DE10258121B3 - Verfahren zur Herstellung von Bioprothesen - Google Patents

Abstract

Ein Verfahren zur Herstellung von Bioprothesen aus allogenem oder xenogenem Material, insbesondere Herzklappen, umfasst eine Detergenzbehandlung zum Lysieren und Herauslösen der Fremdzellen, eine Konditionierungsbehandlung mit einem zyklischen Lipopeptid, insbesondere Surfactin, und eine Besiedlungsphase der so präparierten Gewebematrix mit körpereigenen Zellen des Transplantatempfängers. Die zwischengeschaltete Behandlung mit einem Lipopeptid schafft auf der Oberfläche der Gewebematrix eine integrale, biokompatible, von Krankheitserregern freie Unterlage für eine gleichmäßige Zellbesiedlung und ein oberflächenglattes, elastisches Transplantat mit langer Lebensdauer.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bioprothesen aus allogenem oder xenogenem Material, insbesondere Herzklappen, bei dem die im Ergebnis einer Detergenzbehandlung zur Lysierung und Abtötung der Zellen verbleibende Kollagenmatrix des Transplantats mit körpereigenen Zellen des Transplantatempfängers besiedelt wird. Die Erfindung ist gleichermaßen für anderes Material, wie zum Beispiel Blutgefäße, Knochenknorpel, Bänder und dgl., anwendbar.
• Bei der Transplantation von Organen, Gefäßen und Haut bereitet die Herstellung geeigneter Transplantate, die gut einwachsen und möglichst im Körper noch mitwachsen sowie lange haltbar sind, Probleme.
• Es wurden bereits Verfahren zur Herstellung von biologischen Prothesen vorgeschlagen. So beschreibt die WO 84/04880 A1 ein Verfahren zur Herstellung von sterilen Implantaten aus extrazellularen Kollagen-Matrices durch Dezellularisierung von entsprechenden Geweben.
• WO 02/24244 A2 beschreibt ein Verfahren, bei dem durch Dezellularisierung von kollagenhaltigem Gewebe lagerfähige Kollagengerüste erhalten werden, die vor der Implantation mit gering immunogen aktiven Zellen, z.B. Stammzellen oder embryonale Stammzellen, besiedelt werden.
• DE 100 64 948 C1 schlägt ein Verfahren insbesondere für die Herz- und Gefäßchirurgie vor, bei dem ein als Bioprothese geeignetes Fremdmaterial, zum Beispiel eine Aortenklappe vom Schwein, zur Dezellularisierung, zunächst mit Desoxycholsäure behandelt wird, die anschließend mit physiologischer Kochsalzlösung wieder ausgewaschen wird.
• Die so gewonnene Kollagenmatrix wird mit einem natürlichen Klebstoff beschichtet und anschließend mit körpereigenen Zellen besiedelt. Sowohl die Dezellularisierung als auch die anschließende Beschichtung mit körpereigenen Zellen erfolgt unter dynamischen Bedingungen, insbesondere in einem an die natürlichen Strömungsbedingungen in dem betreffenden Organ oder Gefäß angepassten Flüssigkeitsstrom, um so das dezellularisierte Fremdmaterial zu konditionieren, das heißt, die Voraussetzungen für ein in allen Flächenbereichen des Fremdmaterials gleichmäßiges Zellwachstum zu schaffen und eine lange Haltbarkeit der Bioprothese im Körper zu gewährleisten.
• Eine wichtige Forderung an die Transplantate besteht darin, dass diese keine vermehrungsfähigen Krankheitserreger enthalten. In einer Vielzahl von Untersuchungen wurde festgestellt, dass Erreger, die im natürlichen Wirt nicht oder wenig pathogen sind, beim Spezieswechsel schwerwiegende Erkrankungen hervorrufen können. Beispielsweise sind beim Schwein, dessen Aortenklappe sich zur Verwendung für Bioprothesen als gut geeignet erwiesen hat, endogene replikationsfähige Retroviren in das Erbgut integriert, die sich in menschlichen Zellen vermehren können. Tatsächlich gelingt es mit dem oben beschriebenen Verfahren mit hoher Effizienz, die im Transplantat enthaltenen Zellen zu lysieren und Zellbestandteile zu entfernen, jedoch wird die anschließende dynamische Konditionierung nicht allen Anforderungen an ein schnelles und sicheres Anwachsen und eine gleichmäßige Besiedlung des Transplantats mit körpereigenen Zellen des Empfängers der Bioprothese gerecht, da die Oberfläche des Transplantats nach der Detergenzbehandlung in einer Weise verändert sein kann, die das gleichmäßige und reproduzierbare Anwachsen und Weiterwachsen von Zellen auf dem Transplantat behindern kann.
• Aus WO 03/01181 A2 ist bekannt, dass auf mit cyclischen Heptapeptiden wie Surfactin beschichteten medizinischen Kathetern die Bildung des sogenannten Biofilms verhindert wird. Aufgrund ihrer Oberflächeneigenschaften wirken diese Beschichtungen antiviral und antimikrobiell.
• Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Bioprothesen aus allogenem oder xenogenem Material anzugeben, das eine reproduzierbare gleichmäßige Besiedlung mit körpereigenen Zellen gewährleistet und ein von Krankheitserregern freies Transplantat mit langer Lebensdauer zur Verfügung stellt.
• Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit einem Verfahren gemäß den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst. Aus den Unter ansprüchen ergeben sich weitere Merkmale und vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung.
• Der Grundgedanke der Erfindung besteht in einer Konditionierung der nach der Abtötung und Entfernung der Fremdzellen mit einem Detergenzmedium zurückbleibenden Kollagen-Matrix in einer Lösung von zyklischen β-Hydroxy-Fettsäure- und β-Amino-Fettsäure-haltigen Peptiden (Lipopeptiden), insbesondere in einer Lösung von Surfactin als zyklischem Heptapeptid, bei dem in das Ringsystem eine β-Hydroxy-Fettsäure integriert ist und der Ringschluß durch Lactonbindung der β-Hydroxylgruppe mit der Carboxylgruppe des endständigen Leucinbausteins erfolgt. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass insbesondere Surfactin, das die nachfolgend wiedergegebene Struktur

  

  mit sowohl hydrophoben als auch hydrophilen Strukturelementen aufweist, sich in charakteristischer Weise an der Oberfläche der Kollagen-Matrix orientiert und sich hervorragend zur Konditionierung der nach der Behandlung mit Desoxycholsäure von Fremdzellen befreiten Gewebematrix des Transplantats eignet, indem die durch die Detergenzbehandlung beeinträchtigte Oberfläche des Transplantats durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften (d.h. Oberflächen-, grenzflächen- und membran-aktiven Eigenschaften) des zyklischen Lipopeptids in einer Weise beeinflusst wird, die eine gleichmäßige Besiedlung aller Oberflächenbereiche der Matrix mit den körpereigenen Zellen des Transplantatempfängers gewährleisten.
• Ein wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Anwendung der thermisch stabilen und damit thermisch sterilisiert einsetzbaren zyklischen Lipopeptide, insbesondere des Surfactins, liegt darüber hinaus in deren antiviralen und antimikrobiellen Aktivitäten, so dass die bereits durch eine Detergenzbehandlung bewirkte Beseitigung jeglicher Krankheitserreger zusätzlich abgesichert ist. Schließlich ist durch die Lipopeptidbehandlung gewährleistet, dass selbst geringste Reste auf der Oberfläche gegebenenfalls verbliebener Detergenzien entfernt werden. Aufgrund aller vorteilhaften Wirkungen der Konditionierung mit einem zyklischen Lipopeptid ist schließlich eine schnelle und gleichmäßige Besiedlung der Gewebematrix sichergestellt, die mithin eine glatte Oberfläche aufweist und somit nicht zum Verkalken neigt und zudem eine höhere Elastizität als die bekannten Transplantate aufweist. Im Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens und seiner Wirkungen können Transplantate mit einer langen Lebensdauer zur Verfügung gestellt werden.
• Nachfolgend wird die Erfindung in einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.
• Eine von Fett befreite und zugeschnittene porcine Aortenklappe wird in einer 1–2%igen Desoxycholsäure (oder Detergenz mit ähnlicher Wirkung) bis zu 24 h bei 37°C gelagert. Die Desoxycholsäure löst die mit der Gewebematrix bestehende Haftverbindung der Zellen und hat gleichzeitig eine die Zellen abtötende Wirkung. In mehreren Spülvorgängen mit Phosphatpufferlösung und gegebenenfalls einer zwischengeschalteten Behandlung mit Alkohol, werden die Zellen bzw. Zellreste abgespült, gegebenenfalls noch weitere Zellen gelöst und abgespült und insbesondere auch die Desoxycholsäure von der Gewebematrix entfernt. Um eine möglichst intensive, aber dennoch schonende Spülwirkung zu erzielen, befindet sich die Aortenklappe während des Spülvorganges in einem pulsierenden Medienstrom.
• Die so behandelte porcine Aortenklappe wird anschließend drei Stunden bei 37°C in eine gepufferte Surfactinlösung gelegt und danach 5 mal 10 Minuten lang mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Das Surfactin, das eine sehr geringe Toxizität (200 mg/kg) aufweist und unter geeigneten Bedingungen ohne Wirkung auf menschliche oder tierische Zellen in der Lage ist, Mikroorganismen, wie zum Beispiel Mykoplasmen und umhüllte Viren, zu lysieren, stellt nach der Detergenzbehandlung ein hervorragendes Konditionierungsmittel für die dezellularisierte porcine Aortenklappe dar. Das Surfactin wirkt nicht nur antiviral und antibakteriell, sondern. verdrängt auch noch Reste der gegebenenfalls auf der Kollagenmatrix der Aortenklappe verbliebenen Desoxycholsäure und modifiziert im Ergebnis einer Wechselwirkung mit dem Kollagen aufgrund seiner membranaktiven, oberflächenaktiven Eigenschaften die Oberfläche der Gewebematrix in einer Weise, dass in allen Oberflächenteilen der dezellularisierten Aortenklappe eine gleichmäßige Besiedlung mit Zellen und ein schnelles und gleichmäßiges Zellwachstum gewährleistet ist.
• Eine zusätzliche Konditionierung der Gewebematrix nach der Behandlung in Surfactin kann zusätzlich derart vorgenommen werden, dass die Zellbesiedlung und das Zellwachstum in einem pulsierenden Medienstrom erfolgt.
• Im Ergebnis der Behandlung mit Surfactin konnte nachgewiesen werden, dass die mit körpereigenen Zellen des Empfängers besiedelten Zellen gegenüber den bekannten Transplantaten dieser Art eine hohe Elastizität und sehr glatte Oberflächen aufweisen. Auch nach einer Einsatzzeit von sechs Monaten konnten im Tierversuch keinerlei Anzeichen für eine Verkalkung festgestellt werden. Damit ist von einer ungestörten Funktion und einer langen Lebensdauer des Transplantats auszugehen.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von Bioprothesen aus allogenem oder xenogenem Material, insbesondere Herzklappen, bei dem die im Ergebnis einer Detergenzbehandlung zur Lysierung und Abtötung der Zellen verbleibende Kollagenmatrix des Transplantats mit körpereigenen Zellen des Transplantatempfängers besiedelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Detergenzbehandlung und der Zellbesiedlung eine Konditionierung des Transplantats in einer Lösung von zyklischen Lipopeptiden oder einem Gemisch von diesen oder dern Salzen durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Konditionierungsmittel das zyklische Lipo-Heptapeptid Surfactin verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionierungsbehandlung in einer 40 μmolaren Surfactinlösung bei 37°C durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, das sich an die Konditionierung in der Lipopeptid-Lösung ein Waschschritt anschließt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Waschvorgang in mehreren Schritten jeweils in physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Konditionierung verwendeten zyklischen Lipopeptide thermisch sterilisiert sind.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Detergenzbehandlung zum Abtöten und Herauslösen der Fremdzellen aus dem allogenen oder xenogenem Fremdmaterial in Desoxycholsäure mit daran anschließenden Waschschritten durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Transplantatmaterial während der Detergenzbehandlung und/oder Konditionierung und/oder der Zellbesiedlung in der betreffenden Lösung bewegt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Transplantatmaterial in einem oder mehreren der Behandlungs- und Besiedlungsschritte in einem pulsierenden Medienstrom befindet.