JP2005521437A - バイオプロテーゼの石灰化対策 - Google Patents

Abstract

特定の種類の抗石灰化剤の使用を取り込むためにトリグリシジルアミン（ＴＧＡ）を用いた架橋を適合させることにより、生体内でバイオプロテーゼが石灰化するという問題に対して広範におよぶ解決策が提供される。問題の抗石灰化剤は、ポリホスホン酸とポリエポキシドとの間の反応部位として作用する官能基を含むポリホスホン酸化合物を含有する。該官能基は十分反応性が高くポリホスホン酸とポリエポキシドとの間の反応において優位であり、したがって反応からポリホスホン酸のキレート化酸素原子を排除し、その抗石灰化能を保護する。さらに、該官能基の反応性が高いのでポリホスホン酸がポリエポキシドにより完全に結合することができ、ポリエポキシドが架橋されたバイオプロテーゼ材料の石灰化耐性が向上する。

Description

本発明は、バイオプロテーゼ材料（ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ）が生体内で石灰化する傾向に対抗する戦略に関する。

病的な石灰化が原因で、組織の構成要素を取り込む人工装具（プロテーゼ）の用途は限定されてきた。そのような「バイオプロテーゼ」に関連して、レビィ（Ｌｅｖｙ）らの特許（特許文献１）では、問題点およびその解決への一方策が議論されているが、その方策はバイオプロテーゼ組織をポリホスホン酸：ポリエポキシド一付加物で前処理することを伴う。ポリエポキシドは、バイオプロテーゼ組織のコラーゲン鎖と架橋することにより、その後生じる生体内における酵素分解に対し該組織を安定化させる。安定化に有効である一方、ポリエポキシドは石灰化を促進するが、ポリホスホン酸は石灰化に対抗しうるキレート化酸素原子（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｏｘｙｇｅｎ ａｔｏｍ）を提供する。

しかしながら、レビィ（Ｌｅｖｙ）の特許において提供された解決策には欠点がある。前処理の後、バイオプロテーゼ材料に対する抗石灰化効果は次第に減少するが、その理由はおそらく作用剤であるポリホスホン酸が時間とともに洗い流されてしまうからである。レビィ（Ｌｅｖｙ）らが可能性として挙げた、ポリホスホン酸が組織に共有結合する状態に結合させると、ポリホスホン酸の抗石灰化効果が弱まる可能性がある。というのも、共有結合はポリホスホン酸のキレート化酸素原子を一部アルキル化することによりなされるが、これはカルシウム結晶の成長を阻害するキレート化酸素原子の機能を無効にすると思われる。補うべくより多くのポリホスホン酸を適用すると、ポリエポキシドとプロテーゼ組織との間の架橋に悪影響を与える可能性がある。

特許文献２には、バイオプロテーゼ材料に石灰化抵抗性の向上をもたらすために架橋性トリグリシジルアミン（ＴＧＡ）を使用することを伴う別の方策が開示されている。例えば、ＴＧＡ処理はブタ大動脈弁バイオプロテーゼにおいて、弁尖部分が生体内で石灰化するのを抑制するために使用されてきた。

しかしながら、ＴＧＡ架橋の方法論は、バイオプロテーゼ心臓弁のある部分の石灰化を抑制するには不十分である。具体的には、同方法論はバイオプロテーゼ移植片の大動脈壁部分の石灰化に対しては比較的効果が弱い。同様に、ウシ心膜の石灰化の抑制についても効果が弱い。
米国特許第５，６７４，２９８号 国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／５８５０３号明細書

レビィ（Ｌｅｖｙ）の特許において提供された解決策には欠点がある。前処理の後、バイオプロテーゼ材料に対する抗石灰化効果は次第に減少するが、その理由はおそらく作用剤であるポリホスホン酸が時間とともに洗い流されてしまうからである。レビィ（Ｌｅｖｙ）らが可能性として挙げた、ポリホスホン酸が組織に共有結合するような程度では、ポリホスホン酸の抗石灰化効果が弱まる可能性がある。というのも、共有結合はポリホスホン酸のキレート化酸素原子を一部アルキル化することによりなされるが、これはカルシウム結晶の成長を阻害するキレート化酸素原子の機能を無効にすると思われる。補うためにより多くのポリホスホン酸を適用すると、ポリエポキシドとプロテーゼ組織との間の架橋に悪影響を与える可能性がある。

ＴＧＡ架橋の方法論は、バイオプロテーゼ心臓弁のある部分の石灰化を抑制するには不十分である。具体的には、同方法論はバイオプロテーゼ移植片の大動脈壁部分の石灰化に対しては比較的効果が弱い。同様に、ウシ心膜の石灰化の抑制についても効果が弱い。

抗石灰化戦略の改善の必要性に応え、本発明は、生体内における病的な石灰化に対する耐性が強化され、持続性であることを特徴とするバイオプロテーゼ材料をもたらす。
本発明は、抗石灰化の機能全般を失うことなくＴＧＡ架橋剤に結合可能な抗石灰化剤も提供する。

さらに本発明は、バイオプロテーゼ材料の製造または処理という面において、抗石灰化活性を実質的に弱めることなくＴＧＡ架橋を伴って抗石灰化剤を使用することを意図している。

これらの目的に向けて、本発明は、バイオプロテーゼ組織をアミノ‐チオール含有ポリホスホン酸の存在下でポリエポキシドと接触させることからなるバイオプロテーゼ材料の処理方法であって、前記組織が前記ポリエポキシドと架橋し、かつ前記ポリホスホン酸がそのチオール基を介してポリエポキシドに共有結合するような温度および時間接触させることを特徴とし、これにより該バイオプロテーゼ組織が生体内で抗石灰化作用を示すことを特徴とする方法を提供する。

上記およびその他の目的にさらに関連して、本方法により、ポリエポキシ架橋と、チオール基を介して共有結合したチオール含有ポリホスホン酸の抗石灰化剤とを有するバイオプロテーゼ物が提供される。

本発明の別の態様では、上記およびその他の目的は、（i ）アミノ含有ジスルフィドをポリホスホン酸ビニルと反応させてアミノ‐ジスルフィド含有ポリホスホン酸を形成する工程と、（ii）該ジスルフィド結合を切断してアミノ‐チオール含有ポリホスホン酸を形成する工程とからなる、アミノ‐チオール含有ポリホスホン酸の調製法を提供することにより達成される。

発明者らは、ある特定の種類の抗石灰化剤を上述のＴＧＡ架橋法に取り入れることにより、生体内におけるバイオプロテーゼの石灰化という問題により普遍的な解決がもたらされることを発見している。本発明の抗石灰化剤は、ポリホスホン酸とポリエポキシドの間の反応部位となる官能基を含んだ、ポリホスホン酸化合物を含む。本発明によれば、該官能基はポリホスホン酸とポリエポキシドの間の反応において優位となるのに十分な反応性を有するので、ポリホスホン酸のキレート化酸素原子は反応から排除され、これによりポリホスホン酸の抗石灰化能が保護される。さらに、該官能基の高い反応性によりポリホスホン酸がポリエポキシドにさらに十分に結合可能となるので、ポリエポキシドが架橋したバイオプロテーゼ材料の石灰化への耐性が向上する。

この相互結合反応と架橋反応とが一緒に起きることが好ましい。したがって、反応する官能基の反応性を、架橋反応のｐＨ条件および温度条件に近い条件下で調べることが好ましい。

本発明に従って、エポキシ環の開裂に必要な官能基、および求核基がこの点で説明に役立つ。発明者らは種々の求核試薬を調査したが、その結果（以下の表１にまとめた）から、上記目的に有効な求核試薬の種類が示される。

第１に、一般的なエポキシ架橋反応（すなわち２０℃、ｐＨ約７）の条件にほぼ同等の条件では、反応性を示す全ての求核試薬が硫黄原子を含むことが明らかである。このように、チオ硫酸塩、システイン、Ｎ‐アセチル‐ＤＬ‐メチオニンなどの硫黄原子を含む求核試薬は、硫黄原子を含まない求核試薬よりも少なくとも２０倍反応性が高い。

第２に、表Ｉにおいて２番目および３番目に反応性の高い求核試薬であるシステインおよびＮ‐アセチル‐ＤＬ‐メチオニンのいずれも、チオール基がエポキシ環を開裂するのに好適な条件をつくると思われるカルボキシル基およびアミノ基のうち少なくともいずれかをも含んでいる。いかなる機構にも縛られることは望まないが、カルボキシル基がエポキシドに陽子を与え、遷移状態の開環構造を安定化しつつ酸に触媒される開裂反応を増強するのかもしれない。カルボン酸基またはアミノ基が、チオール基のプロトンと水素結合を形成することにより硫黄原子上に部分的な負の電荷を発生させ、これにより塩基に触媒される開裂反応の達成において該チオール基の求核攻撃を促進するという可能性もある。

本発明者らは、システインの反応性が高いのはチオール基に対してβ位にアミノ基が存在することにより説明できるかもしれないと洞察した。システインが両性イオンの形態である場合、カルボン酸もチオール基に対してβ位になるであろう。この場合もいかなる機構にも縛られることは望まないが、本発明者らは、アミノ基またはカルボン酸基がチオール基に対して近接することによりエポキシドの開環におけるその反応性が高まると考えている。

従って、本発明は（i ）チオール基の反応性を高める、または（ii）チオール基がエポキシドを攻撃するのに好適な環境をつくりだす付加的部分を備えたチオール含有ポリリン酸の使用を意図するものである。そのような付加的部分の例は、近接したアミノ基および
カルボキシル基、またはチオール基を有する芳香族基および複素環基の少なくともいずれかである。

従って、本発明の抗石灰化剤は、アミノもしくはカルボキシ‐チオールを含有するポリホスホン酸であって、アミノもしくはカルボキシル基のうち少なくともいずれかがシステインに関して想定された方式でエポキシド基に対する求核攻撃を促進することを特徴とするポリホスホン酸であることが好ましい。そのようなポリホスホン酸のチオール基はポリホスホン酸とポリエポキシドとの間の相互結合反応よりも優位であり、かつこれら２つの反応物をより完全に反応させる効果があるので、これによりホスホン酸部分の抗石灰化機能は組織に結合した後では最大となると予想される。

本発明の一実施形態に関連して、そのようなアミノもしくはカルボキシ‐チオール含有ポリホスホン酸は、スキーム１により例示したような非エステル化ビニリデン‐ポリホスホン酸の化学反応により得られる。このように、非対称なアミノカルボキシ含有アルキルジスルフィドをポリホスホン酸ビニルと反応させてアミノカルボキシ‐アルキルジスルフィド含有ポリホスホン酸を生じた後、ジスルフィド結合の切断によりアミノカルボキシ‐チオール含有ポリホスホン酸を生産する。

本発明の好ましい抗石灰化剤は、アミノ基により、システインに関して想定された方式でエポキシド基に対する求核攻撃を促進する、アミノ‐チオール含有ポリホスホン酸である。そのようなポリホスホン酸のチオール基はポリホスホン酸とポリエポキシドとの間の相互結合反応よりも優位であり、かつこれら２つの反応物をより完全に反応させるので、これによりホスホン酸部分の抗石灰化機能は組織に結合した後では最大となる。

本発明の別の実施形態に関連して、そのようなアミノ‐チオール含有ポリホスホン酸は、非エステル化ビニリデン‐ポリホスホン酸の化学反応により得られる。このように、アミノ含有ジスルフィドをポリホスホン酸ビニルと反応させてアミノ‐ジスルフィド含有ポリホスホン酸を生じた後、ジスルフィド結合の切断によりアミノ‐チオール含有ポリホスホン酸を生産する。

この種のポリホスホン酸の別例は、本発明によれば、２‐（２‐メルカプトエチルアミノ）‐エチリデン‐１，１‐ビスホスホン酸（ＭＡＢＰ）という化合物である。ＭＡＢＰの合成については以下のスキーム２に示すが、非エステル化ビニリデン‐ビスホスホン酸（ＶＢＰ）の化学反応に基づいている。濃い水溶液の状態では、シスタミンのＶＢＰへのマイケル付加反応が円滑に進行し、ＭＡＢＰの前駆物質が形成される。同物質を穏やかな条件下でトリメチルホスフィンで還元し、ジスルフィド結合を切断し、誘導される最終産物を高率で形成させる。

ＴＧＡ架橋反応の反応条件に近い条件（ｐＨ７．４；２０℃）で、かつ該架橋反応を妨害しないことが明らかな濃度（２０ｍＭのＭＡＢＰ）では、ＭＡＢＰは、表ＩＩに示すように、周知のチオール含有ポリホスホン酸である２‐メルカプトエチリデン‐１，１‐ビスホスホン酸（ＭＥＢＰ）の反応速度（ｋ＝０．０３５ ｌ／モル・時）よりも著しく高い速度（ｋ＝１．２ ｌ／モル・時）でＴＧＡ‐エポキシと反応する。ＭＡＢＰとＴＧＡの両方で処理されたバイオプロテーゼ材料は抗石灰化能の著しい改善を示す。したがって、ＭＡＢＰは上述の基準によく適合していると考えられる。すなわち反応性官能基の反応性が十分に高くＭＡＢＰとＴＧＡとの間の相互結合反応よりも優位であり、ＭＡＢＰをＴＧＡエポキシドにより完全に結合させる。

本発明の別の実施形態に従って、生体内での石灰化に対して長期の耐性を示すバイオプロテーゼ材料が提供される。そのような材料は、上記に説明したように、バイオプロテーゼ組織をこの所望のアミノ‐チオール含有ポリホスホン酸の存在下でポリエポキシド処理に供することにより得られる。プロテーゼ構成要素として従来より使用されている組織の範囲が本発明によるこの処理に適している。これらの組織の例には、石化を制御することが望ましい整形外科用移植片、結合して石化してしまうと不都合な軟部組織移植片、ミネラルの蓄積を制限すべきコンタクトレンズ材料、ならびに石化を抑制すべき子宮内避妊具などがある。

（ＭＡＢＰの合成）
シスタミン塩酸塩（３．５４ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）を水（１６０ｍｌ）に溶解し、強塩基性の陰イオン交換樹脂（ａｎｉｏｎｉｔｅ）Ｄｏｗｅｘ（登録商標）Ｇ‐５５（約７０ｍｌのＯＨ型の透湿性樹脂）を充填したカラムに通し、同カラムを中性になるまで水で溶出させた。得られたシスタミン遊離塩基溶液（約６００ｍｌ）を減圧下で濃縮して容量を小さくし、ＶＢＰ一水和物（３．００ｇ、約１５ｍｍｏｌ）を用いて酸性化してｐＨ４とし、さらに減圧下で濃縮して高粘度のシロップ状（６．１４ｇ）とした。一水和物としてのＶＢＰはアルフェリーブ（Ａｌｆｅｒｉｅｖ）ら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、パートＡ（ポリマー化学）第３９巻、１０５ページ（２００１年）に以前に記載されている。このシロップを１００〜１１０℃で７時間加熱し、冷却してから水（２０ｍｌ）に溶解した。この溶液を酢酸（１．４ｍｌ、２４ｍｍｏｌ）で酸性化し、アルゴン流で保護し、この攪拌混合物にトリメチルホスフィン（４．５ｍｌ、４２ｍｍｏｌ）を一度に添加し
た。反応の最初の１０分間は温度が３０℃を越えないようにした（冷水で外部から冷却）。次いで自己発熱が終了し、混合物を２０〜２５℃で３時間攪拌した。

反応溶液を濾過し、水で希釈して２００ｍｌとし、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０（約８０ｍｌのＨ型の透湿性樹脂）を充填したカラムに供して、副生成物として形成されたシスタミンを除去した。同カラムを中性になるまで水で溶出させ、溶出物（１１００ｍｌ）を濃縮して小容量（２６ｍｌ）とした。メタノール（２４ｍｌ）を残渣に徐々に添加し、ラビング（ｒｕｂｂｉｎｇ）およびシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）のうち少なくともいずれかにより結晶化を開始させた。結晶化終了後、さらにメタノール（１７ｍｌ）を添加し、懸濁物を４℃に一晩放置した。

得られたＭＡＢＰ結晶を濾過し、水を含むメタノール（３容量のメタノールと１容量の水、２０ｍｌ）およびメタノール（約７０ｍｌ）で少しずつ洗浄し、次いで減圧下で乾燥させた。収量：３．５９ｇ（９０％、開始時のＶＢＰについて計算）。この化合物を、水（２０ｍｌ）に溶解してメタノール（４５ｍｌ）で沈殿させてから減圧乾燥することによりさらに精製した。

ＮＭＲによる構造確認：ＭＡＢＰ（Ｄ_２０）の^１Ｈ ＮＭＲ，δ，ｐｐｍ：２．５７（ｔｔ、２１Ｈｚ，７Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、２．８９（ｔ，６Ｈｚ，２Ｈ，Ｓ‐ＣＨ_２），３．３３（ｔ，６Ｈｚ，２Ｈ，アミノエチル基のＮ‐ＣＨ_２）、３．５０（ｔｄ，ｔ：１４Ｈｚ，ｄ：７Ｈｚ，２Ｈ，ジホスホノエチル基のＮ‐ＣＨ_２）。ＭＡＢＰ（Ｄ_２０‐水，^１Ｈ分断）の^３１Ｐ ＮＭＲ：１６．０ｐｐｍに１ピーク。

（バイオプロテーゼ心臓弁組織の、ＭＡＢＰ存在下におけるＴＧＡとの架橋）
屠殺場で新鮮なウシの心膜を入手し、氷中で実験室へ運搬した。通常の生理食塩水で何度もすすいだ後、組織を１ｃｍ角に切断し後述する架橋のための５群に分けた。反応は、振とう台上で室温で７日間、各溶液をホウ酸マンニトール緩衝液（９．３３ｇ／ｌ テトラホウ酸ナトリウム、約２ｇのマンニトールでｐＨ７．４とする）で新たに調製した溶液に毎日交換して実施した。心膜試料を毎日容器から取り出し、すすぎ、通常の生理食塩水で個別に４℃で保管して、実験の最後の示差走査熱量型（ＤＳＣ）分析による収縮温度（Ｔｓ）の測定に備えた。

ＭＡＢＰ保存溶液に水を加え、ＮａＨＣＯ_３で中和し、ホウ酸‐マンニトール緩衝液で３通りの所望の濃度（２ｍＭ、２０ｍＭ、１００ｍＭ）に希釈することにより毎日調製した。次いでＴＧＡを各溶液に添加して終濃度１００ｍＭのＴＧＡとした。追加の２群は同じ緩衝液中の１００ｍＭ ＴＧＡのみで７日間処理し、うち１群は８日目に緩衝液中の１００ｍＭ ＭＡＢＰで再度処理した。バイオプロテーゼ試料のＤＳＣ分析により、適当な収縮温度は架橋６日目までに得られ、その過程では等モル濃度のＭＡＢＰとＴＧＡを除けば全ての条件で重大な支障は認められなかった。等モル濃度のＭＡＢＰとＴＧＡの場合、予想通り、ＭＡＢＰがＴＧＡ‐エポキシ‐残基をクエンチングして架橋過程を著しく遅延させた。試験したうちで最も支障のない条件（ホウ酸‐マンニトール緩衝液（ｐＨ７．４）中の２０ｍＭ ＭＡＢＰおよび１００ｍＭ ＴＧＡ）に用いられたＭＡＢＰ相互結合の抗石灰化能を試験する、さらなる実験を実施した。これらの実験データを表ＩＩＩおよびグラフとして図１に示す。

（ＭＡＢＰとともにＴＧＡを用いた石灰化抑制の増強：ラット皮下移植の結果）
ＴＧＡ‐ＭＡＢＰの抗石灰化の有効性をＴＧＡ架橋単独の場合と比較するために、一連のバイオプロテーゼ材料試料を調製した。使用した材料は、ブタの大動脈弁膜尖、ブタの大動脈壁、およびウシの心膜であった。屠殺場で新鮮なこれらの材料を入手し、氷中で実験室へ運搬した。

全ての材料を通常の生理食塩水で完全にすすぎ、１ｃｍ^２の小片の大動脈壁、心膜、または個々の尖葉を上述のように毎日溶液を交換して７日間、２０ｍＭのＭＡＢＰを含む１００ｍＭのＴＧＡで架橋した。通常の生理食塩水ですすいだ後、生体材料を７５‐８０ｇのオスのスプレーグ‐ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ）ラットの背面の皮下嚢にすでに説明されているように外科的に移植した。動物を２１日目に屠殺し、移植片を回収し、すすぎ、乾燥させ、原子吸光分光光度計（ＡＡ）でＣａ含量を分析した。

表ＩＶおよびグラフとして図２に示すように、ＴＧＡ‐ＭＡＢＰはブタ大動脈壁の石灰化阻害についてＴＧＡ単独よりも有意に有効性が高く、同様にウシ心膜の石灰化を一貫して低減させた。ＭＡＢＰを含めてもラットの体重増加には有意な影響はなかった（表ＩＶ）。よって、これらのデータから、スルフヒドリル連結ビスホスホン酸によりＴＧＡ架橋による抗石灰化の有効性が増強されることが示されている。

ウシ心膜のＴＧＡ架橋に対するＭＡＢＰの効果を示すグラフ。 ２１日間ラット皮下へ植え込んだ移植片における、ＴＧＡ−ＭＡＢＰによる石灰化の抑制をＴＧＡ単独と比較して示すグラフ。

Claims (12)

1. バイオプロテーゼ組織をアミノ‐チオール含有ポリホスホン酸の存在下でポリエポキシドと接触させることからなるバイオプロテーゼ材料の処理方法であって、前記組織が前記ポリエポキシドと架橋し、かつ前記ポリホスホン酸がそのチオール基を介してポリエポキシドに共有結合するような温度および時間接触させることを特徴とし、これにより該バイオプロテーゼ組織が生体内で抗石灰化作用を示すことを特徴とする方法。
2. 前記アミノ‐チオール含有ポリホスホン酸が、（i ）アミノ含有ジスルフィドをポリホスホン酸ビニルと反応させてアミノ‐ジスルフィド含有ポリホスホン酸を形成する工程と、（ii）該ジスルフィド結合を切断してアミノ‐チオール含有ポリホスホン酸を形成する工程とからなる製法によって製造されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記ポリホスホン酸ビニルがビスホスホン酸ビニルである請求項２に記載の方法。
4. 前記ポリホスホン酸が２‐（２‐メルカプトエチルアミノ）‐エチリデン‐１，１‐ビスホスホン酸（ＭＡＢＰ）である請求項１に記載の方法。
5. ポリホスホン酸の存在により、共存するポリエポキシドとバイオプロテーゼ組織との間の架橋反応が影響を受けないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記バイオプロテーゼ組織がバイオプロテーゼ弁膜尖である請求項１に記載の方法。
7. 請求項１に記載の方法により製造される、改善された生体内抗石灰化作用を備えたバイオプロテーゼ物。
8. ポリエポキシ架橋と、チオール基によって共有結合しているチオール含有ポリホスホン酸の抗石灰化剤とを有するバイオプロテーゼ物。
9. アミノ‐チオール含有ポリホスホン酸である抗石灰化剤。
10. 前記アミノ‐チオール含有ポリホスホン酸がβ‐アミノ‐チオール含有ポリホスホン酸である請求項９に記載の化合物。
11. 前記β‐アミノ‐チオール含有ポリホスホン酸がβ‐アミノ‐チオール含有ビスホスホン酸である請求項１０に記載の化合物。
12. 前記β‐アミノ‐チオール含有ビスホスホン酸が２‐（２‐メルカプトエチルアミノ）‐エチリデン‐１，１‐ビスホスホン酸である請求項９に記載の化合物。

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