DE69719992T2

DE69719992T2 - Verfahren zur verhinderung von verkalkung von glutaraldehyd fixierten implantaten und artikeln die nach dem verfahren hergestellt sind

Info

Publication number: DE69719992T2
Application number: DE69719992T
Authority: DE
Inventors: Shih-Hwa Shen; Jun Yang
Original assignee: Edwards Lifesciences Corp
Current assignee: Edwards Lifesciences Corp
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 2003-12-11
Anticipated expiration: 2017-06-20
Also published as: EP0915714B1; EP0915714A1; DE69719992D1; WO1998004299A1; CA2261811A1; CA2261811C; JP2000516489A; ATE234645T1; US5935168A; US5782931A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf Verfahren zur Herstellung bioprothetischer Vorrichtungen, und im Spezielleren auf ein Verfahren zur Abmilderung von Verkalkung und zur Verbesserung der Dauerhaftigkeit glutaraldehydfixierter bioprothetischer Vorrichtungen.

Hintergrund der Erfindung

Der Stand der Technik umfasst zahlreiche Verfahren zum chemischen "Fixieren" (d. h. Tannieren) biologischer Gewebe. Ein solches chemisches Fixieren der biologischen Gewebe wird oftmals als Mittel zum Konservieren solcher Gewebe eingesetzt, so dass diese als bioprothetische Vorrichtungen verwendet oder darin eingebaut werden, die in den Körper eines Patienten implantiert oder daran angebracht werden. Beispiele fixierter biologischer Gewebe, die bisher als Bioprothesen verwendet wurden, umfassen Herzklappen, Blutgefäße, Haut, Dura Mater, Perikard, Bänder und Sehnen. Diese Gewebe enthalten typischerweise eine Bindegewebsmatrix, die als Stützrahmen für die Gewebe wirkt. Das zelluläre Parenchym jedes Gewebes ist innerhalb seiner Bindegewebsmatrix angeordnet und wird von dieser gehalten.
Kollagen und Elastin sind zwei Substanzen, aus denen das Bindegewebsgerüst der meisten biologischen Gewebe aufgebaut ist. Die Biegsamkeit bzw. Starrheit jedes biologischen Gewebes wird weitestgehend von den relativen Kollagen- und Elastinmengen bestimmt, die im Gewebe vorhanden sind, und/oder durch die physikalische Struktur und die Konfiguration des Bindegewebsgerüsts.
Jedes Kollagenmolekül besteht aus drei (3) Polypeptidketten, die in einer helixartig gewundenen Konfiguration miteinander verdrillt sind. Chemische Fixiermittel (d. h. Tanniermittel), die zur Konservierung kollagener biologischer Gewebe verwendet werden, bilden im allgemeinen chemische Vernetzungen zwischen den Aminogruppen auf den Polypeptidketten innerhalb eines bestimmten Kollagenmoleküls oder zwischen benachbarten Kollagenmolekülen.
Die zwischen Polypeptidketten innerhalb eines einzelnen Kollagenmoleküls gebildeten chemischen Vernetzungen werden als "intramolekular" bezeichnet, während die zwischen Polypeptidketten verschiedener Kollagenmoleküle gebildeten Vernetzungen als "intermolekular" bezeichnet werden.
Chemische Fixiermittel, die zur Vernetzung kollagener biologischer Gewebe verwendet wurden, umfassen Formaldehyd, Glutaraldehyd, Dialdehydstärke, Hexamethylendiisocyanat und verschiedene Polyepoxidverbindungen. Insbesondere hat sich Glutaraldehyd als geeignetes Mittel zum Fixieren verschiedener biologischer Gewebe bewährt, die für eine spätere chirurgische Einpflanzung verwendet werden. Tatsächlich wurde Glutaraldehyd als chemisches Fixiermittel für viele im Handel erhältliche Bioprothesen weit verbreitet eingesetzt, wie beispielsweise bioprothetische Herzklappen auf der Basis von Schweinegewebe (d. h. die auf Schweinegewebe basierende Stent- Bioprothese Carpentier-Edwards®; Baxter Healthcare Corporation, Edwards CVS Division, Irvine, CA 92714-5686), die auf Rindergewebe basierende Perikardherzklappenprothesen (z. B. Carpentier-Edwards® Pericardial Bioprosthesis, Baxter Healthcare Corporation, Edwards CVS Division; Irvine CA 92714-5686), und stentlose auf Schweinegewebe basierende Aortaprothesen (z. B., Edwards® PRIMATM Stentless Aortic Bioprosthesis, Baxter Edwards AG, Spierstrasse 5, GH6048, Horn, Schweiz).
Ein Problem, das mit der Implantation bioprothetischer Materialien zusammenhängt, besteht darin, dass Kollagen und Elastin, die typischerweise in diesen Materialien enthalten sind, zum Verkalken neigen. Eine solche Verkalkung kann zu einer unerwünschten Versteifung oder Verschlechterung der Bioprothese führen. Es ist bekannt, dass sowohl intrinsische als auch extrinsische Verkalkung in fixierten kollagenen Biogeweben auftritt, obwohl der genaue Mechanismus oder die genauen Mechanismen aufgrund dessen bzw. derer eine solche Verkalkung auftritt, unbekannt ist bzw. sind.
Klinische Erfahrung und Experimentaldaten haben gelehrt, dass glutaraldehydfixierte kollagene Bioprothesen die Tendenz aufweisen können, früher zu verkalken als andere Bioprothesen, die mit einem anderen, nicht aldehydhaltigen Fixiermittel fixiert wurden. Es wurde berichtet, dass eine solche beschleunigte Verkalkung von glutaraldehydfixierten Bioprothesen am vorwiegendsten bei Pädiatriepatienten auftritt. (Carpentier et al., Continuing Improvements in Valvular Bioprostheses, J. Thorac Cardiovasc. Surg. 83: 27-42, 1982.) Eine solche schnellere Verkalkung ist insofern unerwünscht, als sie zu einer Verschlechterung und/oder einem Ausfall der implantierten Bioprothese führen kann. Angesichts dieser Neigung zu schnellerer Verkalkung glutaraldehydfixierter Bioprothesen bei jungen Patienten, sprachen sich Chirurgen typischerweise dafür aus, mechanische Herzklappen oder (falls verfügbar) Homotransplantate in pädiatrische oder relativ junge Patienten einzusetzen (d. h., Patienten, die unter 65 Jahre alt sind), und keine glutaraldehydfixierten bioprothetischen Klappen. Patienten, die mechanische Herzklappenimplantate erhalten, bedürfen jedoch einer andauernden Behandlung mit gerinnungshemmenden Medikamentengaben, die mit einem erhöhten Blutungsrisiko in Zusammenhang gebracht werden kann. Auch sind Homotransplantate von begrenzter Verfügbarkeit und können mit Pathogenen behaftet sein, die zu einer Infektion führen können.
Die Faktoren, die die Geschwindigkeit bestimmen, mit der glutaraldehydfixierte bioprothetische Transplantate verkalken, wurden noch nicht vollständig aufgeklärt. Faktoren, von denen man annimmt, dass sie die Verkalkungsgeschwindigkeit beeinflussen, umfassen jedoch:
a) das Alter des Patienten;
b) bestehende Stoffwechselstörungen (d. h., Hyperkalzämie, Diabetes, etc.);
c) Nahrungsfaktoren;
d) Rasse;
e) Infektion;
f) parenterale Kalziumverabreichung;
g) Dehydratation;
h) Distorsion/mechanische Faktoren;
i) inadäquate Gerinnungsbehandlung während der Anfangszeit nach einer chirurgischen Implantation; und
j) Reaktionen auf Fremdgewebe.
Viele Forscher haben versucht, Wege zur Abmilderung der in situ- Verkalkung von glutaraldehydfixierten Bioprothesen zu entdecken. Eingeschlossen in diesen verkalkungsmildernden Techniken sind die Verfahren, die beschrieben sind im US-Patent Nr. 4,885,005 (Nashef et al) mit Titel "Surfactant Treatment of Implantable Biological Tissue To Inhibit Calcification"; dem US-Patent Nr. 4, 648,881 (Carpentier et al.) mit dem Titel "Implantable Biological Tissue and Process For Preparation Thereof; dem US-Patent Nr. 4,976,733 (Girardot) mit dem Titel "Prevention of Prosthesis Calcification"; dem US-Patent Nr. 4,120,649 (Schechter) mit dem Titel "Transplants", dem US-Patent Nr. 5,002,2566 (Carpentier) mit dem Titel "Calcification Mitigation of Bioprosthetic Implants"; in der EP 103947 A2 (Pollock et al.) mit dem Titel "Method for Inhibiting Mineralization of Natural Tissue During Implantation" und der WO84/01879(Nashef et al.) mit dem Titel "Surfactant Treatment of Implanatable Biological Tissue to Inh/bit Calcification"; und in Yi, D,. Li u, W., Yang, J., Wang, B., Dong, G., und Tan,H; "Study of Calcification Mechanism and Anti-calcification On Cardiac Bioprostheses", S. 17-22, Proceedings of Chinese Tissue Valve Conference, Beijing, China, Juni 1995. Das US-Patent Nr. 4,038,888 offenbart ein Verfahren zum Abmildern der Verkalkung biologischen Gewebes durch Anlagern von Aspirinmolekülen an die Gewebe. Das Aspirin ist über ein Diamin gebunden.
Im Stand der Technik besteht ein Bedarf nach der Entwicklung neuer Verfahren zum Hemmen oder Abmildern der Verkalkung von glutaraldehydfixierten biologischen Geweben.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung glutaraldehydvernetzter Gewebe, die Kollagen und/oder Elastin enthalten bereit, um die Neigung solcher Gewebe zu späterer Verkalkung abzumildern, indem mindestens einige der Carboxylgruppen, die in den Kollagen- und/oder Elastinmolekülen vorkommen, durch carboxylfreie Nebengruppen ersetzt werden, um dadurch die Stellen zu beseitigen, an denen Kalzium chemisch oder physikalisch an die Proteinmoleküle (d. h., die Kollagen-; Elastinmoleküle) gebunden werden könnte. Danach kann die Bioprothese wieder in Glutaraldehyd getaucht oder diesem ausgesetzt werden. Falls die carboxylfreien Nebengruppen, die sich auf den Kollagen- und/oder Elastinmolekülen bilden, glutaraldehydreaktive Gruppen beinhalten (z. B. NH&sub2;-Gruppen), führt das nachfolgende Einwirkenlassen von Glutaraldehyd zur Bildung zusätzlicher Glutaraldehydvernetzungen zwischen den mit Glutaraldehyd reagierenden Gruppen.
Nach der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das im allgemeinen die in Anspruch 1 dargelegten Schritte umfasst.
Die im Schritt (d) des Verfahrens gebildeten aktivierten Carboxylkomponenten sind typischerweise o-Acylisoharnstoffgruppen der molekularen Formel CO.
Das kollagenhaltige Gewebe von Schritt (a) des Verfahrens kann jede Art von Kollagengewebe umfassen, wie Herzklappen, Blutgefäßsegmente, Aortenwurzelsegmente mit einer darin angeordneten Aortenklappe, Perikard; Sehnen, Bänder, Haut, etc. Diese Kollagengewebe können aus jeder geeigneten Quelle gewonnen werden, und können in vielen Fällen vom Schwein oder Rind stammen.
Das in Schritt (d) des Verfahrens verwendete carboxylaktivierende Mittel veranlasst die Carboxylgruppen (COOH-Gruppen), die in den Kollagenmolekülen vorhanden sind, zu einer Umwandlung in aktivierte Carboxylkomponenten (z. B., o-Acylisoharnstoff), die mit Aminogruppen eine Reaktion eingehen. Beispiele für Carboxylaktivatorverbindungen, die für diesen Zweck verwendet werden können, umfassen folgende: 1-Ethyl- 3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimidhydrochlorid (EDC); Dihexylcarbodiimid (DCC); 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-Dimethylpentyl)carbodiimidiodid (EAC). In vielen Anwendungen ist 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimidhydrochlorid (EDC) der bevorzugte carboxylaktivierende Wirkstoff.
In Schritt (e) des Verfahrens wird eine carboxylfreie Verbindung, nämlich ein Amin, mit den in Schritt (d) gebildeten aktivierten Carboxylkomponenten (z. B. o-Aciylisoharnstoff) zur Reaktion gebracht, um carboxylfreie Nebengruppen auf den Kollagenmolekülen anstelle der vorher vorhandenen Carboxylgruppen (COOH-Gruppen) auszubilden. Aufgrund der relativen Instabilität der aktivierten Carboxylkomponente (z. B. o-Acylisoharnstoff), ist es typischerweise wünschenswert, den Schritt (e) (Reaktion mit carboxylfreier Aminverbindung) unmittelbar nach Fertigstellung von Schritt (d) (Bildung der aktivierten Carboxylkomponenten (z. B. o-Acylisoharnstoff)) durchzuführen. Somit können die carboxylaktivierenden Wirkstoffe, die in Schritt (d) verwendet werden, und die carboxylfreie Aminverbindung, die in Schritt (e) verwendet wird, wünschenswerter Weise zu einer einzelnen Lösung kombiniert werden, in der das Kollagengewebe eingetaucht werden kann. Die carboxylfreien Nebengruppen, die sich in Schritt (e) des Verfahrens bilden, haben eine geringere Verkalkungsneigung als die zuvor vorhandenen Carboxylnebengruppen (COOH-Nebengruppen) der Kollagenmoleküle. Amine werden mit aktivierten Carboxylkomponenten (z. B. o-Acylisoharnstoff) zur Reaktion gebracht, um die gewünschten carboxylfreien Nebengruppen auf den Kollagenmolekülen auszubilden. Wird die Aminverbindung für diesen Zweck eingesetzt, verbinden sich die entstandenen carboxylfreien Nebengruppen mit den aktivierten Carboxylkomponenten (z. B. o-Acylisoharnstoff) mittels Amidverkettungen. Es können entweder monofunktionale oder multifunktionale Amine für diesen Zweck verwendet werden. Werden monofunktionale Amine dafür verwendet, wird die einzige funktionale Aminogruppe bei der Bildung der Amidverbindung verwendet, und die dadurch entstandenen carboxylfreien Nebengruppen sind frei von jeglichen verbleibenden Aminfunktionalitäten. Werden hingegen multifunktionale Aminverbindungen dafür verwendet, wird in den meisten Fällen nur eine funktionale Aminogruppe bei der Bildung der Amidverbindung verwendet, und die sich ergebenden carboxylfreien Nebengruppen enthalten dann eine oder mehrere zurückbleibende funktionale Aminogruppen.
In Schritt (e) des Verfahrens wird die Bioprothese wieder in Glutaraldehyd getaucht oder anderweitig damit in Kontakt gebracht. Wenn die carboxylfreien Nebengruppen, die sich auf den Kollagenmolekülen gebildet haben, frei von funktionalen Aminogruppen sind, führt dieses zusätzliche Einwirkenlassen aufgrund des Nichtvorhandenseins funktionaler Aminbindungsstellen, mit denen das Glutaraldehyd reagieren könnte, zu keiner weiteren Vernetzung von Kollagenmolekülen. Wenn jedoch die carboxylfreien Nebengruppen, die sich auf den Kollagenmolekülen gebildet haben, funktionale Aminogruppen enthalten, führt dieses weitere Einwirkenlassen von Glutaraldehyd zur Entstehung zusätzlicher Glutaraldehydvernetzungen zwischen diesen zurückbleibenden freien Aminogruppen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung dient auch dazu, die Carboxylgruppen (COOH-Gruppen) der in der Bioprothese vorkommenden Elastinmoleküle durch dieselben carboxylfreien Nebengruppen zu ersetzen, wie vorstehend hinsichtlich der Kollagenmoleküle beschrieben wurde. Es ist klar, dass, obwohl die Erfindung hierin mit Bezug auf Kollagenmoleküle in kollagenen Bioprothesen beschrieben wird, die meisten davon auch unterschiedliche Elastinmengen enthalten werden, und die chemischen Auswirkungen, die hierin als die Kollagenmoleküle betreffend beschrieben sind, werden aufgrund der Ähnlichkeiten in der chemischen Struktur von Elastin und Kollagen, sich auch auf die Elastinmoleküle auswirken.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorstehend zusammengefassten Erfindung werden dem Fachmann bei der Lektüre der nachstehenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen klar.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Ablaufdiagramm einer ersten bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 ist ein Schema der chemischen Reaktionen, die in der ersten bevorzugten Ausführungsform des im Ablaufdiagramm von Fig. 1 gezeigten Verfahrens der vorliegenden Erfindung ablaufen.
Fig. 3 ist ein Ablaufdiagramm der zweiten bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
Fig. 4 ist ein Schema der chemischen Reaktionen, die in der zweiten bevorzugten Ausführungsform des im Ablaufdiagramm von Fig. 3 gezeigten Verfahrens der vorliegenden Erfindung ablaufen.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die folgende ausführliche Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen sind nur zu Zwecken der Beschreibung und Darstellung bestimmter gegenwärtig bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung wiedergegeben und sollen den Umfang der Erfindung keinesfalls einschränken.
In den beigefügten Fig. 1-4 sind zwei (2) Ausführungsformen der Erfindung gezeigt, die nachstehend ausführlich beschrieben werden. Im Einzelnen betreffen die Fig. 1-2 eine erste bevorzugte Ausführungsform, während die Fig. 3-4 eine zweite bevorzugte Ausführungsform betreffen.

i. Erste bevorzugte Ausführungsform

Mit Bezug auf die Darstellungen der Fig. 1-2, stellt die erste bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Glutaraldehydvernetzung einer kollagenen Bioprothese (Schritte 1 - 2) bereit, gefolgt von einer nachfolgenden Behandlung, um deren Neigung zu späterem Verkalken abzumildern, und um ihre Dauerhaftigkeit zu erhöhen. In dieser ersten Ausführungsform der Erfindung werden die natürlich vorkommenden Carboxylgruppen der Kollagenmoleküle (in den Schritten 4-5 des Verfahrens) durch carboxylfreie amidgebundene Nebengruppen ersetzt, die funktionale Aminogruppen an ihren endständigen Enden aufweisen. Danach führt ein darauffolgendes Einwirkenlassen von Glutaraldehyd (Schritt 6) zur Bildung zusätzlicher Glutaraldehydvernetzungen zwischen den freien Aminfunktionalitäten der carboxylfreien Nebengruppen. Die Bildung solcher zusätzlicher Glutaraldehydvernetzungen führt zu einer Modifikation der physikalischen Eigenschaften der Bioprothese und verbessert tendenziell deren Langzeitdauerhaftigkeit.
Mit Bezug auf das Ablaufdiagramm von Fig. 1 umfasst das Verfahren dieser ersten Ausführungsform die folgenden Schritte:

Schritt I: Gewinnen und Verarbeiten eines Kollagengewebes

Aus einem Säugetier wird ein geeignetes Kollagengewebe gewonnen und wird gemäß einer Standardtechnik zugeschnitten, gereinigt und vorbereitet.

Schritt II: Glutaraldehydfixierung

Im zweiten Schritt dieses Verfahrens wird das zuvor vorbereitete Kollagengewebe in eine 0,1-1,0%-ige Glutaraldehydlösung 30 Min. bis 2 Wochen lang bei 4ºC-25ºC eingetaucht, um eine Glutaraldehydvernetzung zwischen freien Aminogruppen zu bewirken, die sich auf den Kollagenmolekülen des Kollagengewebes befinden.

Schritt III: Spülen

Nachdem das Kollagengewebe aus der Glutaraldehydlösung entnommen wurde, wird es mit einer geeigneten phosphatfreien Spüllösung wie einer 0,9%-igen NaCl-Lösung oder HEPES Puffersalzlösung gespült. Dieses Spülen entfernt Glutaraldehydlösungsrückstände aus dem Kollagengewebe. Es ist wünschenswert, dass die Spüllösung frei von Phosphaten ist, da das Vorhandensein von Phosphatresten auf dem Kollagengewebe die Halbwertzeit verkürzen bzw. die Stabilität der Carbodiimidgruppe(n) beeinträchtigen kann, die im folgenden (nachstehend beschriebenen) Schritt IV zum Einsatz kommen.

Schritt IV: Carboxylaktivierung und Bildung carboxylfreier Nebengruppen mit Aminfunktionalität

In diesem vierten Schritt des Verfahrens wird das zuvor glutaraldehydfixierte Kollagengewebe in eine Lösung aus 1% 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid HCl (EDC) und 1% Ethyldiamin 2 HCl (EDA) mit einem pH von 4, 5 bis 5,0 eingetaucht, um a) die Carboxylgruppen (COOH-Gruppen) der Kollagenmoleküle in aktivierte Carboxylkomponenten (z. B. o-Acylisoharnstoff) umzuwandeln und b), um amidgebundene, carboxylfreie Nebengruppen auf den Kollagenmolekülen auszubilden. Die carboxylfreien Nebengruppen enthalten an ihren endständigen Enden freie funktionale Aminogruppen.

Schritt V: Spülen

Nachdem das Kollagengewebe aus der EDC/EDA-Lösung entnommen wurde, wird es mit einer geeigneten Spüllösung wie einer phosphatgepufferten Salzlösung gespült. Diese Spülung entfernt restliches EDC und EDA aus dem Kollagengewebe.

Schritt VI: Weitere Glutaraldehydbehandlung

Im sechsten Schritt des Verfahrens wird das Kollagengewebe bei Umgebungstemperatur in eine 0,1-1,0%-ige Glutaraldehydlösung getaucht, bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Bioprothese chirurgisch eingepflanzt werden soll oder bis zu nachfolgenden Bearbeitungsschritten (z. B. Zerschneiden und Anbringen auf Stents oder einem anderen Gerüst). Dieses abschließende Eintauchen in Glutaraldehydlösung dient dazu, die Sterilität des Transplantats bis zum Gebrauchszeitpunkt oder weiteren Bearbeitungsschritten aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus führt diese abschließende Glutaraldehydbehandlung zu zusätzlichen Glutaraldehydvernetzungen zwischen den Kollagenmolekülen, wie nachstehend noch umfassender erläutert wird, und wie in Fig. 2 im Einzelnen gezeigt ist.
Fig. 2 zeigt in einer schematischen Darstellung die spezifischen chemischen Reaktionen, die in den Schritten IV und VI der oben zusammengefassten ersten Ausführungsform des Verfahrens ablaufen. Mit Bezug auf Fig. 2 wird klar, dass das in Schritt IV des Verfahrens verwendete Ethylendiamin (EDA) ein geradkettiger aliphatischer Kohlenwasserstoff mit endständigen Amingruppen (NH&sub2;-Gruppen) ist, die an beiden Enden des Moleküls angeordnet sind. Eine dieser endständigen Amingruppen (NH&sub2;-Gruppen) reagiert mit der aktivierten Carboxylkomponente (z. B. o-Acylisoharnstoff), um mit dieser eine Amidverbindung zu bilden, während die andere endständige Amingruppe (NH&sub2;-Gruppe) nicht reagiert und für eine nachfolgende Vernetzung durch Glutaraldehyd zur Verfügung steht.
Wie auch noch in Fig. 2 gezeigt ist, führt das abschließende Einwirkenlassen von Glutaraldehyd auf das Kollagengewebe in Schritt VI des Verfahrens zur Entstehung zusätzlicher Glutaraldehydvernetzungen zwischen den freien endständigen Amingruppen (NH&sub2;-Gruppen), die auf den carboxylfreien Seitengruppen der Kollagenmoleküle verbleiben.
Somit sorgt die in den Fig. 1-2 gezeigte erste bevorzugte Ausführungsform der Erfindung nicht nur für den Austausch der Carboxylnebengruppen (COOH-Nebengruppen) der Kollagenmoleküle durch carboxylfreie Nebengruppen, die eine abgemilderte Verkalkungsneigung aufweisen, sondern sorgt vielmehr auch für die Entstehung zusätzlicher Glutaraldehydvernetzungen, die die Gesamtvernetzungsdichte und Langzeithaltbarkeit der Bioprothese ausmachen.

ii. Zweite Ausführungsform

Eine zweite bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist in den Fig. 3-4 gezeigt.
In dieser zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wird in Schritt IV des Verfahrens ein monofunktionales Amin (Propylamin) verwendet, und kein difunktionales Amin (Ethylendiamin) wie in der zuvor beschriebenen ersten Ausführungsform. Die einzelne Amingruppe (NH&sub2;) auf dem monofunktionalen Propylaminmolekül reagiert mit der aktivierten Carboxylkomponente (z. B. o-Acylisoharnstoff), um mit dieser eine Amidverbindung auszubilden. Somit enthält die sich ergebende carboxylfreie Nebengruppe keine restlichen funktionalen Amingruppen (NH&sub2;- Gruppen). In dieser Hinsicht dient der Austausch der Carboxylgruppen (COOH-Gruppen) der Kollagenmoleküle durch die carboxylfreien Nebengruppen dazu, die Neigung der Bioprothese zu späterer Verkalkung abzumildern, aber das Nichtvorhandensein restlicher funktionaler Amingruppen (NH&sub2;-Gruppen) auf den in Schritt IV des Verfahrens erzeugten carboxylfreien Nebengruppen hindert die Kollagenmoleküle daran, eine weitere Glutaraldehydvernetzung während des abschließenden Einwirkenlassens von Glutaraldehyd zu durchlaufen.
Mit Bezug auf das Ablaufdiagramm von Fig. 3 ist diese zweite bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein Bioprothesenherstellungsverfahren, das die folgenden Schritte umfasst:

Schritt I: Gewinnen und Verarbeiten eines Kollagengewebes

Schritt II: Glutaraldehydfixierung

Schritt III: Spülen

In diesem vierten Schritt des Verfahrens wird das Kollagengewebe in eine Lösung aus 1% 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid HCl (EDC) und 1% Propylamin HCl (PA) 1 bis 10 Stunden lang bei 4º bis 25ºC mit einem pH von 4,5 bis 5,0 eingetaucht. Dies führt a) zu einer Umwandlung der auf den Kollagenmolekülen vorhandenen Carboxylgruppen (COOH) zu aktivierten Carboxylkomponenten (z. B. o-Acylisoharnstoff); und b) zu einer Amidbindung der Propylaminmoleküle (PA- Moleküle) mit den aktivierten Carboxylkomponenten (z. B. o-Acylisoharnstoff). Somit werden die Carboxylgruppen (COOH) durch carboxylfreie Nebengruppen ersetzt. Diese carboxylfreien Nebengruppen sind bar jeglicher restlicher funktionaler Amingruppen (NH&sub2;-Gruppen)..

Schritt V: Spülen

Nachdem das Kollagengewebe aus der EDC/PA-Lösung entnommen wurde, wird es mit einer geeigneten Spüllösung wie einer phosphatgepufferten Salzlösung gespült. Diese Spülung entfernt restliches EDC und PA aus dem Kollagengewebe.

Schritt VI: Abschließende Glutaraldehydbehandlung/Sterilisierung

In diesem sechsten Schritt des Verfahrens wird das Kollagengewebe bei Umgebungstemperatur in eine 0,1-1,0%-ige Glutaraldehydlösung getaucht, bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Bioprothese chirurgisch eingepflanzt werden soll oder bis zu nachfolgenden Bearbeitungsschritten (z. B. Zerschneiden und Anbringen auf Stents oder einem anderen Gerüst). Die führt zu einer beibehaltenen Sterilisierung des Kollagengewebes bis zum Verwendungszeitpunkt oder bis zu weiteren Verarbeitungsschritten. Wie jedoch weiter unten noch umfassender erläutert wird, führt dieses zusätzliche Einwirkenlassen von Glutaraldehyd nicht zur Entstehung zusätzlicher Glutaraldehydvernetzungen, da die carboxylfreien Nebengruppen, die sich in Schritt IV des Verfahrens auf den Kollagenmolekülen gebildet haben, bar funktionaler Aminogruppen sind, die als Bindungsstätten für das Glutaraldehyd wirken könnten.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung des chemischen Ablaufs der Schritte 4 und 6 der zweiten Ausführungsform des im Ablaufdiagramm von Fig. 3 gezeigten Verfahrens.
Mit Bezug auf Fig. 4 wandelt das 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDC) die Carboxylgruppen (COOH-Gruppen) der Kollagenkette in aktivierte Carboxylkomponenten (z. B. o-Acylisoharnstoff) um. Die einzelnen Amingruppen (NH&sub2;-Gruppen) der Propylaminmoleküle (PA-Moleküle) reagieren dann mit den aktivierten Carboxylkomponenten (z. B. o-Acylisoharnstoff), um mit diesen Amidbindungen auszubilden. Dies führt zur Entstehung carboxylfreier Nebengruppen, die bar jeglicher funktionaler Amingruppen (NH&sub2;-Gruppen) sind.
Wie darüber hinaus noch in Fig. 4 gezeigt ist, dient das abschließende Einwirkenlassen von Glutaraldehyd auf das Kollagengewebe zur Aufrechterhaltung der Sterilität des Kollagengewebes, ruft aber aufgrund des Nichtvorhandenseins funktionaler Aminstätten (NH&sub2;- Gruppen) auf den carboxylfreien Nebengruppen, die durch das Propylamin (PA) gebildet wurden, keine weitere Vernetzung der Kollagenmoleküle hervor. Somit unterscheidet sich diese zweite Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung von der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform insofern, als keine weitere Glutaraldehydvernetzung während des Einwirkenlassens von Glutaraldehyd in Schritt VI stattfindet. In dieser Hinsicht bleibt die Vernetzungsdichte des Kollagengewebes unbetroffen vom Behandlungsverfahren der zweiten Ausführungsform, obwohl die Verkalkungsneigung des Kollagengewebes aufgrund des Austauschs der endogenen Carboxylgruppen (COOH- Gruppen) durch carboxylfreie amidgebundene Gruppen wie gezeigt signifikant herabgesetzt ist.

Claims

1. Verfahren zu Herstellung einer glutaraldehydfixierten kollagenen Bioprothese mit abgemilderter Neigung zur Kalkablagerung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) ein kollagenhaltiges Gewebe bereitzustellen;

b) das Gewebe mit Glutaraldehyd in Kontakt zu bringen, um ein glutaraldehydvernetztes Gewebe auszubilden;

c) das Gewebe zu waschen, um Restglutaraldehyd zu entfernen;

d) das glutaraldehydvernetzte Gewebe mit einer Carboxylaktivatorverbindung in Verbindung zu bringen, die in der Lage ist, mindestens einige der an den Kollagenmolekülen des Gewebes vorhandenen Carboxylgruppen in aktivierte Carboxylkomponenten umzuwandeln, die in der Lage sind, mit Aminogruppen zu reagieren;

e) das Gewebe von Schritt (d) mit einer Verbindung in Kontakt zu bringen, die aus monofunktionalen und multifunktionalen Aminen ausgewählt ist, die mit den aktivierten Carboxylkomponenten reagiert, um carboxylfreie Nebengruppen an den Kollagenmolekülen auszubilden; und danach

f) das Gewebe wieder mit Glutaraldehyd in Kontakt zu bringen, wodurch sich, wenn in Schritt (e) ein multifunktionales Amin verwendet wurde, zusätzliche Glutaraldehydvernetzungen bilden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das in Schritt (a) bereitgestellte kollagenhaltige Gewebe aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

a) Herzklappen;

b) Blutgefäßsegmenten;

c) Aortenwurzelsegmenten mit einer darin angeordneten Aortenklappe;

d) Perikard;

e) Bänder;

f) Sehnen; und

g) Haut.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die in Schritt (e) mit dem Gewebe in Kontakt gebrachte Verbindung ein carboxylfreies Diamin ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die in Schritt (e) mit dem Gewebe in Kontakt gebrachte Verbindung ein carboxylfreies Monoamin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das carboxylfreie Monoamin Propylamin ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, bei dem das carboxylfreie Amin aliphatisch ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die in Schritt (d) verwendete Carboxylaktivatorverbindung ein Carbodiimid ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Carbodiimid aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

a) 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimidhydrochlorid (EDC);

b) Dihexylcarbodiimid (DCC); und

c) 1-Ethyl-3-(4-Azonia-4,4-Dimethylpentyl)carbodiimidiodid (EAC).

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Schritt des Waschens Waschen mit einer phosphatfreien Lösung beinhaltet.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die in Schritt (e) verwendete Verbindung mindestens zwei funktionale Aminogruppen enthält, so dass mindestens eine funktionale Aminogruppe an den amidgebundenen Gruppen verbleibt, die sich in Schritt (e) auf den Kollagenmolekülen gebildet haben, und bei dem das nachfolgende Inverbindungbringen des Gewebes mit Glutaraldehyd nach Schritt (e) in der Bildung von zusätzlichen Glutaraldehydvernetzungen zwischen den freien Aminogruppen resultiert, die an den amidgebundenen Gruppen der Kollagenmoleküle innerhalb des Gewebes verbleiben.

11. Bioprothese, umfassend Säugetiergewebe, das gemäß des Verfahrens der vorhergehenden Ansprüche behandelt wurde.

12. Bioprothese nach Anspruch 11, bei der das Säugetiergewebe vom Schwein stammt.

13. Bioprothese nach Anspruch 11, bei der das Säugetiergewebe vom Rind stammt.