ 混合ガス供給口
１８ ガス抜き口
１９ 細胞循環培養液

Claims (8)

1. 表面に細胞を付着させた生体用金属材料を細胞培養容器内に挿入して、３０〜４５℃の温度範囲に保持しながら細胞培養液と接触させて、長期間の細胞培養を行い生体用金属材料の疲労測定を行うことを特徴とする生体用金属材料の耐久性試験法。
2. 細胞培養液回収型の細胞培養容器内に新しい培養液を０．２〜０．４cc／ｈの供給速度で供給しながら細胞を培養することを特徴とする請求項１の生体用金属材料の耐久性試験法。
3. 細胞培養液循環型の細胞培養容器内に再生した細胞培養液を２．０〜４．０cc／ｈの供給速度で循環しながら細胞を培養することを特徴とする請求項１の生体用金属材料の耐久性試験法。
4. 生体用金属材料に繰り返し荷重を付与しながら細胞を培養することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかの生体用金属材料の耐久性試験法。
5. 表面に細胞を付着した生体用金属材料の挿入部と覗き窓を備えた温度制御可能な割型の細胞培養容器に、細胞培養液の充填口と排出口が設けられていることを特徴とする細胞を培養しながら生体用金属材料の疲労測定を行うことが可能な生体用金属材料の耐久性試験装置。
6. 細胞培養容器には培養液供給容器と培養液回収容器とが連結され、細胞培養液の供給と回収が可能とされていることを特徴とする請求項５の生体用金属材料の耐久性試験装置。
7. 細胞培養容器と細胞培養液供給容器とが循環可能に連結されていることを特徴とする請求項５の生体用金属材料の耐久性試験装置。
8. 細胞培養容器には生体用金属材料への繰り返し荷重の付与手段が設けられていることを特徴とする請求項５ないし７のいずれかの生体用金属材料の耐久性試験装置。