CN109125810A - 一种生物瓣膜的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生物瓣膜的制备方法，包括如下步骤：S1：将生物组织材料进行脱细胞处理，得到脱细胞处理后的生物组织；S2：将脱细胞处理后的生物组织浸没在含有GAG的缓冲溶液中；S3：将经过S2处理后的生物组织利用GAG交联剂溶液进行交联处理；S4：将经过S3处理后的生物组织经过清洗液清洗，然后再利用胶原蛋白交联剂溶液进行交联处理；S5：将经过S4处理后的生物组织利用清洗液清洗，得到生物瓣膜。通过本发明处理的生物组织制备得到的生物瓣膜，可显著减轻甚至消除组织褶皱，降低组织弯曲产生的应力，增强组织的柔顺性，提高组织材料的使用率，大大降低生产成本。

Description

一种生物瓣膜的制备方法
技术领域
本发明属于医疗器械领域，涉及一种生物瓣膜的制备方法。
背景技术
人工生物瓣膜主要采用猪主动脉瓣膜、牛心包和猪心包等动物源性生物组织材料制备而成，这类生物组织材料主要由胶原纤维、弹性纤维和GAG等组成。
动物源性生物组织材料在制备人工生物瓣膜的过程中，一般都会经戊二醛固定处理，但经过戊二醛固定处理后的组织会变硬，在组织弯曲时易形成褶皱。制备好的人工生物瓣膜在植入体内后，瓣叶在启闭过程中,在沿瓣架处会急剧弯曲形成褶皱，导致瓣叶中的胶原纤维极易损伤。一旦胶原纤维受损,生物组织的抗拉强度将大大降低，如果胶原纤维受损严重,易造成瓣叶撕裂，导致生物瓣膜耐久性降低。
在整个瓣膜损坏的过程中，沿瓣架处的弯曲挤压的应力起着主要作用。因此，在改进生物瓣的固定处理方法和抗钙化方法时,应当考虑机械应力,特别是怎样降低褶皱，减少弯曲变形的应力。研究发现，氨基聚糖(Glycosaminoglycans,GAG)是重复二糖单位构成的无分枝长链多糖，由许多硫酸基和羰基而带负电荷，能支撑较大的压缩载荷，起到“分子弹簧”的作用，广泛存在于心脏瓣膜和其他心血管结缔组织。在瓣膜运动过程中，GAG可以保持水化的环境，由于其“分子弹簧”的作用，在瓣叶弯曲时起到缓冲作用，能够降低组织弯曲时的应力，达到消除褶皱的作用。
人工生物瓣膜在制备过程中一般由0.2％～0.6％(V/V)戊二醛缓冲液交联处固定，但戊二醛不能固定瓣膜组织中的GAG，导致组织中的GAG在组织清洗、固定、保存等处理工艺中一直丢失。因此降低GAG的丢失对减轻或消除组织的褶皱有着重要作用。
现有技术中公开了一种采用硫酸新霉素预处理，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(EDC/NHS)和戊二醛交联来固定心瓣组织的方法，这种制备方法可以避免GAG的丢失，从而降低瓣叶的褶皱。但硫酸新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，在后续的交联中可能与胶原的羧基反应保留在组织中，从而导致一定的毒性和引起过敏性反应，对人体造成不适。现有技术中还公开了一种采用1,6-己二胺和EDC/NHS固定处理动物源性生物组织的方法，以提高组织的抗钙化效果；另外，也有技术公开了采用氨基封闭剂、EDC/NHS和填充剂(Jeffamine)交联动物源胶原基材料的方法，以提高胶原材料的拉伸强度。但这些技术只是采用EDC/NHS来交联生物组织，并没有公开怎样保留GAG和怎样降低组织褶皱。
综上可以看到，目前还没有一种人工生物瓣膜的制备方法，能够在不影响人工生物瓣膜安全性的同时，尽可能避免GAG的丢失，以提高制备得到的人工生物瓣膜的耐久性。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种抗钙化性能和耐久性效果好的人工生物瓣膜的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种生物瓣膜的制备方法，包括如下步骤：
S1：将生物组织材料进行脱细胞处理，得到脱细胞处理后的生物组织。
S2：将所述脱细胞处理后的生物组织浸没在含有GAG的缓冲溶液中。
S3：将经过所述S2处理后的生物组织利用GAG交联剂溶液进行交联处理。
S4：将经过所述S3处理后的生物组织经过清洗液清洗，然后再利用胶原蛋白交联剂溶液进行交联处理。
S5：将经过所述S4处理后的生物组织利用清洗液清洗，得到所述生物瓣膜。
进一步的，上述制备方法还包括S6：将所述S5中制备得到的所述生物瓣膜保存在戊二醛溶液或甘油溶液中。
进一步的，所述S1中，所述生物组织材料为异种或同种的生物组织材料。
进一步的，所述生物组织材料选自牛心包、猪心包，马心包和猪主动脉瓣膜中的一种或多种组合。
进一步的，所述S1中，对生物组织材料进行脱细胞处理的方法为低渗振荡处理法、表面活性剂法、反复冻融法和酶处理法中的一种或多种组合。
进一步的，所述S2中，所述GAG选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素的一种或多种组合。
进一步的，所述透明质酸为分子量5000Da至1000000Da的低分子质量透明质酸，或者1000000Da至2500000Da的高分子质量透明质酸。
进一步的，所述硫酸软骨素选自分子量为1000Da至20000Da的低分子硫酸软骨素，或分子量为1000Da至25000Da的低分子多硫酸化硫酸软骨素及其异构体。
进一步的，所述硫酸皮肤素选自分子量为1000Da至10000Da的低分子硫酸皮肤素，或分子量为1000Da至15000Da的低分子多硫酸化硫酸皮肤素。
进一步的，所述肝素的分子量为2000Da至10000Da。
进一步的，所述S2中，所述含有GAG的缓冲溶液中GAG的质量体积浓度为0.0001-10％(W/V)。
进一步的，所述含有GAG的缓冲溶液中GAG的质量体积浓度为0.001-0.1％(W/V)。
进一步的，所述S2中，所述含有GAG的缓冲溶液的pH值为6.8-8.6，缓冲液选自磷酸盐缓冲液、D-Hanks溶液和哌嗪乙磺酸溶液中的一种。
进一步的，所述S2的反应条件为：反应温度为0-37℃、反应时间为0.5-72小时。
进一步的，所述S3中，所述GAG交联剂选自碳化二亚胺及其盐类、磷正离子型缩合剂、脲正离子型缩合剂、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐及其衍生物、高碘酸钠、高碘酸钾、2-氯-N-十二烷基吡啶盐碘化物及其衍生物和2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物及其衍生物中的一种或多种组合。
进一步的，所述碳化二亚胺及其盐类选自1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，二异丙基碳二亚胺，二环己基碳二亚胺和1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐中的一种或多种组合。
进一步的，含有所述碳化二亚胺及其盐类的GAG交联剂中还添加有N-羟基苯并三氮唑或N-羟基-琥珀酰亚胺，所述N-羟基苯并三氮唑或N-羟基-琥珀酰亚胺与所述碳化二亚胺及其盐类的摩尔浓度比例为1:100。
进一步的，所述磷正离子型缩合剂选自苯并三氮唑-1-基氧-三(四氢吡咯基)鏻鎓六氟磷酸盐、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐和三吡咯烷基氯化鏻六氟磷酸盐中的一种或多种组合。
进一步的，所述脲正离子型缩合剂选自O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐、O-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐和O-(N-丁二酰亚胺基)-二(二甲胺基)碳鎓四氟硼酸盐中的一种或多种组合。
进一步的，所述S3中，所述GAG交联剂溶液的质量体积浓度为0.0001-10％(W/V)。
进一步的，所述S3中，所述GAG交联剂溶液的质量体积浓度为0.0001-0.1％(W/V)。
进一步的，所述S3中，所述GAG交联剂溶液采用的溶剂选自HEPES溶液、吗啉乙磺酸溶液、吗啉丙磺酸溶液和哌嗪二乙磺酸溶液中的一种，所述GAG交联剂溶液的pH值为4.0-7.5。
进一步的，所述S3的反应条件为：反应温度为0-37℃、反应时间为0.5-120小时。
进一步的，所述S4和S5中，所述清洗液选自氯化钠生理盐水、磷酸盐缓冲液和HEPES溶液中的一种。
进一步的，所述胶原蛋白交联剂选自戊二醛、1,6-己二异氰酸酯、京尼平、原花青素和单宁酸溶液中的一种或多种组合，其中，所述戊二醛溶液的体积浓度为0.1-1％(V/V)，所述1,6-己二异氰酸酯、京尼平、原花青素和单宁酸溶液的质量体积浓度为0.1-1wt％。
进一步的，所述S4中，利用胶原蛋白交联剂溶液进行交联处理的反应条件为：反应温度为2-37℃、反应时间为0.5-72小时。
进一步的，所述S6中，所述戊二醛溶液的pH值为6.8-8.6，戊二醛的体积分数为0.1-0.625％(V/V)；所述甘油溶液的pH值为6.8-7.6，甘油的体积分数为30-100％(V/V)。
与现有技术相比，本发明提供的一种生物瓣膜的制备方法，具备如下优点：生物组织经过脱细胞处理去除了组织中的细胞和相关降解酶(例如透明质酸酶、硫酸软骨素酶和明胶酶等)，细胞原先占据的空间被预留下来，而且消除相关降解酶对GAG成分的降解，最大程度保留组织中原先的GAG成分与结构。在脱细胞处理后将组织浸入含GAG成分的缓冲溶液中，原先细胞的空间位点可被GAG成分填充，增加组织中GAG的成分，且降低组织中的空隙，防止组织结构因GAG成分的丢失而产生组织塌陷，可减少钙盐在空隙中的沉积，提高组织的抗钙化性能和耐久性。同时，经过脱细胞处理后组织中引起钙化的磷脂、细胞膜成分被去除，提高组织的抗钙化性能。
而且，用GAG交联剂可将添加的GAG成分和原先组织中GAG成分的羧基与胶原纤维、弹性纤维的氨基交联形成牢固的酰胺键，将这些游离型的GAG成分和原先组织中的GAG永久性保留在组织中。
另一方面，GAG交联剂不仅将GAG交联到组织中，且可帮助胶原分子的羧基和氨基交联形成酰胺键，起到“催化剂”的作用。
此外，经过GAG交联剂交联的组织再用胶原蛋白交联剂，特别是使用戊二醛蒸汽雾化可提高戊二醛在组织中的渗透性，形成双交联工艺，进一步提高组织交联度，增强组织力学性能和耐久性。
通过本发明处理的生物组织制备得到的生物瓣膜，可显著减轻甚至消除组织褶皱，降低组织弯曲产生的应力，增强组织的柔顺性，提高组织材料的使用率，大大降低生产成本。
附图说明
图1是本发明提供的一种生物瓣膜的制备方法的流程示意图；
图2是本发明实施例1的对照组中直接通过戊二醛固定的牛心包组织弯曲后褶皱程度图片；
图3是本发明实施例1的实验组中生物瓣膜组织弯曲后褶皱程度图片；
图4是本发明实施例1的对照组中直接通过戊二醛固定的牛心包组织植入大鼠皮下后的钙化沉积图；
图5是本发明实施例1的实验组中生物瓣膜组织植入大鼠皮下后的钙化沉积图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种生物瓣膜的制备方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。
图1是本发明提供的一种生物瓣膜的制备方法的流程示意图。
本发明提供的制备方法包括如下步骤：
S1：将生物组织材料进行脱细胞处理，得到脱细胞处理后的生物组织。
其中，生物组织材料可以为同种或异种的生物组织材料，例如选自牛心包、猪心包，马心包和猪主动脉瓣膜中的任一种。处理生物组织的脱细胞方法没有特别的限制，只要能除去组织中的细胞及相关降解酶、组织中引起钙化的磷脂、细胞膜成分，提高组织的抗钙化性能即可。脱细胞处理的方法包括：低渗振荡处理法、表面活性剂法、反复冻融法、酶处理法等，或者以上方法的组合。
S2：将所述脱细胞处理后的生物组织浸没在含有GAG的缓冲溶液中。
优选的，S2步骤的处理时间可以为0.5-72h，温度控制在0-37℃。
其中，所述GAG选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素的一种或多种组合。透明质酸可以是分子量为5000Da至1000000Da的低分子质量透明质酸，或者1000000Da至2500000Da的高分子质量透明质酸。硫酸软骨素选自分子量为1000Da至20000Da的低分子硫酸软骨素，或分子量为1000Da至25000Da的低分子多硫酸化硫酸软骨素及其异构体。硫酸皮肤素选自分子量为1000Da至10000Da的低分子硫酸皮肤素，或分子量为1000Da至15000Da的低分子多硫酸化硫酸皮肤素。肝素的分子量为2000Da至10000Da。
含有GAG的缓冲溶液中GAG的质量体积浓度为0.0001-10％(W/V)，优选为0.001-0.1％(W/V)。其中的GAG如果为上述化合物的组成的混合物，则混合物中各组分的添加量没有特别的限制。优选的，当含有两种组分时，每种组分的重量百分比为5-95％；当含有三种组分时，每种组分的重量百分比为5-90％；当含有四种组分时，每种组分的重量百分比为5-85％；当含有五种组分时，每种组分的重量百分比为5-80％；当含有六种组分时，每种组分的重量百分比为5-75％。
另外，所述GAG缓冲溶液，其pH值为6.8-8.6。缓冲液可以为：磷酸盐缓冲液、D-Hanks溶液和哌嗪乙磺酸溶液(HEPES)中的一种。
S3：将经过所述S2处理后的生物组织利用GAG交联剂溶液进行交联处理。
优选的，交联处理的温度为0-37℃，时间为0.5-120h。
其中，所述GAG交联剂选自碳化二亚胺及其盐类、磷正离子型缩合剂、脲正离子型缩合剂、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐及其衍生物、高碘酸钠、高碘酸钾、2-氯-N-十二烷基吡啶盐碘化物及其衍生物和2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物及其衍生物中的一种或多种组合。
进一步的，所述碳化二亚胺及其盐类可以选自1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，二异丙基碳二亚胺，二环己基碳二亚胺和1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐中的一种或多种组合。另外，优选的，含有所述碳化二亚胺及其盐类的GAG交联剂中还添加有N-羟基苯并三氮唑或N-羟基-琥珀酰亚胺，所述N-羟基苯并三氮唑或N-羟基-琥珀酰亚胺与所述碳化二亚胺及其盐类的摩尔浓度比例为1:100。
所述磷正离子型缩合剂可以选自苯并三氮唑-1-基氧-三(四氢吡咯基)鏻鎓六氟磷酸盐、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐和三吡咯烷基氯化鏻六氟磷酸盐中的一种或多种组合。
所述脲正离子型缩合剂可以选自O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐、O-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐和O-(N-丁二酰亚胺基)-二(二甲胺基)碳鎓四氟硼酸盐中的一种或多种组合。
所述GAG交联剂溶液采用的溶剂选自HEPES溶液、吗啉乙磺酸溶液、吗啉丙磺酸溶液和哌嗪二乙磺酸溶液中的一种，所述GAG交联剂溶液的pH值为4.0-7.5，其中，所述GAG交联剂溶液的质量体积浓度为0.0001-10％(W/V)，优选为0.0001-0.1％(W/V)。
S4：将经过所述S3处理后的生物组织经过清洗液清洗，然后再利用胶原蛋白交联剂溶液进行交联处理。
优选的，处理的反应温度为2-37℃，时间为0.5-72h。
其中，所述清洗液为氯化钠生理盐水、磷酸盐缓冲液和HEPES溶液中的一种。
这里添加胶原蛋白交联剂目的是为了增加胶原蛋白分子之间、以及胶原蛋白分子与其他分子之间的连接，提高胶原蛋白的交联度和相对分子质量，使交联后的生物组织稳定性提高、抗酶解能力增强、力学性能稳定。本发明中的所述胶原蛋白交联剂可以选自本领域现有任一的交联剂，例如戊二醛、1,6-己二异氰酸酯、京尼平、原花青素和单宁酸中的一种或多种组合。进一步，所述戊二醛溶液的体积浓度为0.1-1％(V/V)。更优选，将所述戊二醛溶液雾化处理后再与清洗后的生物组织交联反应。此外，1,6-己二异氰酸酯、京尼平、原花青素和单宁酸溶液的质量体积浓度优选为0.1-1wt％。
S5：将经过所述S4处理后的生物组织利用清洗液清洗，得到所述生物瓣膜。
其中，所述清洗液选自氯化钠生理盐水、磷酸盐缓冲液和HEPES溶液中的一种，优选磷酸盐缓冲液和HEPES溶液pH值为6.8-7.6。
S6：将所述S5中制备得到的所述生物瓣膜保存在戊二醛溶液或甘油溶液中。
其中，所述戊二醛溶液的pH值为6.8-8.6，戊二醛的体积分数为0.1-0.625％(V/V)；所述甘油溶液的pH值为6.8-7.6，甘油的体积分数为30-100％(V/V)。
经过本发明提供的上述制备方法制备的生物瓣膜，可以通过如下几个指标对其性能进行评价，具体包括如下五个指标。
1、生物组织材料表面褶皱比较：将制备得到的生物瓣膜的组织裁成30*40mm的试块，去除表面水分，弯曲后在显微镜下观察褶皱程度。
2、大鼠皮下植入试验和钙化检测：选用雄性幼年Wistar大鼠，麻醉后在无菌条件下沿大鼠背部做出切口，将大小为10mm*10mm的生物瓣膜的组织片植入后缝合切口，饲养8周。8周后，用二氧化碳气体窒息处死，取出组织片，用10％的中性福尔马林固定，石蜡包埋，然后切成0.4微米厚的薄片，经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，冯库萨染色，观察钙化程度。
3、生物组织材料的热皱缩温度：从生物瓣膜的组织片上裁取6根50mm*3mm的试条，以蒸馏水为介质，在皮革收缩温度测定仪上测定其热皱缩温度。
4、GAG检测：通过测定己糖胺含量来分析GAG总含量。将冻干的生物瓣膜组织和标准品(氨基葡萄糖)经过2M盐酸在95℃下水解，与乙酰丙酮高温下反应，然后再与对二甲氨基苯甲醛反应，将反应后的溶液在540nm处测定吸光值。
5、胶原的交联度：由于三硝基苯硫酸(TNBS)在碱性条件下可与氨基酸的伯氨基反应生成三硝基苯衍生物，通过检测其紫外吸光度值来测量交联胶原基质中自由氨基数量，因此，可以自由氨基数量的变化来表征胶原的交联度。具体操作如下：向生物瓣膜的组织中加4w/v％碳酸氢钠溶液1mL和0.5w/v％TNBS溶液1mL，于40℃水浴下加热4小时，然后加6M盐酸溶液3mL继续加热，使组织材料完全溶解，经稀释后摇匀，测定溶液在346nm处的吸收值。其中，生物瓣膜组织的交联度(％)＝(1-交联后胶原吸光度/未交联胶原吸光度)*100％。
为了进一步理解本发明，下面将结合更加详细具体的实施方式对本发明的优选方案进行描述，以凸显本发明提供的人工瓣膜的制备方法的特点和特征。这些描述只是举例说明本发明方法的特征和优点，而非限制本发明的保护范围。下述实施例中，胶原蛋白交联剂溶液如没有特别指出，应理解为胶原蛋白交联剂水溶液。
实施例1
一种人工生物瓣膜的制备方法包括如下步骤：
S1：从屠宰厂中获取牛心包组织，经过脂肪剥离、修剪和清洗后，采用低渗溶液(pH值为7.4)振荡和1％(w/v)辛基吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich Co.LLC.)联合脱细胞处理。
S2：将处理后的牛心包浸没在含有0.02％(w/v)硫酸皮肤素(Sigma-AldrichCo.LLC.)的HEPES(Sigma-Aldrich Co.LLC.)溶液(pH值为7.4)中24h，取出组织。
S3：将上述S2处理的组织用含0.006％(w/v)N-羟基-琥珀酰亚胺(Sigma-AldrichCo.LLC.)和0.03％(w/v)1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(上海晶纯生化科技股份有限公司)的吗啉乙磺酸(上海晶纯生化科技股份有限公司)溶液(pH值为5.5)交联24h。
S4：将上述经过S3交联处理后的组织用HEPES溶液(pH值为7.4)清洗5次，之后再放入0.5％(V/V)戊二醛(Sigma-Aldrich Co.LLC.)溶液(pH值为7.4)中再交联3天。
S5：最后将组织用生理盐水(华仁药业股份有限公司)清洗，得到生物瓣膜。
S6：将生物瓣膜保存在0.2％(V/V)戊二醛溶液(pH值为7.4)中。
将经过上述步骤制备得到的生物瓣膜组织作为实验组，以直接通过戊二醛固定的牛心包组织作为对照组，按照上述五种指标的评价方法，对实验组和对照组的五种指标进行评价。
首先，请参照图2和图3，图2为对照组中直接通过0.5％(V/V)戊二醛溶液固定3天的牛心包组织弯曲后褶皱程度图片，图3为本发明实施例1实验组的生物瓣膜组织弯曲后褶皱程度图片。对比我们可以看到，图2中，对照组的牛心包组织经弯曲后褶皱明显，褶皱较严重，而图3中，本发明实验组的生物瓣膜组织弯曲后无明显褶皱。两者比较有明显差异，证明经过本发明实施例1处理后的组织的抗弯曲褶皱效果有显著提高。
请参考图4和图5，图4为对照组中直接通过0.5％(V/V)戊二醛溶液固定3天的牛心包组织植入大鼠皮下后的钙化沉积图，图5为本发明实施例1实验组的生物瓣膜组织植入大鼠皮下后的钙化沉积图。可以看到，图4中，对照组发现有大量钙盐沉积，钙化程度严重；而图5中，实验组无明显钙盐沉积。两者比较有明显差异，证明经过本发明实施例1处理后的组织的抗钙化效果有显著提高。
对对照组和实验组的组织进行热皱缩温度测试、GAG含量测试和胶原的交联度测试，结果如下表1。
表1实施例1中对照组和实验组的热皱缩温度测试、GAG含量测试和胶原的交联度测试结果
从表1的结果分析，可发现实验组的3项测试指标均高于对照组，而热皱缩温度和交联度与组织强度直接相关，证明经过本发明实施例1处理得到的生物瓣膜组织的强度得到提高，耐久性有明显增强。
实施例2
本实施例中人工生物瓣膜的制备方法与实施例1相似，具体包括如下步骤：
S1：从屠宰厂获取猪心包组织，经过脂肪剥离、修剪和清洗后，采用1％的TritonX-100(w/v)(上海晶纯生化科技股份有限公司)进行脱细胞处理。
S2：将处理后的猪心包浸没在含有0.008％(w/v)硫酸皮肤素和0.002％硫酸软骨素(Sigma-Aldrich Co.LLC.)的HEPES溶液(pH值为7.4)中12h，取出组织。
S3：将上述S2处理后的组织用含0.02％(w/v)4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(苏州昊帆生物股份有限公司)的吗啉丙磺酸(上海晶纯生化科技股份有限公司)溶液(pH值为5.0)交联24h。
S4：将上述经过S3交联处理后的组织用磷酸盐缓冲液(上海晶纯生化科技股份有限公司)溶液(pH值7.3)清洗5次，之后再放入0.6％(V/V)京尼平溶液(pH值为7.4)中再交联5天。
S5：最后将组织用生理盐水清洗，得到生物瓣膜。
S6：将生物瓣膜保存在60％(V/V)甘油溶液(pH值为7.4)中。
将经过上述步骤制备得到的生物瓣膜组织作为实施例2的实验组，以直接通过0.5％(V/V)戊二醛溶液固定3天的猪心包组织作为对照组，对实验组和对照组的热皱缩温度、胶原的交联度以及GAG含量三种指标进行测试。测试得到的结果如下表2所示。
表2实施例2中对照组和实验组的热皱缩温度测试、胶原的交联度测试和GAG含量测试结果
从表2的结果分析，可发现实验组的3项测试指标均高于对照组，证明经过本发明实施例2处理得到的生物瓣膜组织的强度得到提高，耐久性有明显增强。
实施例3
本实施例中人工生物瓣膜的制备方法与实施例1和实施例2相似，具体包括如下步骤：
S1：从屠宰厂获取牛心包组织，经过脂肪剥离、修剪和清洗后，采用0.5％(w/v)的胰蛋白酶溶液(Sigma-Aldrich Co.LLC.)进行脱细胞处理。
S2：将处理后的牛心包浸没在含有0.022％(w/v)硫酸皮肤素、0.001％(w/v)透明质酸(Sigma-Aldrich Co.LLC.)和0.007％(w/v)硫酸软骨素的磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.4)中24h，然后取出组织。
S3：将所上述S2处理后的组织用含0.002％(w/v)N-羟基苯并三氮唑和0.02％(w/v)二异丙基碳二亚胺(Sigma-Aldrich Co.LLC.)的吗啉乙磺酸溶液(pH值为5.5)交联24h。
S4：将上述经过S3交联处理的组织用生理盐水溶液清洗5次，之后再放入0.625％(V/V)戊二醛溶液蒸汽中雾化交联3天。
S5：最后将组织用HEPES溶液(pH值为7.4)清洗，得到生物瓣膜。
S6：将生物瓣膜保存在0.3％(V/V)的戊二醛溶液(pH值为7.4)中。
将经过上述步骤制备得到的生物瓣膜组织作为实施例3的实验组，以直接通过0.5％(V/V)戊二醛溶液固定3天的牛心包组织作为对照组，对实验组和对照组的热皱缩温度、胶原的交联度以及GAG含量三种指标进行测试。测试得到的结果如下表3所示。
表3实施例3中对照组和实验组的热皱缩温度测试、胶原的交联度测试和GAG含量测试结果
从表3的结果分析，可发现实验组的3项测试指标均高于对照组，证明经过本发明实施例3处理得到的生物瓣膜组织的强度得到提高，耐久性有明显增强。
实施例4
本实施例中人工生物瓣膜的制备方法与实施例1、实施例2和实施例3相似，具体包括如下步骤：
S1：从屠宰厂获取猪主动脉瓣膜组织，经过修剪和清洗后，采用低渗溶液(pH值为7.4)振荡和0.5％(w/v)辛基吡喃葡萄糖苷进行联合脱细胞处理。
S2：将处理后的猪主动脉瓣膜组织浸没在含有0.06％(w/v)硫酸软骨素、0.025％(w/v)硫酸皮肤素、0.012％(w/v)透明质酸和0.003％(w/v)肝素钠(Sigma-AldrichCo.LLC.)的HEPES溶液(pH值为7.2)中24h，然后取出组织。
S3：将上述S2处理后的组织用含0.001％(w/v)2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(上海弘邦医药科技有限公司)的HEPES溶液(pH值为6.8)交联24h。
S4：将上述经过S3交联处理后的组织用生理盐水溶液清洗5次，之后放入0.5％(V/V)的原花青素溶液(pH值为7.4)中交联5天。
S5：最后将组织用生理盐水清洗，得到生物瓣膜。
S6：将生物瓣膜保存在0.2％(V/V)的戊二醛溶液(pH值为7.4)中。
将经过上述步骤制备得到的生物瓣膜组织作为实施例4的实验组，以直接通过0.5％(V/V)戊二醛溶液固定3天的猪主动脉瓣膜组织作为对照组，对实验组和对照组的热皱缩温度、胶原的交联度以及GAG含量三种指标进行测试。测试得到的结果如下表4所示。
表4实施例4中对照组和实验组的热皱缩温度测试、胶原的交联度测试和GAG含量测试结果
从表4的结果分析，可发现实验组的3项测试指标均高于对照组，证明经过本发明实施例4处理得到的生物瓣膜组织的强度得到提高，耐久性有明显增强。
综上所述，本发明提供了一种生物瓣膜的制备方法，生物组织经过脱细胞处理去除了组织中的细胞和相关降解酶(例如透明质酸酶、硫酸软骨素酶和明胶酶等)，细胞原先占据的空间被预留下来，而且消除相关降解酶对GAG成分的降解，最大程度保留组织中原先的GAG成分与结构。在脱细胞处理后将组织浸入含GAG成分的缓冲溶液中，原先细胞的空间位点可被GAG成分填充，增加组织中GAG的成分，且降低组织中的空隙，防止组织结构因GAG成分的丢失而产生组织塌陷，可减少钙盐在空隙中的沉积，提高组织的抗钙化性能和耐久性。同时，经过脱细胞处理后组织中引起钙化的磷脂、细胞膜成分被去除，提高组织的抗钙化性能。
而且，用GAG交联剂可将添加的GAG成分和原先组织中GAG成分的羧基与胶原纤维、弹性纤维的氨基交联形成牢固的酰胺键，将这些游离型的GAG成分和原先组织中的GAG永久性保留在组织中。
另一方面，GAG交联剂不仅将GAG交联到组织中，且可帮助胶原分子的羧基和氨基交联形成酰胺键，起到“催化剂”的作用。
此外，经过GAG交联剂交联的组织再用胶原蛋白交联剂交联，特别是使用戊二醛蒸汽雾化可提高戊二醛在组织中的渗透性，形成双交联工艺，进一步提高组织交联度，增强组织力学性能和耐久性。
通过本发明处理的生物组织制备得到的生物瓣膜，可显著减轻甚至消除组织褶皱，降低组织弯曲产生的应力，增强组织的柔顺性，提高组织材料的使用率，大大降低生产成本。
需要说明的是，本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。

Claims (25)

1.一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将生物组织材料进行脱细胞处理，得到脱细胞处理后的生物组织；
S2：将所述脱细胞处理后的生物组织浸没在含有GAG的缓冲溶液中；
S3：将经过所述S2处理后的生物组织利用GAG交联剂溶液进行交联处理；
S4：将经过所述S3处理后的生物组织经过清洗液清洗，然后再利用胶原蛋白交联剂溶液进行交联处理；
S5：将经过所述S4处理后的生物组织利用清洗液清洗，得到所述生物瓣膜。
2.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，还包括S6：将所述S5中制备得到的所述生物瓣膜保存在戊二醛溶液或甘油溶液中。
3.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S1中，对生物组织材料进行脱细胞处理的方法为低渗振荡处理法、表面活性剂法、反复冻融法和酶处理法中的一种或多种组合。
4.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S2中，所述GAG选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素的一种或多种组合。
5.根据权利要求4所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述透明质酸为分子量5000Da至1000000Da的低分子质量透明质酸，或者1000000Da至2500000Da的高分子质量透明质酸。
6.根据权利要求4所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述硫酸软骨素选自分子量为1000Da至20000Da的低分子硫酸软骨素，或分子量为1000Da至25000Da的低分子多硫酸化硫酸软骨素及其异构体。
7.根据权利要求4所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述硫酸皮肤素选自分子量为1000Da至10000Da的低分子硫酸皮肤素，或分子量为1000Da至15000Da的低分子多硫酸化硫酸皮肤素。
8.根据权利要求4所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述肝素的分子量为2000Da至10000Da。
9.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S2中，所述含有GAG的缓冲溶液中GAG的质量体积浓度为0.0001-10％(W/V)。
10.根据权利要求9所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述含有GAG的缓冲溶液中GAG的质量体积浓度为0.001-0.1％(W/V)。
11.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S2中，所述含有GAG的缓冲溶液的pH值为6.8-8.6，缓冲液选自磷酸盐缓冲液、D-Hanks溶液和哌嗪乙磺酸溶液中的一种。
12.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S2的反应条件为：反应温度为0-37℃、反应时间为0.5-72小时。
13.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S3中，所述GAG交联剂选自碳化二亚胺及其盐类、磷正离子型缩合剂、脲正离子型缩合剂、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐及其衍生物、高碘酸钠、高碘酸钾、2-氯-N-十二烷基吡啶盐碘化物及其衍生物和2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物及其衍生物中的一种或多种组合。
14.根据权利要求13所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述碳化二亚胺及其盐类选自1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，二异丙基碳二亚胺，二环己基碳二亚胺和1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐中的一种或多种组合。
15.根据权利要求13所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，含有所述碳化二亚胺及其盐类的GAG交联剂中还添加有N-羟基苯并三氮唑或N-羟基-琥珀酰亚胺，所述N-羟基苯并三氮唑或N-羟基-琥珀酰亚胺与所述碳化二亚胺及其盐类的摩尔浓度比例为1:100。
16.根据权利要求13所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述磷正离子型缩合剂选自苯并三氮唑-1-基氧-三(四氢吡咯基)鏻鎓六氟磷酸盐、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐和三吡咯烷基氯化鏻六氟磷酸盐中的一种或多种组合。
17.根据权利要求13所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述脲正离子型缩合剂选自O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐、O-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐和O-(N-丁二酰亚胺基)-二(二甲胺基)碳鎓四氟硼酸盐中的一种或多种组合。
18.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S3中，所述GAG交联剂溶液的质量体积浓度为0.0001-10％(W/V)。
19.根据权利要求18所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S3中，所述GAG交联剂溶液的质量体积浓度为0.0001-0.1％(W/V)。
20.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S3中，所述GAG交联剂溶液采用的溶剂选自HEPES溶液、吗啉乙磺酸溶液、吗啉丙磺酸溶液和哌嗪二乙磺酸溶液中的一种，所述GAG交联剂溶液的pH值为4.0-7.5。
21.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S3的反应条件为：反应温度为0-37℃、反应时间为0.5-120小时。
22.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S4和S5中，所述清洗液选自氯化钠生理盐水、磷酸盐缓冲液和HEPES溶液中的一种。
23.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白交联剂选自戊二醛、1,6-己二异氰酸酯、京尼平、原花青素和单宁酸溶液中的一种或多种组合，其中，所述戊二醛溶液的体积浓度为0.1-1％(V/V)，所述1,6-己二异氰酸酯、京尼平、原花青素和单宁酸溶液的质量体积浓度为0.1-1wt％。
24.根据权利要求1所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S4中，利用胶原蛋白交联剂溶液进行交联处理的反应条件为：反应温度为2-37℃、反应时间为0.5-72小时。
25.根据权利要求2所述的一种生物瓣膜的制备方法，其特征在于，所述S6中，所述戊二醛溶液的pH值为6.8-8.6，戊二醛的体积分数为0.1-0.625％(V/V)；所述甘油溶液的pH值为6.8-7.6，甘油的体积分数为30-100％(V/V)。
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