CN115177789A - 透明质酸在制备促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖或弹性蛋白的产品中的应用 - Google Patents
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- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
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- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/20—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of the heart, e.g. heart valves
Abstract
本发明公开了一种透明质酸在制备促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖或弹性蛋白的产品中的应用；本发明透明质酸能够有效促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖和弹性蛋白，进而表明透明质酸能够成为一种用于组织工程心脏瓣膜的材料。此外，通过对透明质酸分子量、浓度的进一步限定，能够更好的促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖和弹性蛋白，以及瓣膜间质细胞和人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。
Description
技术领域
本发明涉及透明质酸的应用技术领域，具体涉及一种透明质酸在制备促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖或弹性蛋白的产品中的应用。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种由细菌(枯草芽孢杆菌)生物合成的大分子直链糖胺聚糖，是ECM的主要成分之一。透明质酸因其具有较好的生物相容性、生物可降解性、抗凝抑炎性及促进组织和血管再生，已被广泛应用于组织工程中。此外，其在细胞信号转导、细胞迁移、心脏瓣膜和创伤修复中起着重要作用。
HA作为细胞外基质的主要成分之一，在促进组织和血管再生中起着重要作用。虽然HA材料可以用于组织工程心脏瓣膜，但其力学性能较差，缺乏作为心脏瓣膜瓣叶支架所必需的机械性能，因此需要进行化学修饰或添加其他生物材料来进行改善，从而开发稳定耐用的支架；此外，HA一方面具有调节新生血管生成的作用，小分子量HA可以促进血管新生，而大分子量的HA则会抑制血管生成；因此，不同分子量的HA的生物学效应及其发挥作用的机制有待进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种透明质酸在制备促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖或弹性蛋白的产品中的应用，该应用能够有效促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖和弹性蛋白，进而表明透明质酸能够成为一种用于组织工程心脏瓣膜的材料。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种透明质酸在制备促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖或弹性蛋白的产品中的应用。
优选地，所述透明质酸的分子量为1×104。
本发明第二方面提供一种透明质酸在制备促进瓣膜间质细胞增殖和/或迁移的产品中的应用。
优选地，所述产品中透明质酸的浓度为100～200μg/mL；所述透明质酸的分子量为0.5×104。
本发明第三方面提供一种透明质酸在制备促进人脐静脉内皮细胞增殖和/ 或迁移的产品中的应用，所述产品中透明质酸的浓度为100～200μg/mL；所述透明质酸的分子量为0.5×104。
本发明第四方面提供一种含有透明质酸的静电纺丝支架的制备方法，所述静电纺丝支架通过将PLCL和HA溶于溶剂中，再经静电纺丝制得。
优选地，所述溶剂为FA和HFIP。
优选地，所述FA和HFIP的体积比为7∶3。
优选地，所述透明质酸的分子量为1×104。
优选地，所述PLCL与HA的质量比为90∶10。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明透明质酸能够有效促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖和弹性蛋白，进而表明透明质酸能够成为一种用于组织工程心脏瓣膜的材料。
此外，通过对透明质酸分子量、浓度的进一步限定，能够更好的促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖和弹性蛋白，以及瓣膜间质细胞和人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。
本发明制备得到的含有透明质酸的静电纺丝支架具有更加优异的弹性模量、极限抗拉强度和较低的断裂伸长率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例中不同浓度、不同分子量的HA对HUVEC增殖的影响；
图2为本发明实施例中Wound healing法不同分子量的HA对HUVEC迁移的影响；
图3为本发明实施例中Wound healing法不同分子量的HA对HUVEC迁移数量的统计；
图4为本发明实施例中Transwell法不同分子量的HA对HUVEC迁移的影响；
图5为本发明实施例中Transwell法不同分子量的HA对HUVEC迁移数量的统计；
图6为本发明实施例中不同浓度、不同分子量的HA对VICs增殖的影响；
图7为本发明实施例中Wound healing法不同分子量的HA对VICs迁移的影响；
图8为本发明实施例中Wound healing法不同分子量的HA对VICs迁移数量的统计；
图9为本发明实施例中Transwell法不同分子量的HA对VICs迁移的影响；
图10为本发明实施例中Transwell法不同分子量的HA对VICs迁移数量的统计；
图11为本发明实施例中不同分子量的HA对VICs分泌胶原蛋白的影响；
图12为本发明实施例中不同分子量的HA对VICs分泌糖胺聚糖的影响；
图13为本发明实施例中不同分子量的HA对VICs分泌弹性蛋白的影响；
图14为本发明实施例中HA在不同溶剂中的溶解性考察结果；
图15为本发明实施例中PLCL/HA静电纺丝支架的形貌特征，其中，a为不同分子量的PLCL/HA静电纺丝支架的SEM图像，b为直径分布；
图16为本发明实施例中PLCL/HA静电纺丝支架的平均纤维直径和孔径，其中，a为平均纤维直径，b为平均孔径；
图17为本发明实施例中PLCL/HA静电纺丝支架的应力-应变曲线图；
图18为本发明实施例中PLCL/HA静电纺丝支架的力学性能，其中，a为弹性模量，b为极限抗拉强度，c为断裂伸长率；
图19为本发明实施例中体外HA释放实验；
图20为本发明实施例中4周和8周Wistar幼鼠皮下埋植H&E染色结果；
图21为本发明实施例中4周和8周Wistar幼鼠皮下埋植H&E染色定量结果；
图22为本发明实施例中4周和8周Wistar幼鼠皮下埋植Von Kossa染色结果；
图23为本发明实施例中4周和8周Wistar幼鼠皮下埋植Ca2+含量定量检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例
1.不同分子量的HA的生物学效应的研究：
(1)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响
用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测不同浓度(10-500μg/mL)、不同分子量(0.5-180*104)的HA对HUVEC增殖的影响(n＝5)。HUVEC用高糖DMEM 培养基培养。
(2)对HUVEC迁移的影响
用Wound healing法和Transwell法来考察对HUVEC迁移的影响(n＝3)。 HUVEC用高糖DMEM培养基培养。
Wound healing法如下：
收集HUVEC，重悬，将细胞按照1×106/孔的密度加入到6孔板中，待细胞贴壁后，用200μL枪头在6孔板底部人为制造划痕(wound)；然后，加入不同分子量的HA溶液，培养48小时；再拿出孔板，用无菌PBS清洗3次；随后，利用4％多聚甲醛室温固定10分钟，用无菌PBS清洗3次，0.1％结晶紫室温染色30分钟，用无菌PBS清洗3次；最后，于显微镜下拍照观察。
Transwell法如下：
收集HUVEC，重悬，将细胞按照1×105/孔的密度加入Transwell 24孔板上层小室中，再在Transwell 24孔板下层小室中加入不同分子量的HA溶液，培养48小时；然后，取出上层小室，用棉签轻轻擦去上层小室的细胞，用无菌 PBS清洗3次，随后，将其转移至新的24孔板中，采用4％多聚甲醛室温固定 10分钟，用无菌PBS清洗3次，0.1％结晶紫室温染色30分钟，用无菌PBS清洗3次。最后，于显微镜下拍照观察。
(3)对瓣膜间质细胞(VICs)增殖的影响
用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测不同浓度(10-500μg/mL)、不同分子量(0.5-180*104)的HA对VICs增殖的影响(n＝5)。VICs用低糖DMEM培养基培养。
(4)对瓣膜间质细胞(VICs)迁移的影响
用Wound healing法和Transwell法来考察对VICs迁移的影响(n＝3)。VICs 用低糖DMEM培养基培养。
(5)对瓣膜间质细胞(VICs)分泌相关物质的影响
收集VICs，重悬。将细胞按照1×106/孔的密度加入到6孔板中。待细胞贴壁后，加入不同分子量的HA溶液，培养48小时。拿出孔板，用无菌PBS清洗3次。按照如下步骤分别检测上清和细胞里的相关物质(胶原蛋白、糖胺聚糖和弹性蛋白)分泌的影响(n＝5)。
胶原蛋白定量检测：
样品中加入1mL 0.1mg/mL胃蛋白酶乙酸溶液，置于4℃过夜，再加入200 μLIsolation&Concentration Reagent，置于4℃过夜，再以12000rpm离心10 分钟，弃上清；然后，配制胶原蛋白标准曲线，浓度梯度分别为：0μg/mL、5 μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和50μg/mL；随后，各取100μL样品和标准品，加入1mL Sircol Dye Regeant，上下颠倒混匀，室温温和震荡30分钟，再以12000rpm离心10分钟，弃上清，加入750μL预冷的1×Acid-SaltWash Reagent，洗涤胶原蛋白沉淀，12000rpm离心10分钟，弃上清，加入250μL AlkaliReagent，涡旋，室温震荡5分钟，溶解胶原蛋白沉淀；取200μL上清加入96 孔板中，于555nm处测定吸光度值；最后，根据标曲计算得到各组胶原蛋白含量。
糖胺聚糖定量检测：
首先配制木瓜蛋白酶溶液，配制方法如下：
用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制50mL的0.2M的磷酸盐缓冲液，加入400 mg醋酸钠，200mg EDTA，40mg半胱氨酸盐酸盐，5mg木瓜蛋白酶，并调 pH值到6.4，即得木瓜蛋白酶溶液。
糖胺聚糖定量检测的具体步骤如下：
样品中加入1mL木瓜蛋白酶溶液，65℃水浴酶解3小时，10000g离心10 分钟，取上清，弃沉淀；配制糖胺聚糖标准曲线：浓度梯度分别为：0μg/mL、 10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL和50μg/mL；随后，各取100μL 样品和标准品，加入1mL Blyscan Dye Regeant，涡旋，室温震荡30分钟，12000 g离心10分钟，弃上清，留沉淀，再加入0.5mL DissociationReagent，涡旋，震荡10分钟，至沉淀完全溶解，12000g离心5分钟；各取200μL上清加入 96孔板中，于656nm处测定吸光度值，最后，根据标曲计算得到各组糖胺聚糖含量。
弹性蛋白定量检测：
样品中加入1mL胰酶，37℃消化3分钟，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入100μL的1M草酸，100℃处理60分钟；然后，配制弹性蛋白标准曲线：浓度梯度分别为：0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL和 500μg/mL；随后，各取100μL样品和标准品，加入100μLElastin Precipitating Reagent，涡旋，沉淀弹性蛋白15分钟，10000g离心10分钟，弃上清，留沉淀，再加入1ml Dye Regeant，涡旋，室温温和震荡90分钟，10000g离心10 分钟，弃上清，留沉淀，加入250μL Dye Dissociation Reagent，涡旋，室温震荡10分钟，至沉淀完全溶解；取200μL上清加入96孔板中，于513nm处测定吸光度值；最后，根据标曲计算得到各组弹性蛋白含量。
2.含有透明质酸的静电纺丝支架(PLCL/HA)的制备
筛选PLCL/HA共纺的最优溶剂：
透明质酸是一种酸性粘多糖，是一种高分子聚合物，分子量从0.5-2000万不等。通过实验室前期摸索，选取能溶解HA的较好溶剂溶解不同分子量的HA。选取的溶剂如下：(1)NaOH/DMF＝4/1；(2)FA；(3)HFIP。
确定PLCL/HA共纺的最佳配比：
在确定了溶解HA的最优溶剂后，用该溶剂溶解不同比例的PLCL/HA。具体比例如表1所示：
表1
| PLCL/HA | 100/0 | 90/10 | 80/20 | 70/30 | 60/40 |
| PLCL(g) | 1 | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.6 |
| HA(g) | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
| 总体积(mL) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
按照上表，称取一定质量的PLCL和HA，放入玻璃瓶中，加入一定体积的溶剂，最终浓度为10％(w/v)。将上述制备好的溶液用封口膜封口，在室温下磁力搅拌过夜。在自行设计的静电纺丝机上进行静电纺丝实验。静电纺丝机包括注射泵、高压电源和接收器(直径3cm的旋转不锈钢收集芯棒)。
具体静电纺丝步骤如下：将配制好的PLCL/HA溶液填充到一个10mL的塑料注射器中，注射器配有21G钝头针头；将注射器装入注射泵中，设置恒定流量为6mL/h；在收集芯棒上覆盖一层铝箔；将高压电源的一头与针头相连，另一头与接收器相连；针头和接收器之间的电压为16KV，距离为13-15cm，接收器的转速为500rpm。静电纺丝过程中，全程打开通风设备。
待静电纺丝结束后，将PLCL/HA静电纺丝支架从接收器的铝箔上取下来，在真空干燥箱中干燥72小时，以除去残留溶剂。
以下静电纺丝支架的研究均以PLCL和HA为最佳质量比(90:10)，溶剂为最佳溶剂FA和HFIP(体积比为7:3)为基础进行相应研究：
(1)PLCL/HA静电纺丝支架的形貌表征
采用扫描电子显微镜(SEM)，观察PLCL/HA静电纺丝支架的表面形貌(n＝3)。
(2)PLCL/HA静电纺丝支架的力学性能检测
使用万能拉力机对PLCL/HA静电纺丝支架的力学性能进行检测(n＝5)。
(3)PLCL/HA静电纺丝支架的HA释放实验
使用咔唑法对PLCL/HA静电纺丝支架的HA释放行为进行考察(n＝5)。
具体步骤如下：
PLCL/HA样品充分干燥后，切成1×1cm，称重，记录重量。
将样品放入到1.5mL离心管中，并加入1mL无菌PBS，置于摇床上震荡。
在3天、1、2、4和8周后，取100μL上清，并补充同体积的无菌PBS。
用咔唑法检测释放到PBS溶液里的HA含量：具体步骤如下：
将100μL样品上清和标准品，加入到3mL 0.025M十水合四硼酸钠/硫酸溶液中，100℃静置10分钟。
加入100μL 0.125％咔唑/无水乙醇，100℃静置15分钟。
取100μL加入到96孔板中，用酶标仪在530nm处测定OD值。
3.PLCL/HA静电纺丝支架的动物实验
采用幼龄Wistar大鼠(45-65g，雄性)进行皮下埋植实验考察PLCL/HA 静电纺丝支架的体内抗钙化能力(n＝5)。所有动物实验均经天津市动物实验伦理委员会中心和动物保护权威机构批准。
(1)动物皮下埋植及取材
大鼠经10％水合氯醛腹腔麻醉后，用推子剃去大鼠背部毛发，以背部朝上的姿势固定四肢，75％乙醇消毒，用棉签涂覆适量碘酒，在背部上下位置切两个1.0cm左右的纵向切口，将PLCL/HA静电纺丝支架(6×6毫米)埋植到皮下，并用聚丙烯3-0缝线缝合切口，再一次用棉签涂覆适量碘酒。
手术后4周和8周后，将大鼠安乐死，剪开背部皮肤，取出埋植的PLCL/HA 静电纺丝支架，去除材料上多于的组织和黏膜，然后分为两个部分：
一部分放入装有OCT的滴管中，置于液氮中速冻，于冰冻切片机内切成厚度为6μm的薄片并贴附于粘附载玻片上，置于-20℃保存，用于H&E染色和 Von Kossa染色。H&E染色用于评价细胞浸润情况；Von Kossa染色用于识别钙沉积。
另一部分装入1.5mL离心管中，在80℃恒温干燥箱中烘干至恒重，称重，记录重量，用于硝酸微波消解，消解后用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)定量检测钙含量。
(2)钙含量定量检测
将取出来的材料在80℃恒温干燥箱中烘干至恒重，称重，记录重量，用于硝酸微波消解。消解后用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)定量检测钙含量。
4.实验数据分析
每项实验至少重复三次进行测试，所有以上数据均用平均值±标准差(Mean ±SD)表示。通过GraphPad Prism 8软件用one-way ANOVA进行统计学分析，p<0.05被认为具有统计学意义。NS表示无显著性差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。
5.实验结果
(1)对内皮细胞增殖的影响结果
用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测不同浓度(10-500μg/mL)、不同分子量(0.5-180*104)的HA对HUVEC增殖的影响。结果如图1所示，HA对HUVEC 增殖的作用呈现分子量大小依赖性和浓度依赖性的特性。一方面，随着HA分子量的降低，其对HUVEC增殖的效果更加明显，即小分子量的HA更加能促进HUVEC的增殖。另一方面，随着HA浓度的升高，对HUVEC增殖的作用呈现先上升后下降的趋势，在10-100μg/mL的浓度范围内对HUVEC增殖的作用呈现上升趋势，在100-500μg/mL的范围内则呈现一个降低的趋势，当HA 的浓度为100μg/mL时，促进增殖的作用最显著，继续增加浓度并不能继续增强其促进细胞增殖的效果。
(2)对内皮细胞迁移的影响结果
wound healing法的结果如图2所示，由图2可知，随着培养时间的延长，从0到48小时，wound(伤痕)区域都呈现一个healing(愈合)的趋势。相比于对照组，所有不同分子量的HA均可以明显加快“伤口”区域“愈合”的速度。尽管低分子量HA和高分子量HA都能促进HUVEC迁移，但两者在促进细胞迁移过程中表现出差异。其中，小分子量的两组(MW＝0.5*104和MW＝1*104)促进“愈合”的速度更快，12小时已基本“愈合”，而对照组在24小时才呈现基本“愈合”的趋势。从向“伤痕”区域迁移的具体细胞数量也可以看出此趋势(图3)，添加HA明显可以促进向“伤口”区域迁移的细胞数量，且小分子量的两组(MW＝0.5*104和MW＝1*104)在各个时间点向“伤口”区域迁移的细胞数量均最多。
Transwell法的结果如图4所示，由图4可知，随着时间的延长，从12到 48小时，向Transwell下层小室迁移的细胞数量呈现逐渐增多的趋势。相比于对照组，所有不同分子量的HA均可以明显加快迁移的速度。尽管低分子量HA 和高分子量HA都能促进HUVEC迁移，但两者在促进细胞迁移过程中表现出差异。其中，小分子量的两组(MW＝0.5*104和MW＝1*104)迁移的速度更快。从向Transwell下层小室迁移的具体细胞数量(图5)也可以看出此趋势。添加 HA明显可以促进向Transwell下层小室迁移的细胞数量，而且小分子量的两组(MW＝0.5*104和MW＝1*104)在各个时间点向Transwell下层小室迁移的细胞数量均最多。
(3)对瓣膜间质细胞增殖的影响结果
用CCK-8检测不同浓度(10-500μg/mL)、不同分子量(0.5-180*104)的 HA对VICs增殖的影响。结果如图6所示，由图6可知，HA对VICs增殖的作用呈现分子量大小依赖性和浓度依赖性的特性。一方面，随着HA分子量的降低，其对VICs增殖的效果更加明显，即小分子量的HA更加能促进VICs的增殖。另一方面，随着HA浓度的升高，对VICs增殖的作用呈现先上升后下降的趋势，在10-100μg/mL的浓度范围内对VICs增殖的作用呈现上升趋势，在 100-500μg/mL的范围内则呈现一个降低的趋势，当HA的浓度为100μg/mL时，促进VICs增殖的作用最显著，继续增加HA浓度并不能继续增强对VICs增殖的效果。
(4)对瓣膜间质细胞迁移的影响结果
wound healing法的结果如图7所示，由图7可知，随着培养时间的延长，从0到48小时，wound(伤痕)区域都呈现一个healing(愈合)的趋势。相比于对照组，所有不同分子量的HA均可以明显加快“伤口”区域“愈合”的速度。尽管低分子量HA和高分子量HA都能促进VICs迁移，但两者在促进细胞迁移过程中表现出差异。其中，小分子量的两组(MW＝0.5*104和MW＝1*104)促进“愈合”的速度更快，12小时已基本“愈合”，而对照组在24小时才呈现基本“愈合”的趋势。从向“伤痕”区域迁移的具体细胞数量也可以看出此趋势(图8)，添加HA明显可以促进向“伤口”区域迁移的细胞数量，且小分子量的两组(MW＝0.5*104和MW＝1*104)在各个时间点向“伤口”区域迁移的细胞数量均最多。
Transwell法的结果如图9所示，由图9可知，随着时间的延长，从12到 48小时，向Transwell下层小室迁移的细胞数量呈现逐渐增多的趋势。相比于对照组，所有不同分子量的HA均可以明显加快迁移的速度。尽管低分子量HA 和高分子量HA都能促进VICs迁移，但两者在促进细胞迁移过程中表现出差异。其中，小分子量的两组(MW＝0.5*104和MW＝1*104)迁移的速度更快。从向 Transwell下层小室迁移的具体细胞数量(图10)也可以看出此趋势。添加HA 明显可以促进向Transwell下层小室迁移的细胞数量，而且小分子量的两组(MW＝0.5*104和MW＝1*104)在各个时间点向Transwell下层小室迁移的细胞数量均最多。
(5)对瓣膜间质细胞(VICs)相分泌关物质的影响结果
接下来对HA促进VICs分泌相关物质的情况进行了考察。检测结果如图11～13所示，图中部分组别没有数值的原因是其含量在试剂盒检测限之下；由图11～图13可知，相比于对照组，添加HA之后可以促进相关物质(胶原蛋白、糖胺聚糖和弹性蛋白)的分泌。其中，小分子量的两组(MW＝0.5*104和 MW＝1*104)促进作用最明显。
(6)筛选PLCL/HA共纺的最优溶剂的结果
经过实验室前期的摸索，在不同溶剂中的溶解结果如图14所示，由图14可知，发现HA在甲酸(FA)中具有较好的溶解性，而在六氟异丙醇(HFIP)与NaOH/DMF＝4/1两种溶剂中溶解性较差。在混合体系中，HA需要与PLCL 共混用于静电纺丝。HA的优良溶剂为FA，PLCL的优良溶剂为HFIP。为了使两者均能较好的溶解，最终选用HFIP/FA＝7/3，可以同时溶解PLCL和HA，用来静电纺丝。
PLCL与HA配比实验表明，PLCL和HA的最佳质量比是90:10制备得到的静电纺丝支架性能最佳。
(7)PLCL/HA静电纺丝支架的形貌特征
SEM图像显示了PLCL/HA静电纺丝支架的微观形貌如图15所示，结果显示，制备的PLCL/HA静电纺丝支架形貌均匀且光滑。如图15中a所示，PLCL/HA 静电纺丝支架由随机分布的纳米纤维和相互贯通的三维多孔结构组成。使用图像分析软件ImageJ，从扫描电镜图像中随机选取50根纤维，测量PLCL/HA静电纺丝支架的平均纤维直径和孔径。
如图15中b所示，PLCL/HA静电纺丝支架的平均纤维直径在0.92到2.91 μm之间变化。如图16中a所示，不同PLCL/HA静电纺丝支架的平均直径分别为1.25±0.23μm(0.5*104)、1.46±0.22μm(1*104)、1.98±0.31μm(10*104)、 2.08±0.25μm(120*104)和2.34±0.32μm(180*104)。这是由于HA分子量越大，其溶液的粘度越大，拉伸纤维所需要的拉伸力越大，从而导致其纤维直径增大。
随着PLCL/HA静电纺丝支架中HA分子量的增加，平均孔径从8.01μm增加到25.59μm。如图16中b所示，不同PLCL/HA静电纺丝支架的平均孔径分别为12.68±3.29μm(0.5*104)、14.82±3.65μm(1*104)、15.06±3.90μm (10*104)、16.12±3.22μm(120*104)和18.55±3.90μm(180*104)。上述结果表明，PLCL/HA静电纺丝支架的平均孔径随着HA分子量的增加而增大，这种现象可以用纤维平均直径的增加来解释。
(8)PLCL/HA静电纺丝支架的力学性能检测结果
通过拉伸实验对PLCL/HA静电纺丝支架的力学性能进行了检测。图17为不同分子量PLCL/HA静电纺丝支架的应力-应变曲线，定量数据见图18，具体数值列于表2：
表2
从图18可以看出，小分子量PLCL/HA静电纺丝支架的极限抗拉强度高于大分子量的PLCL/HA静电纺丝支架，HA分子量为1×104时，具有最佳的弹性模量，断裂伸长率的规律正好相反，即小分子量PLCL/HA静电纺丝支架的断裂伸长率更小。
(9)PLCL/HA静电纺丝支架的HA释放实验结果
咔唑法测量HA含量的原理如下：在硼离子和浓硫酸介质中，在加热的条件下，HA分子内的糖醛酸可以与咔唑反应，生成红色的复合物。该复合物在 530nm波长处有最大吸收，且吸光度与糖醛酸的含量成正比。这一反应产生的颜色稳定，测定的线性范围为0-40μg/mL。
通过咔唑法评估了不同分子量的PLCL/HA静电纺丝支架的HA体外释放行为。从图19可以看出，在8周的时间内，HA从PLCL/HA静电纺丝支架中持续释放。其中，低分子量的HA(MW＝0.5*104和MW＝1*104)的释放量快于高分子量的HA。
(10)PLCL/HA静电纺丝支架的动物实验结果
通过动物皮下埋植实验评价不同PLCL/HA静电纺丝支架的体内细胞浸润和抗钙化能力。对幼龄Wistar大鼠进行皮下埋植，分别于4周和8周后取材，进行H&E染色、Von Kossa染色和钙含量定量检测。
H&E染色结果显示了PLCL/HA静电纺丝支架的细胞浸润情况。如图20和图21所示，随着PLCL/HA静电纺丝支架中的HA分子量的增加，细胞浸润数量减少，高分子量HA组(MW＝120*104)的细胞浸润效果最差。
在体外实验中，相比于大分子量的HA(MW＝120*104和MW＝180*104)和中分子量的HA(MW＝10*104)，小分子量的HA(MW＝0.5*104和MW＝1*104)促进细胞增殖和迁移的生物学效应更加显著；但是在体内实验中，中分子量的 HA(MW＝10*104)促进细胞浸润的效果更好，尤其是皮下埋植8周后，其细胞浸润的深度、广度和数量均优于小分子量的HA(MW＝1*104)。推测发生该现象的可能原因是随着体内埋植时间的延长，中分子量的HA(MW＝10*104)会逐渐发生降解，产生的小分子量HA和相关降解产物可能对周围细胞的迁移和浸润起到一个促进作用。
Von Kossa染色结果显示PLCL/HA静电纺丝支架具有优良的抗钙化能力。如图22所示，在长达8周的时间里，从皮下埋植取出的PLCL/HA静电纺丝支架中未发现钙沉积。
(11)钙含量定量检测结果
进一步通过电感耦合等离子质谱(ICP-MS)进一步定量了各组的钙离子含量。如图23所示，随着PLCL/HA静电纺丝支架中HA分子量的增加，沉积的 Ca2+含量随之增加，说明低分子量的HA钙化程度较低。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (10)
1.透明质酸在制备促进瓣膜间质细胞分泌胶原蛋白、糖胺聚糖或弹性蛋白的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述透明质酸的分子量为1×104。
3.透明质酸在制备促进瓣膜间质细胞增殖和/或迁移的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品中透明质酸的浓度为100～200μg/mL；所述透明质酸的分子量为0.5×104。
5.透明质酸在制备促进人脐静脉内皮细胞增殖和/或迁移的产品中的应用，其特征在于，所述产品中透明质酸的浓度为100～200μg/mL；所述透明质酸的分子量为0.5×104。
6.一种含有透明质酸的静电纺丝支架的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝支架通过将PLCL和HA溶于溶剂中，再经静电纺丝制得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为FA和HFIP。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述FA和HFIP的体积比为7∶3。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸的分子量为1×104。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述PLCL与HA的质量比为90∶10。
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| Title |
|---|
| 张景云: "《实用美容药物学》", vol. 1, 中国协和医科大学出版社, pages: 184 - 189 * |
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