CN114504682A - 脐动脉在制备冠脉搭桥的移植血管材料中的应用及制备冠脉搭桥的移植血管材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域，特别涉及脐动脉在制备冠脉搭桥的移植血管材料中的应用及制备冠脉搭桥的移植血管材料的方法。本发明从脐动脉生理解剖结构，去抗原与抗钙化处理效果以及动物实验等方面探讨脐动脉应用于冠脉搭桥的可行性，为冠脉血管重建寻找新的移植血管材料源。试验结果表明：脐动脉从生理解剖结构及物理性能方面可满足作为冠脉搭桥的移植血管材料的要求；液压扩张可增大脐动脉口径，预防痉挛发生，但不引起血管结构的明显损伤。采用液氮深低温+戊二醛(GA)方法处理脐动脉后的去抗原、抗钙化效果良好，对血管物理性能影响较小，并易实施，且可较长时间保存。

Description

脐动脉在制备冠脉搭桥的移植血管材料中的应用及制备冠脉 搭桥的移植血管材料的方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及脐动脉在制备冠脉搭桥的移植血管材料中的应用及制备冠脉搭桥的移植血管材料的方法。

背景技术

20世纪90年代以来，冠脉搭桥手术在中国兴起。而在冠脉外科的血管移植物中，桥血管替代材料常常是自体动脉如乳内动脉、桡动脉、胃网膜动脉等，或常用静脉如大隐静脉，上臂的静脉(贵要静脉)等；然而能使用的自体动脉或静脉常常有限。另外自体大隐静脉桥15年通畅率约60％左右，桡动脉桥5年通畅率为84％，并且桥血管受年龄，伴随病症如高血压、糖尿病、高脂血症等影响，远期通畅率将进一步下降；同时在临床上有一部分需要搭桥的患者，由于自身血管条件不良(大隐静脉曲张，桡动脉和乳内动脉粥样硬化)及胃部病变导致胃网膜动脉使用受限等，减少了移植血管材料的来源；再者，随着搭桥患者的年轻化，二次搭桥手术逐年增多；因此在冠脉血管重建领域中目前或不远的将来所面临的一个重大问题就是移植血管材料来源短缺。

另一方面，目前心血管外科面临微创介入手术的严峻挑战。创伤小，血管通畅率高，恢复快已成为心血管疾病干预的必然趋势。在这种形势下若能开发出一种能代替大隐静脉的血管材料作搭桥用，将在很大程度上减少手术创伤，缩短手术时间，减轻患者病痛。

在人工血管的研究中，小口径(直径≤5mm)的用于冠心病外科的人工血管，目前在技术方面还没有突破，主要问题是移植后人工血管内血栓形成及吻合口处组织增生，这些与人工血管的非生理的血液接触面及人工血管与自身血管的顺应性不匹配有关。人工血管置换病变静脉和小口径动脉后，腔面难以自发性形成内皮细胞衬里，远期通畅率较自体大隐静脉明显低下。因而人工血管尽管在大口径高流量的血管中能成功，但在小口径低流量的血管中结果却令人失望。组织工程学采用聚合物或以生物学为基础的基质，代表了克服小口径人工血管移植物的不足的最新途径。而它们的不足之处仍有血栓栓塞和血栓形成，与抗凝有关的出血，顺应性不匹配，新生内膜过度增生以及动脉瘤形成等。

从上世纪80年代以来国内外众多学者对同种异体静脉应用于动脉重建进行了大量研究，但在回顾有关同种异体静脉应用于冠脉搭桥的研究中发现，所有作者报道的通畅率均很低，并且已把这种移植血管归入低移植成功率的范畴。

新鲜或低温保存的动脉同种移植物被认为优于人工血管，相比较而言，动脉同种移植物可抗感染，血栓栓塞并发症少，而且不需要抗凝治疗。但因取材有限以及钙化、动脉瘤样扩张和破裂使耐久性有限而未能广泛地应用于临床。

脐带是胚胎发育过程中羊膜囊扩大包围体蒂及卵黄囊而形成的索状物，内有一条脐静脉和两条脐动脉，其平均长度为45～55cm。正常妊娠胎盘血管中脐动脉直径为3.7±1.4mm，分枝数量较少。有作者对86个新鲜足月新生儿双脐动脉的脐带进行解剖发现双脐动脉的压扁内壁周径与外壁周径分别是2.4±0.2mm与4.6±0.2mm；双脐动脉在80mmHg充盈压下的直径是3.9±0.8mm。

脐血管的应用中，脐静脉曾经作为血管材料应用于人周围血管和冠脉血管重建中。早期见于Boontje报道人脐静脉移植物在股-蝈动脉旁路术中动脉瘤发生率在植入后2.5-6年期间为3.5％；而在通畅的移植物中采用双扫描法去检测动脉瘤时发现：除吻合口处动脉瘤外，3年通畅的移植物中33％有动脉瘤形成；在4年通畅的移植物中45％有动脉瘤形成；而在5年或5年以上通畅的移植物中65％有动脉瘤形成。鉴于动脉瘤形成的危险，Miyata等建议应用人脐静脉作为移植物仅限于生存期只有几年的患者。后来Silver等在人CABG术中应用经戊二醛处理的人脐静脉后发现搭桥术后3-13个月通畅率仅为50％，故早期通畅率偏低。在脐动脉应用方面最早见于Christie报道采用绵羊胶原管道与醛化处理的人脐动脉和聚四氟乙烯移植物在鼠主动脉受体中比较发现所有移植物早期内100％通畅，且有细胞的新生内膜线样排列。后来Yeh等报道采用戊二醛固定的人脐动脉植入小鼠腹主动脉中发现累计通畅率约70％，且通畅的移植物腔表面没有内皮增殖迹象，但在腔表面和基底层区域含有一种无定形的蛋白样物质；在闭塞的移植物看到，由慢性炎症包裹的中心性坏死向外延伸并累及外膜，移植物管壁结构改变明显。上世纪90年代Vlessis等分别采用自体动脉和脐动脉行股浅动脉重建实验发现自体动脉吻合的血管均通畅(2/2)，2个脐动脉(2/5)移植物也大体通畅；而移植失败是由于脐动脉的血管活性过度反应所引起的。而国内钱涛等采用冻干(-70℃)辐照(小剂量钴⁶⁰辐照)方法处理人脐动脉在兔模型中发现6周后血管的淋巴细胞浸润较少，管壁结构较完整，而且免疫反应明显减弱。后来王晓谭等采用冻干辐照方法处理人脐动脉在犬颈动脉间置移植实验模型中发现术后6周血管内皮细胞再生良好，总通畅率为71％。上述研究结果表明如果能克服脐动脉的天然血管活性性质，脐动脉具有作为血管移植物的潜能；但目前在其它方面还未见有脐动脉的应用报道。因而脐动脉的临床应用研究还处于探索阶段。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了脐动脉在制备冠脉搭桥的移植血管材料中的应用及制备冠脉搭桥的移植血管材料的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

由于新生儿脐动脉来源丰富，取材容易，在口径上与冠脉外科搭桥所需材料口径吻合，因此理论上是冠脉外科移植血管材料的理想来源。但目前国内外还没有关于脐动脉应用于冠脉搭桥的报道，因而我们设计实验从脐动脉生理解剖结构，去抗原与抗钙化处理效果以及动物实验等方面探讨脐动脉应用于冠脉搭桥的可行性，为冠脉血管重建寻找新的移植血管材料源。

本发明提供了脐动脉在制备冠脉搭桥的移植血管材料中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述脐动脉经去抗原和/或抗钙化处理。

在本发明的一些具体实施方案中，所述去抗原和/或抗钙化采用液氮处理和/或醛化处理。

在本发明的一些具体实施方案中，所述液氮处理的保护剂包括体积浓度为15％的二甲基亚砜。

在本发明的一些具体实施方案中，所述液氮处理前还包括预冻的步骤；所述预冻具体为：于4℃冰箱中孵化30min，以0.5～1.0℃/min速度降温，降温至-60℃，维持30～60min后再置于-196℃液氮保存。

在本发明的一些具体实施方案中，所述液氮处理后还包括复温的步骤；所述复温速度为：4℃/min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述醛化处理采用醛基试剂，所述醛基试剂包括浓度为0.5％的戊二醛。

本发明还提供了制备冠脉搭桥的移植血管材料的方法，包括去抗原和/或抗钙化处理的步骤。在本发明的一些具体实施方案中，所述去抗原和/或抗钙化采用液氮处理和/或醛化处理。在本发明的一些具体实施方案中，所述液氮处理的保护剂包括体积浓度为15％的二甲基亚砜；

在本发明的一些具体实施方案中，所述液氮处理前还包括预冻的步骤；所述预冻具体为：于4℃冰箱中孵化30min，以0.5～1.0℃/min速度降温，降温至-60℃，维持30～60min后再置于-196℃液氮保存。在本发明的一些具体实施方案中，所述液氮处理后还包括复温的步骤；所述复温速度为：4℃/min。在本发明的一些具体实施方案中，所述醛化处理采用醛基试剂，所述醛基试剂包括浓度为0.5％的戊二醛。

基于上述研究，本发明还提供了所述方法制得的冠脉搭桥的移植血管材料。

本发明从脐动脉生理解剖结构，去抗原与抗钙化处理效果以及动物实验等方面探讨脐动脉应用于冠脉搭桥的可行性，为冠脉血管重建寻找新的移植血管材料源。试验结果表明：脐动脉从生理解剖结构及物理性能方面可满足作为冠脉搭桥的移植血管材料的要求；液压扩张可增大脐动脉口径，预防痉挛发生，但不引起血管结构的明显损伤。采用液氮深低温+戊二醛(GA)方法处理脐动脉后的去抗原、抗钙化效果良好，对血管物理性能影响较小，并易实施，且可较长时间保存。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示胎儿分娩后的脐动脉血管；

图2示脐动脉离体注水扩张过程；

图3示脐动脉管径随灌注压变化曲线；

图4示脐动脉血管应力-应变关系曲线；

图5示脐动脉血管扩张前(HE染色)；

图6示脐动脉血管扩张后(HE染色)；

图7示血管弹力染色显示血管各层结构变化；

图8示血管扩张前透射电镜照片；

图9示血管扩张后透射电镜照片；

图10示液氮保存30天的脐动脉标本病理检查(HE染色)照片；

图11示液氮保存60天的脐动脉标本病理检查(HE染色)照片；

图12示液氮保存90天的脐动脉标本病理检查(HE染色)照片；

图13示-180℃液氮保存30天的脐动脉标本电镜照片；

图14示-180℃液氮保存60天的脐动脉标本电镜照片；

图15示-180℃液氮保存90天的脐动脉标本电镜照片；

图16示未经处理的脐动脉(对照组)组织培养照片；

图17示未经处理的脐动脉(对照组)台盼蓝染色照片；

图18示液氮保存60天并且经过戊二醛处理30天的脐动脉(实验组)组织培养照片；

图19示液氮保存60天并且经过戊二醛处理30天的脐动脉(实验组)台盼蓝染色照片；

图20示实验组脐动脉包埋于兔背部皮内2周后病理检查(HE染色)照片；

图21示实验组脐动脉包埋于兔背部皮内4周后病理检查(HE染色)照片；

图22示实验组脐动脉包埋于兔背部皮内6周后病理检查(HE染色)照片；

图23示对照组脐动脉包埋于兔背部皮内2周后病理检查(HE染色)照片；

图24示对照组脐动脉包埋于兔背部皮内4周后病理检查(HE染色)照片；

图25示对照组脐动脉包埋于兔背部皮内6周后病理检查(HE染色)照片；

图26示实验组血管标本的细胞器透射电镜(×6000)结果；

图27示实验组血管内膜的扫描电镜(×400)结果；

图28示实验组血管壁的扫描电镜(×400)结果；

图29示对照组血管细胞器的透射电镜(×6000)结果；

图30示对照组血管内膜扫描电镜(×400)结果；

图31示对照组血管壁扫描电镜(×400)结果；

图32示对照组应力-应变关系曲线；

图33示实验组应力-应变关系曲线；

图34示实验组血管移植前病理检查(HE染色)显示结果；

图35示实验组血管移植后6W病理检查(HE染色)显示结果；

图36示对照组血管移植前病理检查(HE染色)显示结果；

图37示对照组血管移植后6W病理检查(HE染色)显示结果；

图38示实验组血管移植前细胞器透射电镜检查(×6000)结果；

图39示实验组血管移植后6W细胞器透射电镜检查(×6000)结果；

图40示实验组血管移植前内膜扫描电镜检查(×400)结果；

图41示实验组血管移植后6W内膜扫描电镜检查(×400)结果；

图42示对照组血管移植前内膜扫描电镜检查(×1000)结果；

图43示对照组血管移植后6W内膜扫描电镜检查(×1000)结果；

图44示对照组血管移植前细胞器透射电镜检查(×6000)结果；

图45示对照组血管移植后6W细胞器透射电镜检查(×6000)结果；

图46示实验组脐动脉移植后3月血管标本病理检查结果；

图47示对照组脐动脉移植后3月血管标本病理检查结果；

图48示实验组脐动脉移植前内膜扫描电镜检查(×400)结果；

图49示实验组脐动脉移植后3月内膜扫描电镜检查(×400)结果；

图50示对照组脐动脉移植前细胞器透射电镜检查(×6000)结果；

图51示对照组脐动脉移植后3月细胞器透射电镜检查(×6000)结果。

具体实施方式

本发明公开了脐动脉在制备冠脉搭桥的移植血管材料中的应用及制备冠脉搭桥的移植血管材料的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的脐动脉在制备冠脉搭桥的移植血管材料中的应用及制备冠脉搭桥的移植血管材料的方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1脐动脉的生理解剖研究

1、脐动脉材料的采集和制备。采集脐动脉血管在胎儿分娩后4-6h内完成，所有操作均在无菌条件下进行。如图1所示。

从脐带获取血管严格遵循无创伤技术；获取脐带后即置于有罂粟碱及1‰肝素的无菌生理盐水中，并用其冲洗血管腔，以防止血管痉挛和血栓形成；保持制备液和室温37℃；灌注压＜200mmHg。充分游离脐动脉后置于有罂粟碱(30mg/100ml)及1‰肝素的生理盐水中。

2、脐动脉物理性能的检测--脐动脉血管的顺应性和弹性以及耐压实验。

实验方法：测量0-40kPa范围内血管管径随灌注压变化情况，分析血管物理性能。同时以血管破裂时的管内压作为其耐受压强，分析血管胶原纤维的性能。

2.1血管管径的相对变化＝△D/D₀＝(D－D₀)/D₀，式中D为灌注压为ΔP时的直径，D₀为血管的原始直径，△D＝D－D₀，为血管管径绝对变化值。

2.2血管弹性(应力-应变关系)

血管径向的应变即血管周长的相对变化等于血管直径的相对变化，则应变定义为δ＝ΔD/D₀＝(D-D₀)/D₀；用切向面张力系数a来表示应力，a定义为管壁纵向单位长度上的横向张力：a＝ΔP·R(R为血管半径)，a的单位为(N/m)或(Pa·m)。求出各组血管的δ-a的光滑拟合曲线即血管的径向应力-应变关系曲线。

3、液压扩张对脐动脉血管的影响

3.1脐动脉处理实验方法；采集后的脐动脉用三腔管一端连接18号动脉留置针，一端连接压力表，另一端连接注射器。将18号动脉留置针插入脐动脉断端并固定，连接注射器一端注入1‰肝素生理盐水，并以200mmHg≤灌注压＜300mmHg的压力，分段对处理过程中发生痉挛的动脉进行液压扩张。操作时用手进行阻断，保持每段3-5cm，待该段充分扩张后再进行下一段的扩张。通过液压扩张可以发现在游离过程中没有结扎的细小分支及游离过程中血管壁损伤处。并采取相应措施进行处理。同时用游标卡尺测量血管扩张前后的内径变化。

3.2脐动脉液压扩张后组织学检查

1)取未处理的脐动脉与液压扩张后的脐动脉，固定于中性福尔马林液中，经过水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，最后制片(HE染色、弹力染色)，封片。

2)光镜观察用光学显微镜对液压扩张后动脉壁各层特别是内皮细胞、内弹力膜、肌层的结构与厚度进行测量并与未经液压扩张的动脉壁各层进行比较。观察内皮细胞脱落情况，内弹力膜与肌层变化。采用MIAS医学图象分析管理系统对图象进行分析。

3)电镜观察血管显微结构的改变。将血管标本在缓冲液(二甲砷酸钠0.1M，ph＝7.4)中漂洗15分钟，然后在含2.5％戊二醛、0.1M二甲砷酸钠溶液中固定4-5小时。用缓冲液冲洗后，样本在含1％四氧化锇、0.1M二甲砷酸钠溶液中做后固定4-5小时，再在乙醇中逐级脱水，最后在液态Co₂临界点干燥器中干燥。干燥后的样本安装在铝制支持器上，其上喷涂10-50nm厚的金层。在配备了LaBb发射板的80KV加速电压的TopconDC130SEM中，以传统的SE方式拍摄成像。观察血管形态学变化。

4.统计学方法：结果采用均数±标准差，组间进行T检验，使用SPSS(24.0)统计软件，P<0.05有显著性差异。

5、实验结果

5.1胎儿脐动脉血管的生理结构

脐动脉壁含弹力及胶原纤维均甚少，几乎全部由平滑肌组成，平滑肌根据其排列方向可分为四组：

①内环层平滑肌它对不同浓度的氧、正肾上腺素、肾上腺素、组织胺可以作出不同的收缩反应，可借以调节血管的血流量。

②内纵层平滑肌它对不同浓度的正肾上腺素、肾上腺素、乙酰胆碱等物质的反应不敏感，但对暂时的牵引和延伸可以发生明显的收缩，甚至使脐动脉完全关闭。

③大盘旋平滑肌它纵形地盘旋于内纵肌之外，其平滑肌束排列的倾角大，可使脐带发生盘绕。

④小盘旋平滑肌它螺旋形地盘旋于内纵肌之外，其平滑肌束排列的倾角小，可使脐动脉发生盘旋。

这四组平滑肌中，内纵肌的强烈收缩可使脐动脉口径明显缩小，加以其他平滑肌的作用可使脐动脉处于完全关闭状态。

5.2脐动脉离体研究：在整个实验过程中，共游离150条脐动脉，平均长度27±8cm。

在注水扩张过程中共发现有12条脐动脉有1条血管分枝，有4条脐动脉有2条血管分枝，余均无血管分枝。在实验中也发现有21条脐动脉在注水充盈过程中出现破裂，考虑是游离损伤导致。

5.3血管物理性能研究结果：如图3、图4以及表1所示。

表1血管直径随管内灌注压变化情况

请补充详细的结果分析。

表1表明：在0-40Kpa灌注压的范围内，随着灌注压的增加，脐动脉血管直径呈现出扩张的趋势，血管破裂时的管内压力——爆破压作为其耐受压强均大于40Kpa。

图3：随着灌注压的增加，脐动脉血管管径也相对增加。图4：血管径向的应变即血管周长的相对变化等于血管直径的相对变化，应力代表的含义为：管壁纵向单位长度上的横向张力。随着血管应力增加，血管应变也相应增加，呈现出线性发展的趋势。

5.4液压扩张对脐动脉血管的影响

5.4.1单纯液压扩张后血管管径的变化：血管扩张前血管内径为0.91±0.12mm，扩张后为3.38±0.37mm。(注：血管内径＝血管外径-血管壁厚度×2)。

5.4.2液压扩张脐动脉后组织形态学观察：如图5～7所示。

血管扩张前后的管外径分别为821.35±117.96U，1558.26±178.34U，P＜0.01；扩张前后的管壁厚分别为186.19±161.57U，119.5±35.59U，P＜0.05。光镜观察显示血管壁各层结构在扩张后无明显破坏现象；内皮层无明显脱落，弹力层无断裂及排列紊乱现象。

图8血管扩张前(P8)与后图9(P9)的透射电镜照片显示血管细胞器结构无明显破坏现象；扫描电镜观察扩张后与扩张前比较血管内皮细胞无明显脱落。

6.实验小结与分析

6.1在该实验中我们所测得的脐动脉直径为3.47±0.36mm，同时血管直径在胎儿端与母体端无显著性差异，且分枝数量较少。另外脐动脉内血液流速为54.64±8.36cm/s。而目前临床上我们常用的乳内动脉直径为2.2±0.43mm，在体血管流速为61.6±8.73cm/s。因此从理论上讲二者作为桥血管脐动脉血流量较乳内动脉大。而与大隐静脉相比，脐动脉分枝很少，无单向瓣膜而且血管无渐变细现象。另外在离体实验中我们所选用的血管材料抗爆破力均≥200mmHg，故脐动脉抗张力较强。

6.2血管顺应性与耐压性

在血管移植时我们需要考虑移植血管材料与宿主动脉顺应性相匹配的问题。经灭活后的异体材料存在着许多缺陷，其中生物力学特性的差异就是一个尚待解决的问题。许多研究表明，宿主动脉与移植材料间的弹性不相适应，即顺应性差异是导致局部血液动力学改变、内膜增生，甚至移植失败的重要原因之一。血管顺应性越大，则血管的可扩张度越大，也就是血管的弹性越好。由于脐动脉管壁中各成分的含量随胎龄变化呈不等比增长，有作者根据脐动脉压力-容积关系曲线得出37-40周时血管顺应性最好；因而在本实验中我们选用37-40周的胎儿脐带的脐动脉作为实验材料。由图3显示脐动脉血管管径变化随灌注压增大而增强，且同时血管抗爆破力均＞300mmHg，因此它可适合临床中血管的耐压要求。血管壁由弹性纤维、胶原纤维和平滑肌等组成。血管壁的力学性质具有蠕变、松弛和滞后等粘弹性特性，其应力—应变关系是非线性的。低压状态下，管壁主要由弹性纤维和平滑肌受力，这时的应力—应变关系接近于弹性良好的线性弹性体；高压状态下，管壁主要由胶原纤维受力，胶原纤维的滞后和应力松弛十分明显，所以此时的应力—应变关系为明显的非线性。为得到血管在径向的应力—应变关系，我们将血管简化为薄壁长管模型，即忽略管壁厚度，而长度远大于管径。径向的应变即血管周长的相对变化，也等于血管直径的相对变化。从图4可以看到在测量范围内脐血管应力—应变关系有向线性发展的趋势。因此，根据实验结果得出脐动脉不但具有良好的耐压性能而且具有较好的顺应性，这些说明脐动脉是良好动脉替代物材料。

6.3液压扩张对血管结构的影响

脐动脉管壁有四组平滑肌，但不受交感神经系统支配，这些肌层因在血管游离过程中受到外界刺激而发生强烈收缩，从图5可以看出脐动脉口径明显缩小，几乎处于闭塞状态。通过液压扩张可以发现在游离过程中没有结扎的细小分支及游离过程中血管壁损伤处，则可采取相应措施进行处理。在该实验中血管扩张前后管径明显增粗，肌层变薄；且扩张后血管保持扩张状态，未出现回缩现象；同时血管大体结构和显微结构观察显示血管结构及细胞器无明显损伤。所以采用该范围内的液压扩张可增大脐动脉口径而且不引起血管结构的明显损伤，且扩张后血管再无明显回缩作用，这可能与该范围内的灌注压使脐动脉平滑肌的肌小节功能单位失去活性有关。但这种压力并不破坏平滑肌纤维，从而使液压扩张后的脐动脉不再发生痉挛。

从上述结果可知脐动脉具有以下特点：①血管管径可满足搭桥血管材料所需；②口径较一致，无明显渐变细现象；且逐级分枝数量较少。③具有较强的耐压性能和良好的顺应性。加上来源丰富，取材容易，因而脐动脉可解决临床上同种异体血管来源有限的问题。

实施例2去抗原、抗钙化处理及处理后脐动脉的相关性能检测

实验目的：

从实施例1可知，新生儿脐动脉具有作为冠脉搭桥移植血管材料的潜能。但新生儿脐动脉若应用于临床，属于同种异体血管，具有抗原性，因此在应用脐动脉之前，必须对其行去抗原性和抗钙化的处理。本实验将采用我们摸索的去抗原性和抗钙化方法去处理脐动脉，然后检测该方法的效果以及对脐动脉相关性能的影响，希望能找到一种效果明确，对血管物理性能影响小，安全、简便易行的方法，以适合将来可能在临床中的使用。

材料与方法

1、材料：

1.1.主要材料与仪器

1.2主要试剂配置：

①灭菌培养液：M199液中加入青/链霉素(50U/ml)和二性霉素(2.5ug/ml)，-20℃保存。

②冷冻液：M199液中加入15％二甲基亚砜(DMSO)，-20℃保存。

③内皮素(ET)，6-酮-前列腺素F1a(6-Keto-PGF1a)放免药盒解放军总医院科技开发中心放免所。

④羊抗兔抗体(第2抗体)，由北京普京康生物技术有限公司提供。

2、处理方法

2.1脐动脉材料的前期处理

在无菌条件下采用无创伤技术分离脐动脉，经200mmHg≤灌注压＜300mmHg液压扩张处理，置于罂粟碱(30mg/500ml)及1％肝素的生理盐水中。后将血管浸泡于灭菌培养液中，在4℃下孵育24小时。送细菌、霉菌培养，培养阴性备用。最后对血管行去抗原性和抗钙化的处理。

2.2脐动脉去抗原性、抗钙化的处理及相关性能检测

2.2.1前期处理后的脐动脉用Hanks液冲洗管腔，后放入装有15％二甲基亚砜(DMSO)的安瓿中封存，置入4℃冰箱中孵化30分钟，使二甲基亚砜能充分渗入细胞，然后移入超低温冰箱以0.5～1.0℃/分钟速度降温，降温至-60℃，维持30～60分钟再投入-180℃液氮中分别保存30天，60天，90天。血管下一步使用前用4℃/min复温方式逐渐复温，并用Hanks液冲洗管腔，去除低温保护剂。

2.2.2戊二醛溶液：以磷酸缓冲液稀释至0.5％，保存于4℃冰箱。上述方法处理后的脐动脉经0.5％的戊二醛处理，并在溶液中加入肝素；溶液Ph值维持在7.3-7.5之间，保存30天。待下一步实验时再取出用生理盐水冲洗干净使用。然后采取样本行病理(常规HE染色)与电镜检查以观察血管组织结构变化情况。

1)脐动脉细胞活性检测

实验方法：实验组为液氮保存60天并经戊二醛处理30天的标本(以下均同)，未处理的脐动脉作为对照组，每组测试6个标本。组织培养：观察细胞生长晕；培养液用M199，含20％胎牛血清。实验组脐动脉与对照组脐动脉组织剪成0.5-1.0mm²小块，漂洗，分别接种在2个培养瓶内，使其在培养瓶中贴壁，加培养液，台盼蓝染色置5％CO2培养箱(37℃)，每周更换培养液1次，观察细胞生长晕；4周内仍无细胞生长定为无活性。血管壁组织培养的细胞种类行进一步鉴定，通过细胞形态的观察和放射免疫学方法的检测(CD31，CD34以及SMA的检测)。

2)放射免疫学技术检测脐动脉内皮细胞活性

实验方法：在无血清培养液中分别培养对照组脐动脉和实验组脐动脉1周，后采用放免方法检测内皮细胞活性(检测内皮素(ET)，6-酮-前列腺素F1a(6-Keto-PGF1a)的浓度)。

3》皮内包埋实验

实验方法：选体重1.5-2.0kg左右的幼年新西兰大白兔，用3％戊巴比妥钠腹腔内麻醉(按35-45mg/kg体重给药)。后在无菌条件下分别把对照组脐动脉与实验组脐动脉包埋于兔背部皮内(共8只，每组n＝4)，每只4个包埋点，进行平行观察，分别于包埋后2W，4W，6W取材观察血管钙化情况。

①大体标本观察：观察埋植标本周围包膜情况

②病理检查：标本用10％甲醛固定，石蜡切片，常规HE染色，光镜下进行钙定性组织学观察(按照Carpentier等分类法将组织的钙化程度分为0度：无钙化；I：有散在的钙化点；Ⅱ度：有明显的钙化；Ⅲ度：呈大块状严重的钙化。)。同时观察血管周围结缔组织被膜和管壁细胞浸润情况和管壁结构变化。

③应用原子吸收火焰法行钙定量测定。

实验方法：标本用日立180-80偏振Zeeman原子吸收光谱仪以火焰法行钙定量测定。原子吸收分光光度法：将未植入动物体内的脐动脉做阴性对照，与动物体内埋植后的脐动脉同时进行测定，将待测样品置于80℃烘箱中烘4小时后取出，加1：1硝酸2ml溶液中进行消化，后移至10ml的容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，最后用原子吸收分光光度计测定样品溶液中的钙含量。

④标本超微结构观察。

实验方法：包埋6W后血管标本做成电镜标本后在透射电镜和扫描电镜下进行组织结构和表面结构的观察。透射电镜观察胶原纤维是否有溶解，断裂，排列紊乱；成纤维细胞结构以及钙化情况。扫描电镜观察内皮细胞层完整度，胶原纤维结构，表面点状密度增高物质等。实验操作步骤如下：

透射电镜检查：

1、2.5％戊二醛与1.0％锇酸双固定

2、50％-100％丙酮梯度脱水，812树脂包埋，后做超薄切片，最后采用H-600观察。

扫描电镜检查：

1、2.5％戊二醛与1.0％锇酸双固定

2、50％-100％丙酮梯度脱水

3、醋酸异戊酯置换

4、CO₂临界点干燥

5、离子溅射喷金，812树脂包埋，后做超薄切片，最后采用S-520观察。

4)免疫学测定

实验方法：把对照组脐动脉及实验组脐动脉分别作成匀浆，一部分保存作血管抗原使用；一部分用羊毛脂+石蜡油乳化，分别于体重1.5-2.0kg(平均1.8±1.3kg)的新西兰大白兔行皮内及足垫注射，每组4只，并于注射后1周行加强注射。后分别于第一次注射后2W，4W，6W取耳缘静脉血，静脉血离心(2100转/分，离心8min)提取上清夜(血清)保存于-20℃冰箱。后各组血管的血清抗体采用第2抗体(羊抗兔抗体)标记，采用Westernblot法分析待测样品，观察血管组织抗原与抗体结合反应。

(结果判断：阳性结果为褐色条带，0为阴性；+为弱阳性；++为阳性；+++为强阳性。)

5)血管物理性能测试

①血管的弹性和顺应性实验方法：测量0-40kPa范围内血管管径相对变化(△D/D₀＝(D－D₀)/D₀，式中D为灌注压为ΔP时的直径，D₀为血管的原始直径。)随压力改变情况。

②血管耐压实验

实验方法：以血管破裂时的管内压作为其耐受压强，分析血管胶原纤维的性能。(每组n＝11)。

③血管弹性(应力-应变关系，δ-a关系曲线)

实验方法：血管径向的应变即血管周长的相对变化等于血管直径的相对变化，则应变定义为δ＝ΔD/D₀＝(D-D₀)/D₀；用切向面张力系数a来表示应力，a定义为管壁纵向单位长度上的横向张力：a＝ΔP·R(R为血管半径)，a的单位为(N/m)或(Pa·m)。求出各组血管的δ-a的光滑拟合曲线即血管的径向应力-应变关系曲线。

3.统计学方法：本实验中统计学数据结果采用均数±标准差表示，计数资料进行X检验，计量资料进行t检验，组间进行T检验，使用SPSS(22.0)统计软件，P<0.05有显著性差异。

实验结果：

1、液氮深低温保存后的脐动脉的形态学观察，如图10～图15所示。

图10～12分别为液氮保存30天，60天，90天的血管标本病理检查，结果显示内皮层随保存时间延长而逐渐脱落；图13～15分别为液氮保存30天，60天，90天的血管标本电镜照片，结果显示平滑肌细胞均无明显破坏现象。

2、脐动脉细胞活性检测及培养细胞种类鉴定结果，如图16～图19所示。

图16～19分别为对照组脐动脉的组织培养与台盼蓝染色的结果，进一步行细胞鉴定结果显示它们分别为内皮细胞和平滑肌细胞；而实验组脐动脉组织培养中均无明显细胞晕形成，仅可见少量散在细胞。

3、脐动脉内皮细胞活性

表2各组血管标本内皮分泌功能检测。

注：实验组与对照组比较，***P<0.01

ET:NSB:2.4％Bo:40.3％正常值:50.8±7.58pg/ml

6-Keto-PGF1a:NSB:4.9％Bo:74.5％正常值:89.63±22.60pg/ml。

4、皮下包埋实验结果

1)大体标本观察：对照组血管在2周末即有包膜包裹，且局部周围组织充血，呈暗红色；6周末包膜明显增厚、变硬，与周围组织粘连明显；切开包膜可见血管颜色变暗红，质软且易脆。而实验组在6周末取材时才发现有一层薄的包膜包裹血管，色苍白；切开包膜见各组血管与包埋前比较无明显变化。(在幼年家兔皮下埋植6周相当于移植入人体内5-12年的病理改变。)

2)病理检查如图20～25所示。

其中，图20：N-2周；图21：N-4周；图22：N-6周；图23：C-2周；图24：C-4周；图25：C-6周。

实验组(N组)：2周，内膜结构不清，中膜弹力纤维及平滑肌排列稍紊乱。外膜小灶炎症细胞浸润，管壁无钙化(0度)。4周，内膜结构不清，其余结构无明显改变，少量散在钙化(I度)。6周，内膜结构不清，中层结构无明显溶解、断裂、排列紊乱等现象，外膜灶状炎细胞及钙化(I度)。

对照组(C组)：2周，内皮细胞有破坏，内膜不清，中层及外层灶状钙化(I度)，外膜周围灶状炎症细胞浸润。4周，外膜炎症明显(﹢﹢﹢)，中层明显钙化(Ⅲ度)。6周，血管组织大量坏死及炎性细胞浸润，血管壁结构显示不清。

3)钙含量测定：

表3各组血管标本钙含量的测定(单位g/Kg)

阴性对照组为：0.68±0.04。(在各个时间点实验组与对照组比较，*P<0.05，***P<0.01。)

4)电镜观察结果：如图26～图31所示。

图26为实验组血管标本的细胞器透射电镜结果(×6000)；图27，28分别为血管内膜，血管壁的扫描电镜结果(×400)。结果显示实验组血管平滑肌纤维排列整齐可见，成纤维细胞结构完整，血管内皮细胞部分丧失，平滑肌表面附着有密度增强的形状不规则物质；血管壁平滑肌纤维密度增加，无明显排列紊乱等现象发生，局部可见到形状不规则的组织钙化区；血管外膜及肌层可见有不规则的组织钙化区。

图29为对照组血管细胞器的透射电镜照片(×6000)；图30，31分别为血管内膜，血管壁扫描电镜照片(×400)。结果显示整个标本内无完整细胞器结构，基质内可见到密度增强的物质和不定形的网状结构；内皮细胞几乎全部丧失，平滑肌纤维结构严重紊乱，部分溶解、断裂成碎片，表面附着有密度增强物质；管壁层次结构不清，组织内可见到散在的点状密度增强物质。

5、免疫学检查：

实验结果：对照组于第2周末兔血清抗体4只均出现强阳性(+++)，6周末抗体水平均明显降低；实验组第2周末均阴性，第4周末有1例出现弱阳性(+)，第6周末有1例出现阳性(++)。(因对照组血管在6W末组织大量坏死，故抗原性明显减低。)

6、血管物理性能检查

1)实验组血管管径随灌注压变化情况及血管爆破压。

表4实验组血管管径随灌注压变化测定以及爆破压检测结果

(注：在0-40kPa测量范围内，对照组与实验组抗爆破压均＞40kPa；进一步加大测量范围，两组抗爆破压均＞60kPa。)

2)两组血管顺应性研究，实验结果如提32、33所示：

图32示对照组应力-应变关系曲线；图33示实验组应力-应变关系曲线。从图33可知实验组应力-应变关系曲线最接近于直线，根据牛顿力学定律可知该组血管反映出其具有较好的顺应性。

同种异体的血管材料在应用于受体之前必须具备以下基本条件:(1)不具有或尽量小的抗原性；(2)不易钙化；(3)能维持原组织的机械强度和塑型。由于脐动脉属于同种异体血管，则在应用脐动脉之前，我们必须对其行去抗原性和抗钙化等处理。

1.液氮深低温处理

液氮中温度可达-150～-196℃，此时血管所有的物理、化学变化均降至最低限度，可以保证细胞长期存活。然而低温虽可降低移植物的抗原性，保留一定的生物、物理学性能，但低温对组织有一定的损害作用，而且低温保存时间越长其损害越重。为了观察液氮保存时间对血管的影响，本实验中分别于保存30天，60天，90天后取材行形态学观察。结果显示内皮层随保存时间延长而脱落逐渐明显；但血管肌层结构无明显改变，呈环形或螺旋形排列，外膜无损伤。进一步行电镜检查显示成纤维细胞、平滑肌细胞保存完整，细胞器正常。则低温冷存时间越长，对血管内皮的损害越大。然而冷冻虽可以使血管抗原性较强的内皮细胞损伤、脱落，从而有利于降低抗原性，但同时这也增加了血栓形成的危险性。内皮损伤的原因是多方面的，动脉制备时间、冷冻及复苏的速度，冷冻保护剂的使用、抗生素的选择及浓度，保养液的成分，对细胞的存活均有重要的影响。其中温度的急剧变化是细胞损伤最重要的因素，所以采用适宜的冷冻速度与解冻速度是减少细胞损伤的重要途径。在本实验中，为最大限度地减少低温损伤，保持血管的生物活性，我们选用15％的二甲基亚砜作为低温保护剂；为保证冷冻速度与冷冻剂充分渗透的一致性，采用逐级降温，首先将包装好的血管置于4℃冰箱中孵化30分钟，使二甲基亚砜能充分渗入细胞，然后移入超低温冰箱以0.5～1.0℃/分钟速度降温，降温至-60℃，维持30～60分钟后再投入-196℃液氮气相、液相中保存。另一方面由于细胞成分多样，细胞间质存在，在复温过程中，若热量交换不均匀，外周组织内冰晶融化可从内部吸收热量，使内部组织再结晶加重，可造成细胞严重的机械性损伤。另外，低温蛋白质的变性，脂质的丢失，细胞膜通透性的改变以及细胞膜上小孔的形成，使水分子易通过细胞膜，引起细胞内水负荷加重，超过一定时间或程度时，细胞便会破裂。临床上常用的37-42℃水浴复温法，其复温速率不均匀，细胞损害重，活性低，可能与细胞再结晶重，高水负荷状态持续时间长有关。有研究发现不同复温速率对液氮保存的同种生物材料均有损害。30℃/min和10℃/min复温，温差大，细胞内再结晶重；1℃/min复温，虽然再结晶轻，但细胞内高水负荷持续时间长，细胞损害亦重；而4℃/min复温方法较好地保持了细胞活性，可能与热交换时间充裕，再结晶轻，细胞内高水负荷状态未超临界值有关。所以在本实验中我们选用了4℃/min复温方法。另外该组血管行皮下包埋实验显示，血管内膜结构在各个时间点均显示不清，而中膜弹力纤维及平滑肌结构无明显破坏；在4周后血管才出现少量散在钙化；在包埋过程中仅外膜有小灶炎症细胞浸润。并且血管的钙含量测定显示，与对照组比较，本实验组血管在各个观察时间点钙化明显降低(见表3)。上述结果初步说明该种方法处理后的血管具低免疫原性和低钙化现象；而且从免疫学检查测定结果可知该组血管免疫排斥反应出现最弱且较迟。深低温冷冻降低了同种异体血管的抗原性，这可能是抗冻保护剂的浸泡，深低温冷冻本身，也可能是二者共同作用改变了细胞表面的抗原标志，或者是使这种标志丧失。血管物理性能方面，血管内压力测试显示该组血管与新鲜脐血管，经逐渐注水加压测定，两者耐压力无显著性差异；同时该组血管的应力—应变关系曲线最趋于直线，见图33。因而经液氮深低温处理过的脐动脉不但具有良好的耐压性能而且具有较好的顺应性。周建生等从内皮细胞代谢活性、超微结构和移植通畅率等方面观察得出-60℃是同种异体动脉冷冻保存较理想的维持温度；并提出这可能与内皮细胞在该温度下发生适度的收缩有关，这种收缩现象可有效地抑制速冻至-196℃时细胞内冰晶形成，进而防止了快速复温过程中稀释性休克对细胞的损伤，使内皮得到较好保存。在本实验中我们亦采用将-60℃作为维持温度，后再行液氮保存；然而内皮细胞层随保存时间延长而脱落逐渐明显，并未能较好地保存内皮层结构。因此在以后实验中需进一步探讨更适合脐动脉的冷冻维持温度值。

2、醛化处理

同种异体血管在移植前应用交联剂作预处理，使血管壁的氨基酸残基有效交联，以达到封闭抗原，降低免疫反应，减少血小板黏附沉着的效果。戊二醛(GA)是通过其所具有的双醛基与氨基酸长链上的-NH2反应，失水后形成肽键，从而封闭移植血管上的抗原。临床上现常规采用戊二醛处理移植物，不仅能消除内皮细胞，还均能通过交联反应封闭胶原纤维抗原，从而降低免疫反应程度，提高通畅率。而在戊二醛浓度方面有研究认为只有较高浓度的戊二醛(>2％)才会对机体有毒副作用，而低于0.2％的戊二醛又无法封闭移植血管上的足够抗原，本实验中我们摸索采用0.5％戊二醛处理同种异体血管可取得良好的去抗原和抗钙化效果。

3、血管内皮分泌功能研究

内皮素(endothelin,ET)是一种从血管内皮细胞中分离纯化出的21个氨基酸组成的生物活性多肽，具有强烈的收缩冠状动脉，肾小动脉、刺激心钠素(ANP)的释放，提高全身血压，抑制肾素释放等作用。前列环素(PGI2)是由血管壁内皮细胞合成和释放的一种抗血小板聚集和舒张血管的生物活性物质，生物半衰期约3分钟，迅速代谢生产6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1a)。为了解脐动脉处理后血管内皮分泌功能状况，在本实验中我们分别检测对照组新鲜血管与实验组的培养液中二者含量，结果显示各组培养液中均未检测出ET含量；而实验组无血清培养液亦可检测出6-Keto-PGF1a。虽然与对照组比较显著性降低，但这对防止血管移植后血管痉挛或血栓形成将起到一定作用。

目前同种异体血管研究中存在三个主要问题，即保持血管物理性能，消除抗原性、消毒灭菌和长期保存。在本实验中实验组组所用标本均为液氮深低温保存60天的脐动脉。从上述实验结果可知该保存期内的脐动脉的去抗原、抗钙化效果良好，血管物理性能影响较小，结构保存较完整；因而它使将来脐动脉的应用成为可能，并且可在一定的时间内建立血管库。

小结：采用液氮深低温+戊二醛(GA)方法处理脐动脉后的去抗原、抗钙化效果良好，对血管物理性能影响较小，并易实施，且可较长时间保存。

实施例3脐动脉应用的动物实验研究

实验目的：

从实施例2可知，液氮深低温保存+戊二醛处理脐动脉后的去抗原、抗钙化效果良好，且对血管物理性能影响较小，并易实施，因而成为我们进行动物实验备选的血管材料。为了进一步探讨脐动脉的可应用性，我们设计动物模型进行在体研究观察液氮深低温+戊二醛处理的脐动脉移植后的血管通畅情况以及血管形态学改变，为脐动脉应用于临床提供基础实验数据。

材料与方法

一、主要材料与仪器：

二、方法：

(一)兔颈动脉置换术

1、选用1.5-2.2kg(平均体重1.8±1.2kg)的新西兰大白兔行动物实验(由北京医科大学动物实验室提供)。

2、在无菌条件下分别采用未处理的脐动脉(对照组)，液氮保存60天+戊二醛处理的脐动脉(实验组)置换兔的单侧颈动脉，每组10只；置换段血管平均长度为5±1.1cm。

3、实验操作过程：首先用3％戊巴比妥钠行腹腔内麻醉(按35～45mg/kg体重给药)。固定于兔架后显露单侧颈部，局部去毛消毒后，逐层剪开皮肤、皮下组织及肌肉组织，显露颈动脉，局部喷洒罂粟碱盐水；通过兔耳缘静脉给予肝素生理盐水(1mg/kg)。后阻断颈动脉两侧，截取中间段约5cm，采用7/0prolene线行端端吻合。充分止血后逐层缝合。

4、术后饲养6周，行血管超声检查观察血管通畅情况。检查完毕处死动物，取出移植段血管，分别行病理和电镜检查。

(二)猪冠状动脉架桥术

1、选用28-34kg(平均体重31±2.4kg)，月龄6-8月(平均6.9±2.6月)的小型猪行动物实验(由北京农业大学提供)。

2、在清洁条件下分别采用对照组脐动脉，实验组脐动脉在猪心表面行冠状动脉架桥术。作为桥血管的动脉平均长度为15±2.7cm(存活共5只，采用全麻不停跳技术搭桥)。

3、实验操作过程：首先用氯胺酮和安定(4：1比例)行诱导麻醉，然后进行耳缘静脉穿刺，给予MG3，生理盐水维持补液；充分诱导后通过静脉给予阿端、异丙酚、芬太尼后行气管插管，给予呼吸机辅助呼吸，60％氧浓度供氧。仰卧位，用碘酒消毒后铺单，经胸骨正中切口入胸，切开心包同时给予肝素(Kg×1mg)；后采用不停跳技术用实验组脐动脉和对照组脐动脉于升主动脉和左冠状动脉前降支之间行架桥术。术中行心电血压监测，并给予多巴胺、肾上腺素、硝酸甘油等血管活性药物。术毕不用鱼精蛋白中和肝素。充分止血，放置纵隔引流管，用钢丝固定胸骨，间断缝合肌肉和皮组织。后用血管超声仪经胸行桥血管超声检查。待猪充分清醒后拔出气管插管。术后给予青霉素抗炎、5％葡萄糖溶液补液治疗2天；不给予抗凝及抗血小板药物治疗。于术后24小时拔除纵隔引流管。给予猪普通饲料喂养。

4、于术后3月行在体和取材进行观察

①行冠状动脉造影术检查。

②大体解剖标本的观察：检查移植血管与宿主动脉以及周围组织的结合情况，尤其是吻合口的形态变化；直接观察动脉搏动及血管充盈情况，评价血管通畅率。然后游离出移植血管，离体后纵向剖开血管，观察管腔内表面。

③分别对血管行组织病理学检查(HE染色)，观察血管内皮层，肌层形态结构变化。

④电镜观察：扫描电镜观察：切取移植血管，包括两端吻合口。观察移植血管血流接触面的细胞活动情况，尤其是新生内皮细胞覆盖情况。透射电镜：观察移植血管管壁各层的组织学改变，尤其是管壁细胞的细胞器变化。

5、检验结果采用均数±标准差表示，使用SPSS(22.0)统计软件，计数资料进行X检验，计量资料进行t检验，P<0.05有显著性差异。

实验结果：

(一)兔动物模型结果

1、术后6周末血管超声检查显示实验组移植血管通畅率为9/10，通畅的血管内径为0.23±0.07cm，血流速98.76±24.83cm/s；通畅的血管腔无明显狭窄，管腔内亦未发现有附壁血栓形成，而吻合口处有轻-中度狭窄；未通畅的1条血管超声检查发现吻合口闭塞；取材过程中发现血管颜色、柔韧性与术前比较无明显变化；血管与周围组织粘连较轻，容易游离。对照组脐动脉血管超声检查显示血管通畅率为0/10，血管腔不明显；取材过程中发现移植血管周围组织粘连严重，无法完整分离血管，而且血管局部有坏死软化的表现。

2、病理检查(HE染色)显示：如图34～图45所示。

图34示实验组血管移植前病理检查(HE染色)显示结果；

图35示实验组血管移植后6W病理检查(HE染色)显示结果；

图36示对照组血管移植前病理检查(HE染色)显示结果；

图37示对照组血管移植后6W病理检查(HE染色)显示结果；

图38示实验组血管移植前细胞器透射电镜检查(×6000)结果；

图39示实验组血管移植后6W细胞器透射电镜检查(×6000)结果；

图40示实验组血管移植前内膜扫描电镜检查(×400)结果；

图41示实验组血管移植后6W内膜扫描电镜检查(×400)结果；

图42示对照组血管移植前内膜扫描电镜检查(×1000)结果；

图43示对照组血管移植后6W内膜扫描电镜检查(×1000)结果；

图44示对照组血管移植前细胞器透射电镜检查(×6000)结果；

图45示对照组血管移植后6W细胞器透射电镜检查(×6000)结果。

光镜下见实验组血管移植后肌层结构较完整，局部有轻度溶解、断裂、排列紊乱等现象，动脉炎性细胞浸润少，炎性细胞多分布在外膜层、少许在中膜层。电镜显示血管结构较完整，平滑肌细胞器无明显破坏，内膜有新生内皮细胞衬履；对照组脐动脉移植后光镜下可见血管炎性细胞密集分布，多侵入外膜、中膜层，甚至内皮下层，内皮细胞坏死，平滑肌多溶解、断裂、排列紊乱。电镜下见平滑肌细胞坏死，无完整细胞器结构；基质内可见到密度增强的物质。

(二)猪动物模型结果

1、术后即行经胸血管超声检查显示：各桥血管通畅，实验组脐动脉血管管径为4.37±0.56mm，血流流速为84.64±10.57cm/s；对照组脐动脉血管管径为4.55±0.84mm，血流流速为78.51±12.28cm/s。

2、冠脉造影术检查：实验组桥血管通畅率为3/5；对照组桥血管通畅率为0/5，P＜0.01。

3、桥血管大体标本观察：实验组脐动脉桥血管与术前比较，颜色、柔韧性、管径大小无明显变化，与周围组织粘连较轻，容易分离，但周围组织较正常组织颜色加深，呈暗红色；其中2根不通畅的桥血管解剖后显示两侧吻合口闭塞，剖开血管腔见腔内局部有血栓形成，与管壁容易分离，而其余部分腔面光滑，未见附壁血栓形成。对照组脐动脉组由于血管与周围组织粘连较重，无法游离血管，剖开血管腔显示血管吻合口闭塞，腔内多处增生致管腔狭窄，可见多处附壁血栓形成。

4、脐动脉移植后3月：光镜检查(HE染色)：如图46～图51所示。

图46示实验组脐动脉移植后3月血管标本病理检查结果；

图47示对照组脐动脉移植后3月血管标本病理检查结果；

图48示实验组脐动脉移植前内膜扫描电镜检查(×400)结果；

图49示实验组脐动脉移植后3月内膜扫描电镜检查(×400)结果；

图50示对照组脐动脉移植前细胞器透射电镜检查(×6000)结果；

图51示对照组脐动脉移植后3月细胞器透射电镜检查(×6000)结果。

光镜下见实验组血管移植后动脉炎性细胞浸润少，炎性细胞多分布在外膜层、少许在中膜层；管壁局部有坏死现象。电镜显示血管结构较完整，内膜有大量新生内皮细胞衬履，内皮细胞重叠；肌层局部有溶解、断裂，部分肌细胞纤维化，外膜与周围组织相连。超微结构研究发现增厚的内膜主要是平滑肌样细胞。对照组脐动脉移植后:光镜下可见血管炎性细胞密集分布，多侵入外膜、中膜层，甚至内皮下层，内皮细胞坏死。电镜下见平滑肌细胞坏死，超微结构改变包括内质网膨胀，吞噬溶酶体的存在，细胞突起减少甚至肌细胞完全消失。

血管的抗原性主要集中在内皮细胞，有少量抗原存在于胶原纤维。经液氮深低温冷冻保存处理脐动脉后，内皮细胞大部分脱落，则移植初期血管壁主要由胶原纤维、弹力纤维构成。所以移植初期血管的抗原主要集中在胶原纤维，而胶原纤维的抗原决定簇是它的末端肽链、螺旋结构和氨基酸顺序a-链。戊二醛是通过其所具有的双醛基与氨基酸长链上的-NH2反应，失水后形成肽键，从而封闭移植血管上的抗原。临床上现常规采用戊二醛处理移植物，不仅能消除内皮细胞，还均能通过交联反应封闭胶原纤维抗原，从而降低免疫反应程度，提高通畅率。虽然低温保存及免疫反应损伤移植血管的内膜，诱导炎症细胞、T细胞、单核细胞及血小板在血管壁蓄积而存在一个持续的内膜损伤，目前认为移植血管的免疫排斥反应在移植1月后开始上升，2月达到高峰，引起血管内皮细胞的变性、坏死。但采用深低温冷冻+戊二醛处理脐动脉在移植早期可抑制免疫排斥反应；而血管植入体内2-6月可内皮化，内膜可通过平滑肌细胞在内膜复制对损伤进行修复。在本实验兔模型中发现实验组脐动脉移植组中内膜在移植6周后有新生内皮细胞衬履爬行替代。但有关内皮细胞的来源尚不清楚，而且在内皮化之前移植血管抗凝功能是否需要人工干预值得进一步研究。目前关于移植血管内皮细胞的来源，有以下几种观点：①爬行学说：宿主细胞越过吻合口向移植血管迁移直到覆盖全部管腔内表面。但回顾性研究报道较长的人工血管植入体内，即使长期保持通畅，内皮细胞一般也只能覆盖吻合口附近1cm长的移植血管血流接触面。②宿主内皮细胞或多能干细胞通过毛细血管壁钻入移植血管。③着陆学说：血液中的内皮细胞附着于移植血管内表面。这大多在人工血管移植模型中得到证实。④分化学说：平滑肌细胞分化、移行而来。

由于移植血管的通畅率与其长度有关，在本实施例中我们首先在兔模型中观察较短脐动脉应用于动物模型中的近期通畅率与病理改变。实验结果发现较短的实验组脐动脉应用于兔模型中有良好的通畅率，而且血管移植6周后无明显形态学改变。因而我们进一步将该种脐动脉应用于猪心脏搭桥术。

在猪模型实验中对照组脐动脉移植3月后所有脐动脉均有血栓形成，呈特征性病理改变，内皮细胞广泛坏死、脱落，血管壁各层大量炎性细胞浸润，而且肌纤维溶解、断裂，排列紊乱。由于血管移植后的免疫排斥反应主要表现在内膜细胞变性，血流接触面附壁血栓的形成，中晚期则以中层平滑肌细胞变性、坏死、纤维化及内膜粥样硬化，进而使管腔变狭窄、阻塞为主。但在实验组脐动脉移植组中通畅血管无明显血栓形成，而且移植后组织损伤少，血管基本组织结构完整，这说明实验组脐动脉去抗原效果明显。并且我们得出，经深低温冷冻保存+戊二醛处理的脐动脉移植后不受强烈的免疫排斥反应，这可能主要因为：脐动脉作为桥血管血流速度快，则血液中的淋巴细胞、抗体、补体不易附着；移植血管的抗原表达主要集中在内皮细胞上，而经深低温冷冻保存后有相当一部分内皮细胞脱落；在移植后，受者的内皮细胞很快将血管内壁覆盖，起到隔离循环血液的作用，从而使其不暴露在受体免疫系统中。从组织学角度看移植血管长期通畅取决于血管内膜是否有内皮细胞完整覆盖。血管内皮细胞表面呈强负电荷，同带负电荷的红细胞、白细胞和血小板相互排斥，能摄取分解使血管收缩的活性物质，清除血液中的凝血酶，因而对防止血栓形成，维持血管通畅起到极其重要的作用。而深低温冷冻保存+戊二醛处理的脐动脉移植后有部分内皮细胞覆盖管腔，进而防止血栓形成，维持血管通畅，为供体血管组织被宿主组织代替赢得时间。

在本实验手术过程中，实验组与对照组血管在移植后均充盈良好，未发现有血管痉挛发生。这可能主要因为：脐动脉不接受外来神经系统支配；而经一定范围内的液压扩张破坏了平滑肌的肌小节功能单位，从而使血管失去回缩作用；另外冷冻使血管各层细胞尤其血管平滑肌细胞部分坏死使血管丧失收缩能力，而在持续性动脉灌注压力下，冷冻后的血管处于被动扩张状态。

然而实验也发现实验组脐动脉即使是移植后通畅的动脉，也存在着一些中层坏死组织，而中层平滑肌破坏主要与免疫排斥反应有关，在本实验中亦与冷冻保存有关。不过有实验发现中层平滑肌变性在6周内即有修复，虽然其部分呈纤维化，血管壁弹性减弱，但作为血管管道作用是完全可行的。由此推断，移植后通畅的血管可能只是成功地起了支架作用，动脉内层最终将由宿主血管内皮细胞爬行替代，从而起到血管通道作用。另外就血管管道作用而言，选用脐动脉做移植材料，移植后其组织层次明确，结构致密，管腔组织结构支持作用应比静脉移植材料要优越，而且移植后的血管不须经过静脉动脉化的过程。

从上述的实验结果说明经过液氮深低温+戊二醛处理的新生儿脐动脉保持了血管壁大部分结构的完整性，降低了抗原性，保存了血管一定活性，应用于动物模型中内皮细胞重新覆盖，从而减少血栓形成，同时血管无痉挛发生，以致移植血管有较高的通畅率。由此说明了该种方法处理的脐动脉作为血管移植物有着良好的前景。不过在该实验中脐动脉移植属于异种移植，若将其应用于临床，则为同种异体移植，理论上移植血管的免疫排斥反应将进一步降低；由于血管钙化与免疫排斥反应，则同种异体移植后血管钙化现象将进一步减弱。因此移植后血管通畅率将进一步提高。

但本实验亦发现经过液氮深低温+戊二醛处理的新生儿脐动脉移植失败的主要问题是血管吻合口组织增生，容易形成狭窄甚至闭塞。由于正常血管的内1/3由管腔内血液渗透供给营养，而血管壁2/3由滋养血管供给营养。则无论是新鲜自体血管移植还是异体血管移植，移植的血管将要断绝血供，该移植血管段均不能直接复活，所移植血管段经过变性及血管内皮的脱落与再生，最终血管内膜被内皮细胞所覆盖，血管壁被纤维组织所取代；有实验发现移植后3～14天，移植血管段退变显著，可引起吻合口有不同程度狭窄，此期多导致血管栓塞。从这一点说明有必要对移植血管进行抗凝治疗，以提高血管近期通畅率。目前影响异体动脉移植段远期通畅率的因素可分为内源性和外源性两类，外源性因素包括：(1)手术技术缺陷：未遵循无创伤原则，吻合技术所致吻合口狭窄、扭曲等；(2)流出道受阻；(3)其他：如内毒素、感染等。而内源性因素包括：(1)免疫排斥反应；(2)管壁结构的病理性改变，如钙化；(3)生物力学的不匹配，如顺应性的改变；(4)移植段功能的改变，如PGI2的释放减少，TxA2的释放增加。由于液氮深低温+戊二醛处理的脐动脉具有良好的顺应性，低免疫原性，低钙化效果，而且尚存的内皮细胞可分泌PGI2；因此影响移植血管远期通畅率的内源性因素均减弱。但在本动物实验中因无严格的无菌手术条件等因素存在，可能影响了脐动脉移植的远期通畅率。所以在脐动脉应用于临床之前，我们需要：完善影响移植血管远期通畅率的外源性因素，增加动物实验规模以提供更有效的数据；探讨血管移植后是否需要抗凝以及免疫抑制剂的干预治疗；进一步完善液氮深低温+戊二醛处理技术以更有效地保存脐动脉，例如最佳冷冻维持温度值的研究，最佳保存期的研究，以及最佳戊二醛浓度抗钙化的研究等问题，从而为冠脉搭桥提供新的血管材料来源。

小结

1、液氮深低温+戊二醛处理的新生儿脐动脉保存了血管壁大部分结构的完整性和血管活性，降低了抗原性，应用于动物模型中内皮细胞重新覆盖，减少血栓形成，从而有较高的近期血管通畅率。

2、液氮深低温+戊二醛处理的新生儿脐动脉移植失败的主要问题是血管吻合口组织增生，形成狭窄甚至闭塞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.脐动脉在制备冠脉搭桥的移植血管材料中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脐动脉经去抗原和/或抗钙化处理。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述去抗原和/或抗钙化采用液氮处理和/或醛化处理。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述液氮处理的保护剂包括体积浓度为15％的二甲基亚砜；

所述液氮处理前还包括预冻的步骤；所述预冻具体为：于4℃冰箱中孵化30min，以0.5～1.0℃/min速度降温，降温至-60℃，维持30～60min后再置于-196℃液氮保存；和或所述液氮处理后还包括复温的步骤；所述复温速度为：4℃/min。

5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述醛化处理采用醛基试剂，所述醛基试剂包括浓度为0.5％的戊二醛。

6.制备冠脉搭桥的移植血管材料的方法，其特征在于，包括去抗原和/或抗钙化处理的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述去抗原和/或抗钙化采用液氮处理和/或醛化处理。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液氮处理的保护剂包括体积浓度为15％的二甲基亚砜；

所述液氮处理前还包括预冻的步骤；所述预冻具体为：于4℃冰箱中孵化30min，以0.5～1.0℃/min速度降温，降温至-60℃，维持30～60min后再置于-196℃液氮保存；和或所述液氮处理后还包括复温的步骤；所述复温速度为：4℃/min。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述醛化处理采用醛基试剂，所述醛基试剂包括浓度为0.5％的戊二醛。

10.如权利要求6至9任一项所述方法制得的冠脉搭桥的移植血管材料。

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