CN113499478B - 一种生物组织材料的处理方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种生物组织材料的处理方法，其特征在于，包括下述步骤：第一次固定：将所述生物组织材料放入戊二醛蒸气浴中进行第一次固定；第二次固定：将第一次固定后的生物组织材料放入亚胺溶液中进行第二次固定。本申请的方法采用戊二醛蒸气浴，能够增加戊二醛的渗透性及效率，同时尽可能保证在第一次固定时组织材料处于原始状态，避免常规戊二醛液体处理时由于渗透压等原因造成的渗透慢、渗透不充分、组织厚度变化等问题。

Description

一种生物组织材料的处理方法
技术领域
本申请涉及生物组织领域，尤其涉及一种生物组织材料的处理方法。
背景技术
人工生物瓣的瓣叶主要来源于猪主动脉瓣膜、牛心包等生物组织材料，而瓣叶钙化是导致其稳定性下降、功能损失的关键因素之一。这类材料主要由胶原纤维、弹性纤维和蛋白多糖组成，这些成分的分子链上具有氨基、羧基等基团，可以成为钙化位点，诱导材料钙化。同时，动物源性材料会经过脱细胞处理去除免疫原性，但是细胞的凋亡会引起磷脂代谢障碍，从而导致磷脂在组织材料中的累积。堆积的磷脂可成为钙化点，诱导钙离子的沉积，逐步导致瓣叶钙化，最终影响瓣膜功能。
目前，动物源生物组织材料一般会通过戊二醛在常温下对氨基进行交联固定以提高其稳定性、耐久度，但是只通过戊二醛处理的瓣叶在临床实验中的表现并不能达到预期效果，抗钙化能力弱。与此同时，作为交联剂，戊二醛渗透能力不强，导致交联效率受影响，会有交联时间长、交联不够充分等缺点。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供了一种生物组织材料的处理方法，该方法对材料进行双交联固定，第一次固定通过戊二醛蒸气浴交联氨基，第二次固定通过亚胺溶液交联羧基。经此方法处理的生物组织材料的抗钙化能力能得到很大的提升，提高了作为人工生物瓣叶的稳定性和耐久性。
本申请具体技术方案如下：
1.一种生物组织材料的处理方法，其特征在于，包括下述步骤：
交联氨基固定：将所述生物组织材料放入戊二醛蒸气浴中进行交联氨基固定；
交联羧基固定：将交联氨基固定后的生物组织材料放入亚胺溶液中进行交联羧基固定；
或者，包括下述步骤：
交联羧基固定：将所述生物组织材料放入亚胺溶液中进行交联羧基固定；
交联氨基固定：将交联羧基固定后的生物组织材料放入戊二醛蒸气浴中进行交联氨基固定。
2.根据项1所述的方法，其特征在于，交联氨基固定步骤中，所述戊二醛蒸气浴中戊二醛的浓度为0.1～10w/w％，优选为1～5w/w％；
优选地，交联氨基固定步骤中，蒸气温度为25～65℃，优选为35～55℃；
优选地，交联氨基固定步骤中，固定时间为4～240h，优选为8～36h。
3.根据项1或2所述的方法，其特征在于，交联羧基固定步骤中，所述亚胺选自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺、二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的任意一种或两种以上，优选为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺与N-羟基硫代琥珀酰亚胺；
优选地，交联羧基固定步骤中，所述亚胺溶液的浓度为0.1mM～1M，优选为10～150mM；
优选地，交联羧基固定步骤中，固定时间为2～240h，优选为6～72h。
优选地，交联羧基固定步骤中，固定温度为10～50℃，优选为20～35℃。
4.根据项1～3中任一项所述的方法，其特征在于，交联氨基固定步骤和交联羧基固定步骤后，还包括醇溶液浸泡步骤，将交联氨基和交联羧基固定后的生物组织材料放入醇溶液中浸泡。
5.根据项1～4中任一项所述的方法，其特征在于，醇溶液浸泡步骤中，所述醇选自甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-戊二醇和己二醇中的任意一种或两种以上；
优选地，醇溶液浸泡步骤中，所述醇溶液的浓度为60～90w/w％；
优选地，醇溶液浸泡步骤中，浸泡时间为6～72h。
6.根据项1～5中任一项所述的方法，其特征在于，醇溶液浸泡步骤后，还包括负载减轻溶液浸泡步骤，将醇溶液中浸泡后的生物组织材料放入负载减轻溶液中浸泡。
7.根据项1～6中任一项所述的方法，其特征在于，负载减轻溶液浸泡步骤中，以所述负载减轻溶液的总质量的百分比计，所述负载减轻溶液包括：10～40w/w％的醇、1～10w/w％的交联剂以及0.5～3w/w％的表面活性剂；
优选地，负载减轻溶液浸泡步骤中，所述醇选自甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-戊二醇和己二醇中的任意一种或两种以上；
优选地，负载减轻溶液浸泡步骤中，所述交联剂选自甲醛、京尼平和原花青素中的任意一种或两种以上；
优选地，负载减轻溶液浸泡步骤中，所述表面活性剂选自十二烷基硫代乙酸钠、Triton X-100、Tween 80、脂肪醇聚氧乙烯醚、硫代甜菜碱、十二烷基硫酸钠和脱氧胆汁酸钠中的任意一种或两种以上。
8.根据项1～7中任一项所述的方法，其特征在于，生物负载减轻溶液浸泡步骤后，还包括加热灭菌步骤，将生物负载减轻溶液中浸泡后的生物组织材料放入戊二醛溶液中进行加热灭菌。
9.根据项1～8中任一项所述的方法，其特征在于，加热灭菌步骤中，所述戊二醛溶液的浓度为0.2～2w/w％；
优选地，加热灭菌步骤中，所述加热灭菌的温度为30～50℃；
优选地，加热灭菌步骤中，所述加热灭菌的时间为12～48h。
10.根据项1～9中任一项所述的方法，其特征在于，加热灭菌步骤后，还包括封装保存步骤，将加热灭菌后的生物组织材料放入戊二醛溶液中封装保存；
优选地，封装保存步骤中，戊二醛溶液的浓度为0.2～1w/w％。
发明的效果
本申请的生物组织材料的处理方法，利用第一次固定和第二次固定的双交联固定方法处理生物组织材料，显著提高了生物组织材料的稳定性和耐久性。其中，第一次固定使用戊二醛蒸气浴加热交联氨基，蒸气浴特点在于能够有效增强分子运动、提高戊二醛渗透力、提高交联效率，同时尽可能保证在第一次固定时组织材料处于原始状态，避免戊二醛液体处理(常规方法)时由于渗透压等原因造成的渗透慢、渗透不充分、组织厚度变化等问题。相较于戊二醛溶液常温浸泡交联或加热浸泡交联，戊二醛蒸气浴加热交联的交联时间更短，效率更高；第二次固定采用亚胺溶液交联羧基，双交联固定后利用醇和负载减轻溶液对经双交联固定的生物组织材料进行去除残余磷脂，双交联固定有利于生物组织材料稳定性和耐久性的提高；原料来源广泛；制备方法简单易行。
具体实施方式
下面将对本申请做以详细说明。需要说明的是，通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”“包括”或“含有”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请提供了一种生物组织材料的处理方法，其特征在于，包括下述步骤：
交联氨基固定：将所述生物组织材料放入所述戊二醛蒸气浴中进行交联氨基固定；
交联羧基固定：将交联氨基固定后的生物组织材料放入亚胺溶液中进行交联羧基固定。
本申请还提供了一种生物组织材料的处理方法，其特征在于，包括下述步骤：
交联羧基固定：将所述生物组织材料放入亚胺溶液中进行交联羧基固定；
交联氨基固定：将交联羧基固定后的生物组织材料放入戊二醛蒸气浴中进行交联氨基固定。
在一个具体实施方式中，戊二醛蒸气浴的制备方法为：将浓度为1～50w/w％、优选为5～30w/w％的戊二醛溶液加热，加热温度40～130℃，优选为50～100℃，形成的蒸气混匀后通入戊二醛蒸气浴固定装置中。例如，所述戊二醛溶液的浓度可为1w/w％、5w/w％、10w/w％、15w/w％、20w/w％、25w/w％、30w/w％、35w/w％、40w/w％、45w/w％、50w/w％等，加热温度可为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃等。
本申请中，“固定”是指包括将生物组织暴露到一种或多种化学固定剂中，所述化学固定剂在给定胶原分子内的多肽链之间形成交联(即分子内交联)，或者在相邻胶原分子之间形成交联(即分子间交联)。
本申请的交联氨基固定用于交联氨基，交联羧基固定用于交联羧基。
在一个具体实施方式中，交联氨基固定步骤中，所述生物组织材料是经过清洗、裁剪的厚薄均匀的新鲜动物源组织材料。
本申请中的戊二醛蒸气浴中戊二醛的浓度是指戊二醛蒸气在蒸气浴中的浓度，蒸气浴由戊二醛蒸气和水蒸气组成。
在一个具体实施方式中，交联氨基固定步骤中，所述戊二醛蒸气浴的浓度为0.1～10w/w％，例如可为0.1w/w％、0.5w/w％、1w/w％、2w/w％、3w/w％、4w/w％、4.5w/w％、5w/w％、5.5w/w％、6w/w％、6.5w/w％、7w/w％、7.5w/w％、8w/w％、8.5w/w％、9w/w％、9.5w/w％、10w/w％等，优选为1～5w/w％。
在一个具体实施方式中，交联氨基固定步骤中，蒸气温度为25～65℃，例如可为25℃、30℃、35℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃等，优选为35～55℃；固定时间为4～240h，例如可为4h、6h、10h、12h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h、75h、80h、85h、90h、95h、100h、105h、110h、115h、120h、140h、160h、180h、200h、22h、240h等，优选为8～36h。
在一个具体实施方式中，交联羧基固定步骤中，所述亚胺选自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的任意一种或两种以上，例如可为EDC、DCC与NHS的混合物、EDC与Sulfo-NHS的混合物等，优选为EDC与Sulfo-NHS的混合物；所述亚胺溶液的摩尔浓度为0.1mM～1M，例如可为0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M等，优选为10～150mM。
在一个具体实施方式中，交联羧基固定步骤中，固定时间为2～240h，例如可为2h、4h、6h、10h、20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h、90h、100h、110h、120h、130h、140h、150h、160h、170h、180h、190h、200h、210h、220h、230h、240h等，优选为6～72h。
优选地，交联羧基固定步骤中，固定温度为10～50℃，优选为20～35℃。
在一个具体实施方式中，交联氨基固定步骤和交联羧基固定步骤后，还包括用于去除磷脂的醇溶液浸泡步骤，将交联氨基和交联羧基固定后的生物组织材料放入醇溶液中浸泡；所述醇选自甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-戊二醇和己二醇中的任意一种或两种以上，例如可为乙醇、乙二醇与异丙醇的混合物、甲醇与1,4-丁二醇的混合物等，优选为以乙醇为主要成分的混合醇溶液。
在一个具体实施方式中，醇溶液浸泡步骤中，所述醇溶液的浓度为60～90w/w％，例如可为60w/w％、62w/w％、64w/w％、66w/w％、68w/w％、70w/w％、72w/w％、74w/w％、76w/w％、78w/w％、80w/w％、82w/w％、84w/w％、86w/w％、88w/w％、90w/w％等；醇溶液浸泡步骤中，浸泡时间为6～72h，例如可为6h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h、72h等。
在一个具体实施方式中，醇溶液浸泡步骤后，还包括用于去除细菌和磷脂的负载减轻溶液浸泡步骤，将醇溶液中浸泡后的生物组织材料放入负载减轻溶液中浸泡；以所述负载减轻溶液的总质量的百分比计，所述负载减轻溶液包括：10～40w/w％的醇、1～10w/w％的交联剂以及0.5～3w/w％的表面活性剂，例如可为10w/w％、15w/w％、20w/w％、25w/w％、30w/w％、35w/w％、40w/w％等的醇，例如可为1w/w％、2w/w％、3w/w％、4w/w％、5w/w％、6w/w％、7w/w％、8w/w％、9w/w％、10w/w％等的交联剂，例如可为0.5w/w％、0.7w/w％、0.9w/w％、1w/w％、1.2w/w％、1.4w/w％、1.6w/w％、1.8w/w％、2w/w％、2.2w/w％、2.4w/w％、2.6w/w％、2.8w/w％、3w/w％等的表面活性剂。
在一个具体实施方式中，负载减轻溶液浸泡步骤中，所述醇选自甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-戊二醇和己二醇中的任意一种或两种以上；所述交联剂选自甲醛、京尼平和原花青素中的任意一种或两种以上；所述表面活性剂选自十二烷基硫代乙酸钠、Triton X-100、Tween 80、脂肪醇聚氧乙烯醚、硫代甜菜碱、十二烷基硫酸钠(SDS)和脱氧胆汁酸钠中的任意一种或两种以上。
在一个具体实施方式中，生物负载减轻溶液浸泡步骤后，还包括加热灭菌步骤，将生物负载减轻溶液中浸泡后的生物组织材料放入戊二醛溶液中进行加热灭菌；所述戊二醛溶液的浓度为0.2～2w/w％，例如可为0.2w/w％、0.4w/w％、0.6w/w％、0.8w/w％、1w/w％、1.2w/w％、1.4w/w％、1.6w/w％、1.8w/w％、2w/w％等。
在一个具体实施方式中，加热灭菌步骤中，所述加热灭菌的温度为30～50℃，例如可为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃等；所述加热灭菌的时间为12～48h，例如可为12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h等。
在一个具体实施方式中，加热灭菌步骤后，还包括封装保存步骤，将加热灭菌后的生物组织材料放入戊二醛溶液中封装保存，其中戊二醛溶液的浓度为0.2～1w/w％，例如可为0.2w/w％、0.3w/w％、0.4w/w％、0.5w/w％、0.6w/w％、0.7w/w％、0.8w/w％、0.9w/w％、1w/w％等。
利用本申请的生物组织材料的处理方法处理牛心包材料，使得处理后的牛心包材料的抗张强度大、热皱缩温度高、挂钙量低，相对于现有技术的处理方法处理的牛心包材料，热皱缩温度有所高、挂钙量显著降低。具体的，热皱缩温度均在80℃以上，甚至高达88℃，钙离子含量均低于1.0μg/mg，甚至可低至0.57μg/mg。
实施例
实施例1
首先，将浓度为8w/w％的戊二醛溶液加热，加热温度为55℃，形成的戊二醛蒸气混匀后通入戊二醛蒸气浴固定装置中，得到戊二醛蒸气浴。
然后，依次将新鲜牛心包依次放入3w/w％戊二醛蒸气浴(蒸气温度35℃)中交联固定48h、浓度为10mM的EDC溶液(固定温度为20℃)中交联固定60h、70％乙醇中浸泡36h、负载减轻溶液(30w/w％乙醇、3.5w/w％甲醛、1.6w/w％SDS)中浸泡8h、1.2w/w％戊二醛溶液(加热温度45℃)中浸泡24h，最后在0.3w/w％的常温戊二醛溶液中封装保存。
实施例2
首先，将浓度为5w/w％的戊二醛溶液加热，加热温度为30℃，形成的戊二醛蒸气混匀后通入戊二醛蒸气浴固定装置中，得到戊二醛蒸气浴。
然后，将新鲜牛心包依次放入3w/w％戊二醛蒸气浴(蒸气温度25℃)中交联固定48h、浓度为20mM的EDC/NHS溶液(固定温度为20℃)中交联固定48h、85w/w％乙醇中浸泡24h、负载减轻溶液(20w/w％乙醇、4w/w％甲醛、1.2w/w％Tween 80)中浸泡12h、0.6w/w％戊二醛溶液(加热温度50℃)中浸泡48h，最后在0.6w/w％的常温戊二醛溶液中封装保存。其中，EDC和NHS两者摩尔比为3：1。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，蒸气温度为55℃。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，蒸气温度为65℃。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，蒸气浴时间为36h。
实施例6
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，蒸气浴时间为4h。
实施例7
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，蒸气浴时间为8h。
实施例8
本实施例与实施例7的不同之处仅在于，蒸气戊二醛浓度为1w/w％。
实施例9
本实施例与实施例7的不同之处仅在于，蒸气戊二醛浓度为5w/w％。
实施例10
本实施例与实施例7的不同之处仅在于，蒸气戊二醛浓度为0.1w/w％。
实施例11
本实施例与实施例7的不同之处仅在于，蒸气戊二醛浓度为10w/w％。
实施例12
本实施例与实施例7的不同之处仅在于，亚胺溶液为EDC/Sulfo-NHS的混合溶液，其中EDC与Sulfo-NHS的摩尔比为10：1。
实施例13
首先，将浓度为8w/w％的戊二醛溶液加热，加热温度为55℃，形成的戊二醛蒸气混匀后通入戊二醛蒸气浴固定装置中，得到戊二醛蒸气浴。
然后，依次将新鲜牛心包依次放入浓度为10mM的EDC溶液(固定温度为20℃)中交联固定60h、3w/w％戊二醛蒸气浴(蒸气温度35℃)中交联固定8h、70％乙醇中浸泡36h、负载减轻溶液(30w/w％乙醇、3.5w/w％甲醛、1.6w/w％SDS)中浸泡8h、1.2w/w％戊二醛溶液(加热温度45℃)中浸泡24h，最后在0.3w/w％的常温戊二醛溶液中封装保存。
对比例1
将新鲜牛心包依次放入0.6w/w％的常温戊二醛溶液中固定48h、0.3w/w％的常温戊二醛溶液中固定240h、1w/w％戊二醛溶液(加热温度55℃)中浸泡24h，最后在0.6w/w％的常温戊二醛溶液中封装保存。
对比例2
依次将新鲜牛心包依次放入3w/w％戊二醛溶液(加热温度35℃)中交联固定48h、EDC/NHS溶液中交联固定48h、70％乙醇中浸泡36h、负载减轻溶液(30w/w％乙醇、3.5w/w％甲醛、1.6w/w％SDS)中浸泡8h、1.2w/w％戊二醛溶液(加热温度45℃)中浸泡24h，最后在0.3w/w％的常温戊二醛溶液中封装保存。其中，EDC和NHS两者摩尔比为3：1。
对比例3
依次将新鲜牛心包依次放入1w/w％戊二醛溶液(加热温度20℃)中交联固定12h、浓度为10mM的EDC溶液(固定温度为20℃)中交联固定60h、70％乙醇中浸泡36h、负载减轻溶液(30w/w％乙醇、3.5w/w％甲醛、1.6w/w％SDS)中浸泡8h、1.2w/w％戊二醛溶液(加热温度45℃)中浸泡24h，最后在0.3w/w％的常温戊二醛溶液中封装保存。
试验例
取160只成年大鼠，分为16组，每组10只，将各实施例和对比例的经过处理的牛心包植入各组大鼠皮下30天后，测定各组大鼠皮下的牛心包材料的抗张强度、热皱缩温和钙离子含量，对于每组的效果数据，为该组10只大鼠的测定数据的平均值，对比结果如表1所示，相对于对比例1～3的经过常温戊二醛溶液处理的牛心包材料，经本申请实施例1～13的用戊二醛蒸气处理的牛心包材料的挂钙量显著性降低，说明本申请提供的生物组织材料处理方法可以提高材料的抗钙化能力。
抗张强度测试是将样品裁成长条状(80*30mm)，测试方法参考QB/T2710-2018；热皱缩温度测试方法参考QB/T 1271-2012；钙离子含量的测试是将大鼠皮下植入30天的心包取出，根据GB 5009.268-2016方法对心包钙离子含量进行测定。
表1
Figure BDA0003152750420000101
Figure BDA0003152750420000111
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

Claims (16)

1.一种生物组织材料的处理方法，其特征在于，包括下述步骤：
交联氨基固定：将所述生物组织材料放入戊二醛蒸气浴中进行交联氨基固定；
交联羧基固定：将交联氨基固定后的生物组织材料放入亚胺溶液中进行交联羧基固定；
或者，包括下述步骤：
交联羧基固定：将所述生物组织材料放入亚胺溶液中进行交联羧基固定；
交联氨基固定：将交联羧基固定后的生物组织材料放入戊二醛蒸气浴中进行交联氨基固定；
其中，交联氨基固定步骤中，蒸气温度为35～55℃，固定时间为8～25h，所述戊二醛蒸气浴中戊二醛的浓度为1～3w/w％；
交联羧基固定步骤中，所述亚胺为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的混合物，所述亚胺溶液的浓度为10～150mM，固定时间为6～72h，固定温度为20～35℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，交联氨基固定步骤和交联羧基固定步骤后，还包括醇溶液浸泡步骤，将交联氨基和交联羧基固定后的生物组织材料放入醇溶液中浸泡。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，醇溶液浸泡步骤中，所述醇选自甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-戊二醇和己二醇中的任意一种或两种以上。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，醇溶液浸泡步骤中，所述醇溶液的浓度为60～90w/w％。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，醇溶液浸泡步骤中，浸泡时间为6～72h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，醇溶液浸泡步骤后，还包括负载减轻溶液浸泡步骤，将醇溶液中浸泡后的生物组织材料放入负载减轻溶液中浸泡。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，负载减轻溶液浸泡步骤中，以所述负载减轻溶液的总质量的百分比计，所述负载减轻溶液包括：10～40w/w％的醇、1～10w/w％的交联剂以及0.5～3w/w％的表面活性剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，负载减轻溶液浸泡步骤中，所述醇选自甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、2,3-戊二醇和己二醇中的任意一种或两种以上。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，负载减轻溶液浸泡步骤中，所述交联剂选自甲醛、京尼平和原花青素中的任意一种或两种以上。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，负载减轻溶液浸泡步骤中，所述表面活性剂选自十二烷基硫代乙酸钠、Triton X-100、Tween 80、脂肪醇聚氧乙烯醚、硫代甜菜碱、十二烷基硫酸钠和脱氧胆汁酸钠中的任意一种或两种以上。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，生物负载减轻溶液浸泡步骤后，还包括加热灭菌步骤，将生物负载减轻溶液中浸泡后的生物组织材料放入戊二醛溶液中进行加热灭菌。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，加热灭菌步骤中，所述戊二醛溶液的浓度为0.2～2w/w％。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，加热灭菌步骤中，所述加热灭菌的温度为30～50℃。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，加热灭菌步骤中，所述加热灭菌的时间为12～48h。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，加热灭菌步骤后，还包括封装保存步骤，将加热灭菌后的生物组织材料放入戊二醛溶液中封装保存。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，封装保存步骤中，戊二醛溶液的浓度为0.2～1w/w％。
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