DE69429667T2

DE69429667T2 - Verfahren zur herstellung von verkalkungsbeständigem bioprosthetischem gewebe

Info

Publication number: DE69429667T2
Application number: DE69429667T
Authority: DE
Inventors: Danielle Hirsch; J. Levy
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1993-10-21
Filing date: 1994-10-20
Publication date: 2002-08-29
Anticipated expiration: 2014-10-21
Also published as: IL111351A0; ATE211930T1; EP0729364A4; NO961541L; AU8099094A; EP0729364B1; ES2171470T3; NO961541D0; IL111351A; BR9407880B1; CN1136780A; EP0729364A1; JPH09505216A; CA2174665A1; JP3768528B2; CA2174665C; AU701897B2; US5746775A; ZA948299B; BR9407880A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Materialien, die gegen eine In-vivo- Kalzifizierung beständig sind, sind insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von kalzifizierungsbeständigen Biomaterialien, wie bioprothetisches Gewebe, die zum Implantiaren in ein Lebewesen geeignet sind,
Jedes Jahr werden mehr als 100.000 Herzklappenprothesen in Patienten gesetzt. Häufig ist eine Klappenersatzoperation die einzige Möglichkeit zur Behandlung einer Herzklappenerkrankung. Zu derzeit verwendeten Ersatzklappen gehören mechanische Klappen, die vollständig aus einem synthetischen Polymermaterial wie Polyurethan bestehen können; bioprothetische Klappen, die vom Rinderperikard oder von Aortenklappen vom Schwein stammen; und Aorten-Homografts.
Die Verwendung mechanischer Klappen wird oft durch Thrombose und Gewebeüberentwicklung kompliziert, die zu einem Klappenversagen führen. Bioprothetische Herzklappen weisen im Vergleich zu mechanischen Klappenprothesen eine bessere Thrombogenizitat und bessere hämodynamische Eigenschaften auf. Eine Kalzifizierung ist jedoch die häufigste Ursache für klinisches Versagen bioprothetischer Herzklappen, die von Aortenklappen vom Schwein oder vom Rinderperikard hergestellt worden. Es wurde auch beobachtet, dass menschliche Aorten-Homograft-Implantate eine pathologische Kalzifizierung durchmachan, die das Klappengewebe und die angrenzenda Aortenwand einschließt, allerdings in einer geringeren Geschwindigkeit ab bei den bioprothetischcn Herzklappen. Bei einer pathologischen Kalzifizierung, die zu einem Klappenversagen in dar Form einer Stenose und/oder Regurgitation fuhrt, ist eine Reimplantation erforderlich. Folglich ist die Verwendung bioprothetischer Herzklappen und Homografts begrenzt, da dieses Gewebe kalzifizierungsanialtig ist. In der Tat hat man festgestellt, dass pädiatrische Patienten eine beschleunigte Kalzifizierungsrate aufweisen, so dass die Verwendung bioprothetischer Herzklappen für diese Gruppe kontraindiziert ist.
Leider wird durch eine pathologische Kalzifizierung ferner auch die Verwendung synthetischer Gefäßgrafts und anderer künstlicher Herzvorrichtungen wie HerzkammenmteTStützungasygtcrne kompliziert, da sie die Flexibilität der synthetischen Polymere beeinträchtigt, die bei der Herstellung der Vorrichtungen verwendet werden.
Der Mechanismus der pathologischen Kalzifizierung von Kardiovaskulargefäßgewebe wird nicht völlig verstanden. Im Allgemeinen betrifft der Begriff "pathologische Kalzifizierung" die unerwünschte Ablagerung von Calciumphosphatmincralaalzen. Eine Kalzifizierung kann, die Folge von Wirtsfaktoren, Implantatfaktoren und Fremdfaktoren wie mechanischer Stress sein. Es gibt einige Hinweise darauf, dass Calciumablagerungen mit devitalisierten Zellen und insbesondere Zellmembranen zusammenhängen, wobei die Calciumpumpe (CA&spplus;² - Mg&spplus;²- ATPase), die für die Beibehaltung niedriger intrazellulärer Calciumwerte verantwortlich ist, nicht mehr funktioniert oder eine Funktionsstörung hat. Es wurde beobachtet, dass chic Kalzifizierung mit einer Ansammlung von Calcium und Phosphor, als Hydroxyapatit vorliegend, beginnt, die sich zu Noduli entwickelt, die schließlich zu einem Klappenversagen führen können.
Die Präparation von bioprothetiachem Gewebe vor der Implantation beinhaltet gewöhnlich eine Behandlung, um es gegen einen nachfolgenden In-vivo-Enzymabbau zu stabilisieren, typischerweise durch Vernetzen von Molekülen, insbesondere Kollagen, an und in dem Gewebe. Zu diesem Zweck werden verschiedene Aldehyde verwendet, einschließlich Glyoxal, Formaldehyd und Glutaraldhyd, Glutaraldehyd ist jedoch das bevorzugte Agens. Zusätzlich zum Fixieren des Gewebes ist Glutaraldehyd ein gutes Sterilisationsmittel und reduziert die Antigenität des Gewebes. Bisher ist Glutaraldehyd das einzige wirksame Vernetzungsmittel zur Präparation von Implantationsgewebe, das unter wässrigen Bedingungen bei einem physiologischen pH-Wert verwendet werden kann. Leider ist jetzt bekannt, dass Glutaraldehyd die Kalzifizierung fördert. Es gibt in dar Technik daher einen Bedarf an einem Mittel, das die kalzifierungsfördernden Effekte der Vernetzungsmittel wie Glutaraldehyd umkehrt. Es wäre besonders erwünscht, Antikalzifizierungsmittel in bestehende Protokolls für die Präparation klinischer Biomaterialien einzuschließen.
Es wurden aldehydfreie Vernetzungsmittel In-vivo Polyepoxide (z. B. Polyglycerol- Polyglycidylether, verkauft unter der Marke Denacol von Nagast Chemical, Osaka, Japan) untersucht, es gibt jedoch keine überzeugenden Studien, die eine In-vivo-Wirksamkeit von polyepoxidvernetztem Gewebe demonstrieren.
Die Untersuchung der Kalzifizierungshemmung von bioprothetischem Gewebe hat sich in erster Linie auf eine Gewebevorbehandlung mit Detergenzien oder Diphosphonat- Antikalzifizierungsmitteln konzentriert. Eine Detergenzienvorbehandlung mit nichtkovalent gebundenen Detergenzien, wie Natriumdodscylsulfat (SDS), und einem kovalent gebundenen Detergens, wie Aminoölsäure, ist in Materialien, die zirkulierendem Blut ausgesetzt sind, erwiesenermaßen wirksam. Allerdings neigen sowohl Detergenzien als auch Diphosphonate dazu, infolge von Blut-Material-Interaktioncn mit der Zeit aus dem implantierten bioprothetischcn Gewebe auszuwaschen. Folglich zögern diese Behandlungen den Beginn des unvermeidlichen Kalzifizierungsprozesses nur hinaus. Somit gibt es auch Bedarf an einem Mittel, das bioprothetische Herzklappen und andere Implantierbare Biomaterialien oder Vorrichtungen, die für eine pathologische In-vivo-Kalzifizierung anfällig sind, langfristig kalzifizierungsbeständig macht.
Darüber hinaus haben Detergenzien eine nachteilige Wirkung auf das Gewebe, was zu einer Verringerung der Kollagen-Denaturierungstemperatur bzw. Schrumpftemperatur (TB) führt, die ein wichtiges Maß für die Materialfestigkeit, -haltbarkeit und -Integrität ist. In einigen Fällen führt die Verwendung von Detergenzien zu einer lokalen Toxizität. Es gibt somit Bedarf an einem wirksamen Verfahren zur Übertragung von Antikalzifizierungseigenschhaften auf bioprothetisches Gewebe, das nicht mit den nachteiligen Effekten der Detergenzien einhergeht.
Ferner führen alle vorherigen Techniken noch immer zu einem gewissen Maß an pathologischer In-vivo-Kalzifizierung, die anhand des Calciumgehalts explantierter Proben gemessen wird. Es gibt daher Bedarf an einer Behandlung, die in einem höheren Kalzifizierungshemmgrad resultiert.
Die Verwendung von Alkoholen in Behandlungsprotokollen für Biomaterial ist allgemein bekannt, jedoch gewöhnlich auf ihre Verwendung als Lösungsmittel und/oder Sterilisationsmittel begrenzt. Alkohol wird beispielsweise in Sterilisationsspülungen und für Vorratslösungen verwendet. Es wird jedoch nichts darüber gelehrt oder nahegelegt, dass sich Ethanol in irgendeiner Weise auf die Vermeidung einer pathologischen Kalzifizierung auswirke. Es wäre von Vorteil, diese allgemein bekannt« Verbindung in bestehenden Protokollen zu nutzen, tun bioprothetisches Gewebe kalzifierungsbeständig zu machen.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von Biomaterialien, insbesondere mit Glutaraldehyd vorbehandeltes bioprothetisches Gewebe, bereitzustellen, um die Biomaterialien gegen pathologische In-vivo-Kalzifizierung beständig zu machen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden. Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von Biomaterialien bereitzustellen, um eine langfristige oder anhaltende Beständigkeit gegen pathologische In-vivo-Kalzifizierung zu erzielen.
Es ist außerdem eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von Biomaterialien bereitzustellen, um die Biomaterialien gegen pathologische In-vivo- Kalzifizierung beständig zu machen, das ohne weiteres in bestehende Protokolle zur Behandlung solcher Materialien integriert werden kann und z. B. die fortgesetzte Verwendung des Vernetzungsmittels Glutaraldehyd gestattet.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von Biomaterialien bereitzustellen, um die Biomaterialien gegen pathologische In-vivo- Kalzifizierung beständig zu machen, das sich kaum, wenn überhaupt, nachteilig auf die physikalischen oder mechanischen Eigenschaften des Gewebes auswirkt, wie zum Beispiel die Schrumpftemperatur (Ts).
Es ist ferner eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Biomaterialien bereitzustellen, die zur Implantierung in ein Säugetier geeignet sind und eine verbesserte Beständigkeit gegen pathologische In-vivo-Kalzifizierung haben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die zuvor genannten sowie weitere Aufgaben werden von der vorliegenden. Erfindung gelöst, die ein Verfahren zur Behandlung eines Biomaterials bereitstellt, um das genannte Biomaterial kalzifizierungsbeständig zu machen, in dem ein Biomaterial, das ein Kollagemmaterial ist, das sich von einer Säugetierspezies herleitet, ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Rinderperikard, Aorten-Herzklappen vom Schwein, Vena-saphena-Bypass- Grafts, Aorten-Homografts und Dura mater besteht, für eine prädeterminierte Zeitdauer mit einer flüssigen Behandlungslösung behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung im Wesentlichen aus einem höher als 50 vol.%-igen wasserlöslichen aliphatischen C1-C3- Alkohol in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 besteht und dass die prädeterminierte Zeitspanne zwischen 20 Minuten und 96 Stunden beträgt.
Der hierin verwendete Begriff "Biomaterial" betrifft Kollagenmaterial, das von verschiedenen Tierspezies, typischerweise Säugetierspezies, hergeleitet wird. Das Biomaterial ist gewöhnlich zur Implantation geeignet, wie bioprothetisches Gewebe oder dergleichen, allerdings sollte die Erfindung nicht hierauf begrenzt sein. Zu spezifischen Beispielen gehören unter anderem Herzklappen, insbesondere Herzklappen vom Schwein; Aortenwurzeln, Wände und/oder Segel; Rinderperikard; von Bindegewebe hergeleitetes Material wie Dura mater, Homograftgewebe wie Aorten-Homografts und Vena-saphena-Bypasa-Grafts; Sehnen, Bänder, Hautpatches, Arterien, Venen; und dergleichen. Selbstverständlich liegen alle anderen biologischen Materialien, die bekanntermaßen oder von denen bekannt wird, dass sie für den Dauereinsatz im Körper eines Lebewesens geeignet sind, im Rahmen der Erfindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird das Biomaterial mit Glutaraldehyd vorbehandelt. Folglich kann die erfindungsgemäße Alkoholbehandlung in bestehende Protokolle und standardmäßige bekannte Methodiken zur Präparation von bioprothetischem Implantationsgewebe integriert werden. Selbstverständlich befindet sich die Vorbehandlung des Biomaterials mit anderen Vernetzungsmitteln im Rahmen der Erfindung. In solchen Ausgestaltungen, bei denen das Biomaterial mit Glutaraldehyd vernetzt wird, kann jede beliebige Auswahl von Glutaraldehyd-Vorbehandlungstechniken angewendet werden. In einem typischen Glutaraldehyd-Vorbehandlungsprotokoll wird das Biomaterial einer Lösung aus gepuffertem Glutaraldehyd unter Bedingungen ausgesetzt und/oder darin aufbewahrt, die zum Vernetzen von Molekülen an und m dem Biomaterial geeignet sind. Das Biomaterial kann beispielsweise Glutaraldehyd bei einer angemessenen Temperatur (von etwa 4ºC bis etwa 25ºC) und pH-Werten (von etwa 6 bis etwa S. vorzugsweise 7,1 bis 7,4) ausgesetzt werden. Typische Glutaraldehydkonzentrationen in der Vorbehandlungslösung reichen von etwa 0,2 bis etwa 0,8 Gewichtsvol.-% oder darüber und liegen vorzugsweise bei 0,6%.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Alkoholmenge in der Behandlungslösung höher als etwa 50 Vol.-% und liegt vorzugsweise zwischen 60% und 80%. Das Biomaterial wird mit dem Alkohol über einen Zeitraum kontaktiert oder diesem ausgesetzt, der ausreicht, um das bioprothetische Gewebe gegen pathologische In-vivo-Kalzifizierung beständig zu machen, z. B. von 20 Minuten (d. h. die Zeitspanne, die für die Diffusion von Ethanol beispielsweise in bioprothetisches Gewebe erforderlich ist) bis mehr als 96 Stunden. Bei einigen Biomaterialien kann eine übermäßige Alkoholexposition zu einem Rückgang der Antikalzifizierungseffekte des Alkohols führen oder eine Rehydration des Gewebes erfordern.
Die Zeitdauer, die für die Exposition in den hierin beschriebenen Ausgestaltungen vorgesehen ist, ist illustrativ und kann von der fachkundigen Person abgeändert werden. In Ausgestaltungen der Erfindung, bei denen das Biomaterial in eine flüssige Behandlungslösung des Alkohols eingetaucht oder darin eingeweicht wird, liegt die Expositionsdauer vorzugsweise zwischen etwa 24 und 96 Stunden. Eine längere Exposition liegt allerdings im Rahmen der Erfindung, solange angemessene Lagerungsbedingungen wie nachfolgend beschrieben aufrechterhalten werden. Es ist zu beachten, dass während der vorgeschlagenen Zeitdauer keine nachteiligen Wirkungen auf das bioprothetische Gewebe beobachtet wurden.
Die Art und Weise, in der das Biomaterial dem Alkohol ausgesetzt wird, beinhaltet unter anderem eine Dampf-, Plasma-, Flüssigkeits- und/oder Tieftemperaturanwendung das Alkohols. Unabhängig vom Expositionsverfahren muss die Zeitspanne ausreichen, um Alkohol-Kollagen-Interaktionen zu fördern, die eine Kalzifizierung hemmen, aber sie darf nicht so lang sein, dass es einer irreparablen Dehydration des Gewebes durch den Alkohol kommt.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Alkaholbehandlungslflsung vorzugsweise flüssig und basiert auf Wasser, d. h. es ist eine wässrige Lösung mit mehr als etwa 50 Vol.-% Alkohol und vorzugsweise zwischen 60 und 80 Vol.-% Alkohol, die auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 und vorzugsweise zwischen 7,0 und 7,6, bevorzugter 7,4, gepuffert wird. Alternativ kann ein Gemisch aus zwei oder mehr organischen Lösungsmitteln in der Praxis der Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, das kombinierte Volumen der organischen Lösungsmittel Hegt über etwa 40%, vorzugsweise über etwa 50%. Ein Gemisch aus etwa 40% Ethanol und etwa 40% Aceton hat sich beispielsweise als wirksam erwiesen (s. Beispiel 7).
Zur Verwendung in der Praxis der Erfindung geeignete Puffer sind solche Puffer, die eine Pufferkapazität haben, die ausreicht, um einen physiologisch akzeptablen pH-Wert beizubehalten und keine nachteiligen Wirkungen auf das Biomatarial hat oder den Behandlungsprozess stört. Beispiele für Puffer sind unter anderem phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) und organische Puffer wie N-N-2-Hydroxyethylpiperzin-N'-2- ethansulfonsäure (HEPES) oder Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) sowie Puffer, die Borat, Bikarbonat, Karbonat, Kakodylat enthalten.
In bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung wird das Biomaterial, während es der Alkoholbehandlungslösung ausgesetzt wird, geschüttelt oder gerührt. Das Schütteln kann in einer beliebigen Weise wie beispielsweise unter Verwendung eines Rundschüttlers oder Schüttlerstativs erfolgen. Das Alkoholbehandlungsverfahren findet typischerweise bei Raumtemperatur (25ºC) statt. Allerdings ist jede Temperatur für die Praxis der Erfindung geeignet, die sich nicht nachteilig auf das Gewebe auswirkt, z. B. 4ºC bis etwa 37ºC.
Zwar bezieht sich die vorliegende Erörterung auf die Alkoholkonzentration in der Behandlungslösung, z. B. 50% oder mehr, aber es ist zu verstehen, dass Alkohole wie Ethanol rasch in Gewebe diffundieren, so dass die Alkoholkonzentration in Lösung etwa der regionalen Alkoholkonzentration im Gewebe entspricht. Folglich muss die Definition des Begriffs "Exposition" so allgemein ausgelegt werden, dass die In-situ-Freisetzung von Alkohol in implantiertem Gewebe eingeschlossen wird, wie die, die sich zum Beispiel aus der Hydrolyse von Tetraethylester ergibt.
In bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung muss das Biomaterial, das wie oben erwähnt mit Alkohol behandelt wird, um eine Kalzifizierung zu reduzieren, vor der Implantation oder Lagerung abgespült werden, um überschüssigen Alkohol und andere nachteilige Komponenten zu entfernen, die im Biomaterial-Behandlungsprotokoll erzeugt oder verwendet werden, wie Aldehydfragmente aus der Glutaraldehydvorbehandlung. Der hierin verwendete Begriff "Abspülen" beinhaltet das Behandeln des Biomaterials mit einer Spüllösung, einschließlich kontinuierlicher oder diskontinuierlicher Arbeitsweise, wobei das Biomaterial in eine Spüllösung gegeben wird, die regelmäßig entfernt und durch frische Lösung in vorbestimmten Abständen ersetzt werden kann. Während des Abspülens wird da? Gewebe vorzugsweise geschüttelt oder intermittierend gerührt, um eine gleichmäßige Verteilung dar Spüllösung zu gewährleisten. Das Abspülen kann durch Behandeln des Biomaterials mit einer Spüllösung wie frischem HEPES-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 erfolgen. Eine Abspülung kann beispielsweise das Einweichen des Biomaterials in frischer Spüllösung umfassen, die über einen Zeitraum von etwa 5 bis 15 Minuten dreimal ausgetauscht wird. Alternativ kann die Spüllösung in Abständen von 6 bis 8 Stunden oder weniger über eine Spüldauer von 24 Stunden ausgetauscht werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird dar HEPES-Puffer über eine Spüldauer von 24 Stunden jede Stunde ausgetauscht. Die längeren Spülperioden werden hierin als "Wäschen" bezeichnet.
Beispiele für Spüllösungen sind physiologisch geeignete Lösungen wie Wasser, Salzlösung, PBS, HEPES-gepufferte Salzlösung, Ringer-Lactat (pH 7,4), Natriumbikarbonat (pH 7,4), Tris (pH 7,4) und Imidazol (pH 7,4).
Nach dem Spülen ist das behandelte bioprothetische Gewebe für eine Implantation bereit oder kann sterilisiert und bis zur Verwendung gelagert werden. Eine Lagerung in standardmäßigen Glutaraldehydlösungen der Art, die gewöhnlich für die Langzeitlagerung von Bioprothetisch klinischer Qualität verwendet wird, kann die vorteilhaften Wirkungen, die von der erfindungsgemäßen Alkohohlbehandlung erreicht werden, teilweise rückgängig machen (s. Fig. 2). Gemäß einigen Ausgestaltungen der Erfindung kann das behandelte Biomaterial in einer Ethanol-Glutaraldehyd-Lösung aufbewahrt werden, vorzugsweise in einer Menge, die ausreicht, um eine Kalzifizierungshemmung und/oder Sterilität beizubehalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird das behandelte Biomaterial in einer gepuffertem Alkohollösung aufbewahrt, die Glutaraldehyd enthält und gewöhnlich mehr als etwa 60% und vorzugsweise zwischen etwa 60% und etwa 80% Alkohol und weniger als etwa 0,5%, vorzugsweise zwischen etwa 0,2% und 0,5%, Glutaraldehyd umfasst. In einer besonders bevorzugten. Ausgestaltung umfasst die Vorratslösung 60% Ethanol und 0,2% Glutaraldehyd (s. Tabelle 6 unten).
In anderen Ausgestaltungen der Erfindung werden Biomaterialien, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurden, in einer aldehydfreien Umgebung gelagert. In bevorzugten Ausgestaltungen werden behandelte Bioprothessn in sterile Beutel gelegt und einer sterilisierenden Bestrahlung wie einer Gammabestrahlung ausgesetzt. Selbstverständlich ist die erfindungsgemäße Ethanolbehandlung mit vielen anderen bekannten sterilisierenden Konservierungsmitteln und/oder -techniken kompatibel, die der fachkundigen Person bekannt sind oder von ihr entwickelt werden können.
Gemäß einer weiteren Verfahrensausgestaltung der Erfindung kann die Alkoholbehandlungslösung auch ein oder mehrere zusätzliche Antikalzifizierungsmittel, zu denen unter anderem ein lösliches Salz eines Metallkations wie Al&spplus;³ oder Fe&spplus;³ gehört, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 M bis 0,001 M enthalten. Zu wasserlöslichen Aluminiumsalzen, die geeignete zusätzliche Antikalzifizierungsmittel zur Verwendung Inder Praxis der vorliegenden Erfindung sind, gehören z. B. unter anderem Aluminiumchlorat, Aluminiumlactat, Aluminiumkaliumsulfat, Aluminiumnatriumsulfat, Aluminiumsulfet, Alumtniumiutrat und Alummiumchlorid. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das lösliche Salz AlCl&sub3; mit einer Konzentration von 0,1 M. Außerdem liegen insbesondere wasserlösliche Ferrisalze wie Ferrichlorid, Feninitrat, Ferribromid, Ferrinatriumedctat, Ferrisulfat und Ferriformiat im Rahmen der Erfindung. Selbstverständlich kann jedes Salz von Aluminium oder Eisen, das in dem Lösungsmittelsystem der Behandlungslösung löslich ist, in der Praxis der Erfindung verwendet werden.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung umfassen die Biomaterialien, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden. In bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung weisen diese Biomaterialien bessere Antikalzifizierungseigenschaften und/oder eine Langzeitbeständigkeit gegen pathologische In-vivo-Kalzifizierung auf.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung kann anhand, der folgenden ausführlichen Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen besser nachvollzogen werden. Dabei zeigt:
Fig. 1 eine graphische Darstellung der Kalzifizierungshemmung bei einer Aortenklappe vom Schwein in einem subdermalen Rattenmodell für Schweine-Aortenklappenproben (Cuspis), die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurden;
Fig. 2 ein« graphische Darstellung des Calciumgehalts (ug/mg) von Aortenklappenproben vom Schwein, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurden, nach einer 21- tägigen subdermalen Implantation in Ratten;
Fig. 3 eine graphische Darstellung des Calciumgehalts (ug/mg) von verschiedenen Aortenklappenproben vom Schwein, die 150 Tage lang in Schafen implantiert waren;
Fig. 4 eine graphische Darstellung des ¹&sup4;C Cholesterolgehalts (in ug/mg) von mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenklappen vom Schwein im Vergleich zu mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenklappen vom Schwein, die mit einer wässrigen Ethanollösung (40% und 80%) mit einem erfindungsgemäßen Verfahren oder mit einem Detergens (1% Natriumdodecylsulfat, SDS) behandelt wurden;
Fig. 5 eine graphische Darstellung des Kalzifizierungsgrads von mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenklappenproben vom Schwein, die mit einer Auswahl von Lösungsmitteln behandelt wurden, die bekanntlich Lipide von Gewebe entfernen; und
Fig. 6 eine graphische Darstellung von Ts (in ºC) für Aortenklappenproben vom Schwein, die verschiedenen Ethanolbehandlungs- und Lagerungssystemen unterzogen wurden.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Nachfolgend werden mehrere spezifische illustrative Techniken zur Herstellung kalzifizierungsbeständiger Biomaterialien gemäß den Prinzipien der Erfindung aufgeführt. Zwar sind die genannten Beispiele in erster Linie auf die Präparation kalzifizierungsbeständiger Herzklappen gerichtet, doch sind die hierin beschriebenen Techniken zur Erzeugung beliebiger anderer Biomaterialien anwendbar, vor allem für Prothesen oder bioprothetische Gewebe, die implantierbar sind, Obwohl die Ergebnisse in der Form von Studien in Verbindung mit subdermalen Implantaten in Ratten lind bioprothetischem Herzklappenersatz beim Schaf präsentiert werden, ist zu beachten, dass diese Tiermodellsysteme in Kalkablagerungen resultieren, die solchen, die bei klinisch-pathologischen Explantaten von menschlichem Gewebe gefunden wurden, sehr ähnlich sind. Die Übereinstimmung dieser Tiermadelle mit Humanpathologie wurde in Lichtmikroskop- und Elektronenmikroskopstudien dokumentiert.
Mit Glutaraldehyd vorbehandelte Aorten-Herzklappen vom Schwein, sowohl in Stent- als auch in Freestyle-(stentloser)-Form, wurden von St. Jude Medical, Inc., St. Paul, MN und von Medtronic, Inc., Irvine, CA erhalten und in den nachfolgend beschriebenen Beispielen verwendet. Typischerweise werden die Biomaterialien nach dem Ernten in Glutaraldehyd stabilisiert und konserviert, wie zum Beispiel in einer 0,5% Glutaraldehydlösung in einem Puffer.

Experimente:

1. Beispiel:

Es wurde eine Dosis-Effekt-Studie durchgeführt, deren Ergebnisse in Fig. 1 graphisch dargestellt sind. Mit Glutaraldehyd vorbehandelte Aortenklappenproben vom Schwein wurden. 24 Stunden lang in wässrigen Ethanollösungen mit einer Ethanolkonzentration von 0% (Kontrolle) bis 80% eingetaucht. Die Ethanollösungen wurden mit HEPES (0,05 M) auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffert. Die behandelten Aortenklappenproben vom Schwein wurden in zwei subkutane Taschen implantiert, die in die ventrale Bauchdecke entwöhnter Ratten (männlich, CD, Sprague-Dawloy, Gewicht 50-60 g) geschnitten wurden. Nach 21 Tagen wurden die Proben entfernt und auf eine Kalzifizierung hin untersucht, indem der Gehalt an Ca&spplus;²-Ionen in den Proben gemessen wurde. Mit Ethanolkonzentrationen von 50% oder darüber wurde die Calciumansammlung in den Aortenklappenproben vom Schwein im Vergleich zu den mit Glutaraldehyd vorbehandelten Proben praktisch eliminiert.

2. Beispiel:

Es wurden Studien an Aortenklappenproben vom Schwein durchgeführt, um die Expositionsdauer in der Alkoholbehandlungslösung zu bestimmen, die für optimale Antikalzifiziorungseffekte notwendig ist. Fig. 2 ist eins graphische Darstellung des Calciumgehalts (ug/mg) von mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenklapp«ncuspis-Proben vom Schwein nach einer Implantationsdauer von 21 Tagen in subdermalen Taschen in Ratten, die 24 Stunden und 72 Stunden lang 80% Ethanol ausgesetzt wurden. Typischerweise resultiert eine Expositionsdauer von 72 Stunden in Ethanol in einer höheren Calciumansammlung als eine Expositionsdauer von 24 Stunden. Allerdings war das Kalzifizierungsniveau nach einer 72-stündigen Expositionsdauer in Ethanol dennoch konsistent unter dem Niveau der Kontrollen (mit Glutaraldehyd vorbehandelte Aortenklappencuspis vom Schwein). Der Calciumgehalt der Kontrollproben betrug 178,2 ± 6,166 ug/mg Trockengewebe, wohingegen der Calciumgehalt der Proben, die 24 Stunden 80% Ethanol ausgesetzt und anschließend mit drei 100-ml-Porüonen an HEPES-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) über einen Zeitraum von etwa 10 bis 15 Minuten gespült wurden, 2,248 ± 0,186 ug/mg betrug. Dies repräsentiert eine Hemmung von 99%, d. h. eine wesentliche Hemmung.
In Fig. 2 wird der Calciumgehalt von ethanolbehandelten Aortenklappenproben vom Schwein dargestellt, die nachfolgend in einer glutaraldehydhaltigen Lösung abgespült oder aufbewahrt werden. In einem Fall ("Glut.Spülung") wurden die ethanolbehandelten Proben in drei 100- ml-Portionen von 0,2% Glutaraldehyd, auf einen pH-Wert von 7,4 (HEPES) gepuffert, über eine Spüldauer von etwa 15 Minuten abgespült. Im zweiten Fall ("Glut.Lagerung") wurden die ethanolbehandelten Proben in 0,2% Glutaraldehyd, auf einen pH-Wert von 7,4 (HEPES) gepuffert, 30 Tage lang aufbewahrt und dann mit HEPES-gepufferter Salzlösung vor der Implantation abgespült. Der Kontakt mit oder die Lagerung in einer glutaraldehydhaltigen Lösung führte zu einer stärkeren Calciumansammlung als bei den Proben, die nicht zusätzlich Glutaraldehyd ausgesetzt wurden.

3. Beispiel:

Das Spülen oder Waschen hatte eine signifikante Wirkung auf den Kalzifizierungsgrad in Studien mit subdermalen Implantaten in Ratten über einen Zeitraum von 21 Tagen und 60 Tagen, wie nachfolgend in Tabelle 1 angegeben ist. Tabelle 1 stellt den Calciumgehalt einer Reihe von Aortenherzklappenproben vom Schwein nach der Implantation in einer subdermalen Tasche in einer Ratte dar. Die Proben waren unbehandelte, mit Glutaraldehyd vorbehandelte Aortenherzklappen vom Schwein, die von St. Jude Medical, Inc. stammten (Kontrolle), sowie behandelte, mit Glutaraldehyd vorbehandelte Aortenherzklappen vom Schwein, die 24 Stunden lang 80% Ethanol ausgesetzt worden waren. Die mit 80% Ethanol behandelten Proben wurden dann einer allerletzten "Wäsche" (24 Stunden Eintauchen in HEPES-gepufferter Salzlösung (pH 7,4), stündlich gewechselt) oder "Spülung" unterzogen (definiert als drei einminütige 100-ml-Spülungen mit HEPES-gepufferter Salzlösung (pH 7,4)). Zusätzliche mit 80% Ethanol behandelte Proben wurden in einer Lösung aus 80% Ethanol und 0,2% Glutaraldehyd, die auf einen pH-Wert von 7,4 (HEPES) gepuffert war, einen Monat lang gelagert und dann einer "Spülung" oder "Wäsche" unterzogen. Tabelle 1
Proben von mit Glutaraldehyd vorbehandeltem Rinderperikard wurden mit 80% Ethanol behandelt und anschließend 24 Stunden lang gewaschen. Der Calciumgehalt von subdermalen Implantaten in Ratten betrug nach 21 Tagen 2,95 ± 0,78 ug/mg. Im Vergleich dazu lag der Calciumgehalt unbehandelter Kontrollproben bei 121,16 ± 7,49 ug/mg.

4. Beispiel

Es wurden Untersuchungen, an mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenherzklappenproben vom Schwein durchgeführt, um die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens für In- vivo-Kalzifizierungsbeständigkeit zu bewerten. Mit Glutaraldehyd vorbehandelte Herzklappenproben vom Schwein wurden von St. Jude Medical, Inc. (St, Jude) und von Medtronic, Inc., (Hancock I) erhalten. Die Kontrollproben wurden keiner Alkoholbehandlung unterzogen. Die Versuchsproben wurden 72 bis 96 Stunden lang mit 80% Ethanol behandelt. Die Kontroll- und Versuchsproben wurden in junge Schafe als Mitralklappenersatz implantiert. Fünf Monate nach der Implantation wurden die Klappen explantiert und auf ihren Calciumgehalt hin analysiert. Dia Ergebnisse sind in Fig. 3 enthalten, die eine graphische Darstellung des Calciumgehalts (ug/mg) der explantierten Proben (10 Schafe pro Gruppe) nach 150 Tagen ist. Eine komplette Kalzifizierungshemmung wird von der Ethanolbehandlung erbracht. Für einen Vergleich wird der Calciumgehalt von frischen, nicht implantierten Aortenherzklappenproben vom Schwein dargestellt.

5. Beispiel

Ohne uns durch eine bestimmte Theorie binden zu wollen, wird davon ausgegangen, dass der Alkohol die devitalisierte Membran von mit Glutaraldehyd vorbehandeltem bioprothetischem Gewebe irreversibel verändert. Protonen-NMR-Studien zeigen eine veränderte Assoziation mit Wasser nach der Alkohotbehandlimg. In Tabelle 2 sind die Ralaxationszeiten T1 und T2 für Protonen-NMR-Messungen (7,5 Tesla-Instrument) dargestellt, die an frischen Aortenherzklappenproben vom Schwein sowie an mit Glutaraldehyd vorbehandelten Proben und an mit Glutaraldehyd vorbehandelten Proben, die mit 80% Ethanol gemäß den Prinzipien der Erfindung behandelt wurden, durchgeführt wurden. Eine Behandlung mit Ethanol führt zu wesentlich längeren Relaxationszeiten T1 und T2, was auf eine wasserreiche Umgebung hinweist, die einer Calciumphosphatfällung weit weniger förderlich ist. TABELLE 2
* Aortenherzklappensegel wie gewonnen, ohne Behandlung (UNBEHANDELT); behandelt mit 0,6% Glutaraldehyd (GLUTARALDEHYD); behandelt mit 80% Ethanol (ETHANOL). Alls Behandlungslösungen waren auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffert.

6. Beispiel

Eine Alkoholbehandlung entfernt Cholesterol und Phospholipide fast komplett aus dem Gewebe und scheint die Aufnahme von Plasmalipoproteinen in das Biomaterial zu blockieren. Proben von mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenklappen (Cuspis) vom Schwein wurden einer Behandlung mit 40% Ethanol, 80% Ethanol und einem Detergens (1% SDS) über einen Zeitraum von 24 Stunden unterzogen. Als Kontrolle wurden unbehandelte, mit Glutaraldahyd vorbehandelte Aortenklappenproben vom Schwein genommen. Die Proben wurden 24 Stunden lang in eine Lösung aus ¹&sup4;C-Cholesterol in Rinderserum gegeben. Fig. 4 ist eine graphische Darstellung des Cholesterolgehalts (in ug/mg) der behandelten Proben und der Kontrolle. Es wurde festgestellt, dass die Cholesterolaufnahme durch Aortenklappenproben vom Schwein in Proben, die 24 Stunden lang 80% Ethanol ausgesetzt wurden, verringert war, was möglicherweise auf einen dauerhaften Materialeffekt hinweist, der die Aufnahme von Plasmalipoproteinen blockiert. Mit einem Detergens behandeltes Gewebe wies eine wesentlich höhere Cholesterolaufnahme auf.
In Tabelle 3 ist der gesamte Cholesterol-(CS) und Phospholipid-(PL)-Gehalt von mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenklappenproben vom Schwein dargestellt, die, wie darin angegeben, 24 Stunden lang mit gepufferten wässrigen Lösungen aus Alkohol oder Chloroform-Methanol behandelt wurden, Tabelle 3
* Mittel ± SEM (N-5)
Wie in Tabelle 3 zu sehen ist, wird mit einer 80%-Ethanol-Exposition praktisch der gesamte Cholesterol- und Phospholipidgehalt im Aortenklappengewebe vom Schwein beseitigt. Das Detergens (SDS) hatte eine wesentlich geringere Wirkung auf den Cholesterol- und Phospholipidgehalt im Gewebe im Vergleich zu 60% oder mehr Ethanol.

7. Beispiel

Weitere Lösungsmittel, die ebenfalls bekanntermaßen Cholesterol und Lipide extrahieren, wurden auf mögliche Antikalzifizierungseffekte hin untersucht. Proben von mit Glutaraldahyd vorbehandelten Aortenklappencuspis vom Schwein (Kontrolle) wurden 24 Stunden lang 80% Methanol, 80% Isopropanol, 80% Ethanol, Chloroform/Methanol (2 : 1), 80% Acetonitril und 80% Aceton ausgesetzt. Die Proben wurden 21 Tage lang in subdermale Taschen in Ratten implantiert; der Calciumgehalt wurde am Explantat ermittelt. Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 5 dargestellt. Zwar wiesen Methanol und Aceton vergleichbare Antikalzifizierungseffekte wie Ethanol auf, doch ist die Verwendung dieser Lösungsmittel problematisch, insofern als Methanolrückstände in einer Implantationsumgebung potentiell toxisch sind und Aceton krebserregend sein kann. Überraschenderweise war Chloroform/Methanol, die Standardlösung zum Extrahieren von Lipiden, wesentlich weniger effektiv als Ethanol.
In einer weiteren verwandten Studie wurde die kombinierte Konzentrationswirkung von 40% Ethanol und 40% Aceton beobachtet. Alleine ist keines dieser Lösungsmittel bei einer Konzentration von 40% wirksam (s. Fig. 1, Ethanolwirksamkeit bei einer Konzentration von 40%). Der Calciumgehalt implantierter Aortenherzklappenproben vom Schwein, die mit 40% Aceton behandelt wurden, lag nach 21 Tagen in einer subdermalen Tasche in einer Ratte bei 141,07 ± 28,91 ug/mg. Dagegen lag der Calciumgehalt von Proben, die einem Gemisch aus 40% Ethanol und 40% Aceton ausgesetzt wurden, bei 1,54 ± 0,16 ug/mg. Folglich kann ein Gemisch aus zwei oder mehr Lösungsmitteln in der Praxis der Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, das kombinierte Volumen der organischen Lösungsmittel liegt über 50%.

8. Beispiel:

Ts, ein wichtiges Maß der Materialfestigkeit, -Haltbarkeit und -integrität, bleibt durch die Ethanoibehandlung der vorliegenden Erfindung, wie in Fig. 6 zu sehen ist, fast völlig unbeeinflusst. Fig. 6 ist eins graphische Darstellung der Kollagen-Denaturierungstemperatur (ºC) für Proben von mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenklappen (Cuspis) vom Schwein, die verschiedenen Behandlungsprogrammen unterzogen wurden, insbesondere einer 24- stündigen Exposition in Ethanol (80% oder 100%) und einem Detergens (SDS). Die Programme beinhalten: 80% Ethanol ohne Spülung; 100% Ethanol ohne Spülung; 100% Ethanol mit anschließender Wäsche mit HEPES-gepufferter Salzlösung über einen Zeitraum von 1 Stunde; 80% Ethanol mit anschließender Spülung mit HEPES-gepufferter Salzlösung und. Lagerung in 0,2% Glutaraldehyd über einen Zeitraum von 24 Stunden; 1% SDS mit anschließender Spülung mit HEPES-gepufferter Salzlösung: und 1% SDS mit anschließender Wäsche mit HEPES-gepufferter Salzlösung über einen Zeitraum, von 1 Stunde. Die Kontrollen waren mit Glutaraldehyd vorbehandelte Aortenklappenproben vom Schwein von St. Jude Medical, Inc., die entweder wie erhalten ("Glut.") oder abgespült und gelagert in HEPES-gepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 über einen Zeitraum von 24 Stunden ("Glut/Puffer") verwendet wurden. Für den Erhalt von Daten wurde ein« Differentialscanningkalorimetrie durchgeführt. Eine Ethanoibehandlung, gefolgt von einer wässdgen Spülung und angemessenen Lagerungsbedingungen, hatte keinen Effekt auf Ts, wohingegen die Detergenzienbehandlung Ts wesentlich verringerte.
Zur Ermittlung der Zeitdauer, die zum Rehydrieren von Aortenklappenproben vom Schwein nach einer 24-stundigen Exposition in 80% Ethanol erforderlich ist, wurde eine Differentialscanningkalorimetrie durchgeführt. Der hierin verwendete Begriff "rehydrieren" bezieht sich auf die Wiederherstellung des Ts-Wertes der Kontrolle (mit Glutaraldehyd vorbehandelte Aortenklappenproben vom Schwein, die 24 Stunden lang in HEPES- gepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 gespült, wurden). Die mit Ethanol behandelten Proben (Cuspis) wurden mit HEPES-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) über verschiedene Zeiträume behandelt, die vom Abspülen (d. h. Gießen von Spüllösung über die Probe) bis zu einer Stunde reichten. Dia Ergebnisse sind in Tabelle 4 enthalten. Durch eine zweiminütige Abspülung kehrt der Ts-Wert der behandelten Proben zu einem Wart zurück, der sich, statistisch gesehen, nicht wesentlich von dem Ts-Wert der Kontrolle unterscheidet. TABELLE 4

9. Beispiel

Die Gesamtproteinzusammensetzung und Klappenmorphologie der Aortenklappen vom Schwein bleiben von der Alkohalbehandlung unbeeinflusst, wie anhand einer kompletten Aminosäureanalyse und Elektronenspektroskopie für chemische Analysen (ESCA) demonstriert wird. In der Tat wird durch eine Alkoholbehandlung die Oberflächenglättung und Anisotropie von Aortenklappensegel vom Schwein verbessert, was in einer Oberflächenchemie resultiert, die mit frischen Segeln vergleichbar ist. Im Gegensatz dazu weist mit Glutaraldehyd vorbehandeltes (Kontrolle) oder mit Detergens (SDS) behandeltes Gewebe erhebliche Unterschiede auf. In der folgenden Tabelle 5 sind die ESCA-Daten dar Oberflächen-Kohlenstoff-(Cls)-, Stickstoff-(Nls)- und Sauerstoff-(Ols)-Konzenirationen(%) in Aortenklappenproben vom Schwein enthalten, die 24 Stunden lang in die angegebene Lösung eingetaucht wurden. Tabelle 5
Komplette Aminosäureanalysen von ethanolbehandelten, mit Glutauraldehyd vorbehandelten Aortenklappen vom Schwein im Vergleich zu mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenklappen vom Schwein ergaben, dass die Ethanolbehandlung praktisch keinen Effekt auf die Aminosäurezusammensetzungen hat d. h. die Ethanolbehandlung extrahiert in keinem signifikanten Maße irgendeine der Proteinkomponenten von bioprothetischem Gewebe.
Eine In-vivo-Funktionsuntersuchung hinsichtlich der mechanischen und physiologischen Klappenfunktion zeigte, dass die mechanische Funktion durch die Ethanolbehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung verbessert wird.

10. Beispiel:

In einer Reihe von Experimenten zur Veranschaulichung zusätzlicher Ausgestaltungen der Erfindung wurden Proben von mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenklappen vom Schwein mit 60% Ethanol in einer Auswahl von Protokollen behandelt. Zwar schließt der Begriff "Aortenklappen vom Schwein" im Allgemeinen sowohl die Klappencuspis bzw. - segel als auch einen Aortenwandabschnitt ein, doch wurden die zuvor beschriebenen Experimente hauptsächlich an Klappencuspisgewebe durchgeführt. In den vorliegenden Experimenten wurden die beiden Gewebearten getrennt; ihre Daten sind in Tabelle 6 separat aufgeführt.
Als Kontrollen wurden mit Glutaraldehyd vorbehandelte bioprothetische Herzklappenproben von St. Jude Medical, Inc., verwendet. Proben des mit Glutaraldehyd vorbehandelten Gewebes wurden dann Behandlungslösungen aus 60% Ethanol oder 60% Ethanol und 0,1 M AlCl&sub3; 24 Stunden lang ausgesetzt. Nach der Ethanolbehandlung wurde das Gewebe 24 Stunden lang mit neutralem Puffer, insbesondere HEPES mit einem pH-Wert von 7,4, abgespült. Nach dem Abspülen wurden die Gewebeproben sterilisiert und 14 Tage lang gelagert. Im Rahmen einiger Lagerungsprotokolle wurde das Gewebe in neutralem Puffer verpackt und einer Sterilisationsbestrahlung unterzogen. Im Rahmen anderer Lagerungsprotokolle wurde das Gewebe in Lösungen aus 60% Ethanol und Glutaraldehyd (0,2% oder 0,5%) gelagert. In noch anderen Lagerungsprotokollen enthielt die Vorratslösung zusätzlich 0,1 M AlCl&sub3;.
Die wie oben beschrieben präparierten Gewebeproben wurden in subdermale Taschen in Ratten implantiert und nach 21 Tagen auf ihren Calciumgehalt hin untersucht. Dia Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 aufgeführt. 6. TABELLE
Wie in Tabelle 6 zu sehen ist, führt der Einschluss von Al&spplus;³ in die Behandlungslösung oder Vorratslösung in Ausgestaltungen, in denen das Biomaterial speziell Aortenwandgewebe ist. Zu einer weit stärkeren Kalzifizierungshemmung als die Behandlung mit einer Alkohollösung.

11. Beispiel:

Proben des mit Glutaraldehyd vorbehandelten Aortenwandgewebes vom Schwein wurden 24 Stunden lang mit wässrigen (pH 7,4 gepufferte HEPES) Behandlungslösungen aus 0,1 M FeCl&sub3;; 0,01 M FeCl&sub3;; 80% Ethanol; 80% Ethanol und 0,1 M FeCl&sub3;; und 80% Ethanol und 0,01 M FeCl&sub3; behandelt. Nach der Behandlung wurde das Gewebe mit drei 100-ml-Portionen von neutralem Puffer, insbesondere HEPES mit einem pH-Wert von 7,4, abgespült. Als Kontrollen wurden Proben von mit Glutaraldehyd vorbehandeltem Aortonwandgewebe vom Schwein von St. Jude Medical, Inc., verwendet. Die wie oben beschrieben präparierten Gewebeproben wurden in subdermale Taschen in Ratten implantiert und nach 21 Tagen auf ihren Calciumgehalt hin untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 enthalten. Tabelle 7
Aus Tabelle 7 ist ersichtlich, dass der Einschluss von Fe&spplus;³-Ionen in die Alkoholbehandlungs- und/oder Vorratslösungen zu einer verbesserten Kalzifizierungsbeständigkeit von Aortenwandproben vom Schwein führen.

Claims

1. Verfahren zur Behandlung eines Biomaterials, um genanntes Biomaterial kalzifizierungsbeständig zu machen, in dem ein Biomaterial, das ein Kollagenmaterial ist, das sich von einer Säugetierspezies herleitet, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Rinderperikard, Aorten-Herzklappen vom Schwein, Vena-saphena-Bypass-Grafts, Aorten-Homografts und Dura mater besteht, für eine prädeterminierte Zeitdauer mit einer flüssigen Behandlungslösung behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung im Wesentlichen aus einem höher als 50 Vol.-%igen wasserlöslichen aliphatischen C1-C3- Alkohol in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 besteht und dass die prädeterminierte Zeitspanne zwischen 20 Minuten und 96 Stunden betragt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung das Eintauchen des Biomaterials in die Behandlungslösung umfasst.

3. Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol in einer Menge zwischen ca. 60 und 80 Vol.-% bezogen auf die Behandlungslösung vorliegt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol in einer Menge von ca. 80 Vol.-% bezogen auf die Behandlungslösung vorliegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlungslösung auf einen pH-Wert in dem Bereich von 7,0 bis 7,6 gepuffert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlungslösung auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlungslösung weiter ein Antikalzifizierunsmittel enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikalzifizierungsmittel ein mehrwertiges Metallkation ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einem Al&spplus;³- und F&spplus;³-Salz besteht, das in der Behandlungslösung löslich ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikalzifizierungsmittel AlCl&sub3; in einem Konzentrationsbereich von ca. 0,1 M bis 0,001 M liegt.

10. Verfahren nach Anspruch, 1, worin das Biomatarial ein Aortenklappensegel und der Alkohol Ethanol ist.

11. Verfahren, nach Anspruch. 7, worin das Biomaterial eine Aortenklappenwand und das Antikalzifizierungsmittel ein Aluminiumsalz in Ethanol ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin, das Biomaterial vernetzt wurde.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Biomaterial mit Glutaraldehyd vernetzt wurde.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin der weitere Schritt des Aufbewahrens des behandelten Biomaterials in einer sterilen, glutaraldehydfreien Umgebung vorgesehen ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, worin der weiters Schritt des Aufbewahrens des behandelten Biomaterials in einer Aufbewahrungslösung aus einem niederen aliphatischen Alkohol und Glutaraldehyd vorgesehen ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Aufbewahrungslösung »ins wässrige Lösung ist, die ca. zwischen 60 und 80 vol.-%iges Ethanol und ca. zwischen 0,2% bis 0,5% Glutaraldehyd enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 1, worin der weitere Schritt des Sterilisierens des bioprothetischen Gewebes vorgesehen ist.