JP5265253B2

JP5265253B2 - 石灰化に対する耐性を有する埋め込み型医療用デバイスの処理

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Publication number: JP5265253B2
Application number: JP2008160002A
Authority: JP
Inventors: ミン・シェン
Original assignee: ラボラトワール・ペルーズ
Priority date: 2007-06-20
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2028-06-19
Also published as: JP2009006142A; DE602008000403D1; FR2917625A1; CN101337088A; CN101337088B; BRPI0802298B1; EP2005977B1; US20080319166A1; EP2005977A1; BRPI0802298A2; FR2917625B1

Description

発明の詳細な説明

本発明は、埋め込み型医療用デバイス（以下、「医療用インプラント」との一般名とする）に関する。より詳細には、本発明は、タンパク質ベースの医療用インプラントに関し、具体的には、生体適合性であり石灰化に対して耐性を有するようにしたコラーゲンベースの医療用インプラントに関し、より具体的には、こういったインプラントの製造方法に関する。

様々なタイプの医療用インプラントが存在するが、なかでも特別な利点を有するものとして、タンパク質ベースのインプラントが挙げられる。これらのインプラントは特に、生物（具体的にはヒト）に挿入した際に、特に血栓症を回避しうるという点で非生物学的材料ベースのインプラントよりも有利である。しかしながら、このような生体適合性を得るためには、タンパク質ベースのインプラントの前処理が必要である。

実際には、タンパク質ベースのインプラント中に存在するタンパク質は、一般的に、遊離アミン官能基を含む繊維状タンパク質（典型的にはコラーゲン）である。このような遊離アミン官能基は、生体中で、このようなタンパク質の遊離アミン官能基を認識する免疫系に晒されてインプラントが拒絶されることに一部関与する。

このような拒絶が起こらないようにするために、インプラントを、二官能価のアルデヒド化合物、典型的にはグルタルアルデヒドで処理することが知られている。

このような二官能価のアルデヒド化合物の主要な目的は、アミン官能基をマスクすることである。これに関して、このようなアルデヒド官能基は、インプラントのアミン官能基とイミン官能基（−Ｃ＝Ｎ−）を形成することによって反応する。さらに、２個のアルデヒド官能基を有する二官能価の化合物を使用することによって、様々なタンパク質繊維を架橋させることができる。

しかしながら、グルタルアルデヒドタイプの化合物で処理したタンパク質ベースのインプラントは、通常、生体内にそれらインプラントが置かれると、かなり急速なインプラントの石灰化を生じる。

このような石灰化によって、インプラントにカルシウム塩が蓄積してインプラントの硬化が起こる。これは、特に外科的手段による定期的なインプラントの交換を必要とする人工心臓または血管の使用において、インプラントの特性を損なう。この問題についてのさらなる詳細に関しては、具体的にはＵＳ５，６４５，５８７を参照すること。

グルタルアルデヒドで処理したインプラントを、異なる化合物、具体的にはオレイン酸で後処理することが提案されている。根本的にこのようなタイプの処理は、実際には毒性の副産物の存在を除去することを目的としており、石灰化を十分に抑制するものではない。

本発明の目的は、従来知られている処理されたタンパク質ベースのインプラントで観察される石灰化の出現と比較して、好ましくは定期的なインプラントの交換を回避するのに十分な程度に石灰化が抑制された、生体適合性のタンパク質ベースのインプラントを提供することである。

したがって、第一の特徴によれば、本発明は、タンパク質ベースの基体を含むインプラントを処理する方法であって、
（Ａ）タンパク質ベースの基体を、少なくとも１個のアルデヒド基を含む化合物で、好ましくは少なくとも２個のアルデヒド基を含む化合物で処理する工程、続いて、
（Ｂ）該基体を、水素化ホウ素を含む化合物で処理する工程、続いて、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた基体を、シラン基を含む誘導体で処理する工程、
を含む方法に関する。

本説明の観点の範囲内で、「インプラント」とは、タンパク質ベースの基体を含んでなるか、タンパク質ベースの基体で構成される体内埋め込み型のデバイスを意味する。典型的には、本発明に従って処理されたインプラントは心臓に関するインプラントであり、具体的には心臓弁のインプラントである。

このような状況において、「タンパク質ベースの基体」は、１種またはそれより多くのタンパク質を、一般的に主成分として、例えば５０〜１００重量％の含量で含む基体を意味する。このようなタンパク質ベースの基体が、本インプラントの全体を構成するか、または、インプラントの一部を構成している。多くの場合において、本インプラントの全体が上記タンパク質ベースの基体で構成される。

基体は様々な材料であってもよく、例えば、生体環境内で接触するプロテーゼ、チューブ、および、外科用器具である。

本発明の方法において、本インプラントのタンパク質ベースの基体は、具体的にはそれらが確実に生体適合性になるような改質処理を受ける。このような状況において、インプラントの「生体適合性」という用語は、体内（具体的にはヒトの体内）にインプラントが置かれる場合、そのインプラントが、免疫系によって認識されないため、タンパク質ベースのインプラントの拒絶を回避できることを意味する。

ここで本発明者等は、一連の工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）によって、高いレベルの生体適合性をタンパク質ベースのインプラントに付与することができ、同時にそのインプラントの石灰化の出現も制限できることを証明した。

具体的に言えば、発明者等の研究は、工程（Ｂ）および（Ｃ）の組み合わせによって、従来知られているインプラント（すなわち、本発明の工程（Ａ）だけで処理したインプラントに相当する）で観察される石灰化の出現を強力に低減させることを確立することを可能にする。

石灰化の出現の制限は、一連の工程（Ｂ）および（Ｃ）によって、工程（Ａ）で導入された遊離のアルデヒド官能基の大部分がアルコール官能基に還元され（工程（Ｂ））、このアルコール官能基がシロキサン官能基の形態に保護される（工程（Ｃ）において）ということによって一部説明されるようである。このようなシロキサン官能基は、生体適合性の安定な官能基であり、カルシウム塩の蓄積をほとんど促進しないという利点を有する。

さらに、還元工程（Ｂ）は、上述の作用に加えて、工程（Ａ）で導入されたその他の官能基の還元を引き起こすこともさらに証明されている。より正確に言えば、工程（Ｂ）は、インプラント基体の遊離アミンが工程（Ａ）の二官能価のアルデヒドにカップリングされることによって生じたイミン官能基の還元を引き起こす。このようなイミン官能基の反応は、イミン官能基も石灰化を促進することが証明されていることから特に有利である。従って、工程（Ｂ）は、イミン基を、安定であるという利点を有する置換アミン官能基に変換することによって、石灰化を誘導し得るイミン基の除去を可能にする。

したがって、本発明の方法は、インプラントの石灰化に関与する２種の原因の存在を抑制することによって、石灰化の出現を制限することを可能にする。その結果として、本発明の方法に従って製造されたインプラントは、石灰化速度が低いという利点を有し、このような利点により、ある種のケースにおいて、インプラントを外科手術によって交換することを回避したり、または、少なくともインプラントを交換するのに必要な外科手術のタイミングをずらすことが可能になる。

多くの場合において、本発明に従って処理されたインプラント中に存在するタンパク質ベースの基体は、繊維状タンパク質を含むか、または、それらで構成される。好ましくは、基体は、コラーゲンベース、エラスチンベース、フィブリンベース、フィブリノーゲンベース、および／または、プロテオグリカンベースである。

本発明に従って処理されたインプラントは、典型的には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたはダチョウの大動脈弁および／または心膜の全部もしくは一部を含む心臓弁のインプラントである。

タンパク質の存在を考慮すると、本インプラントの基体は、本質的に遊離アミン官能基を含み、このような官能基は、生体に未処理の基体を処理することなく埋め込んだ場合に、少なくとも部分的に拒絶に関与すると思われる、。

本発明に係る方法の工程（Ａ）において、本インプラントを構成するタンパク質ベースの基体は、少なくとも１個のアルデヒド基を含む化合物で処理される。以降、簡潔にするために、前記化合物を「アルデヒド化合物」という一般的な名称とする。工程（Ａ）のアルデヒド基は、基体の遊離アミン官能基において、前記官能基をイミン官能基に変換することによって反応すると考えられる。一般的に、少なくとも１個のアルデヒド官能基を含む化合物は、Ｒ−ＣＨＯ（式Ｉ）で示される化合物であり、ここで式中Ｒは、典型的には２〜１８個の炭素原子、例えば３〜８個の炭素原子を含む炭化水素鎖であり、この炭化水素鎖は、任意に、塩素、フッ素、臭素、窒素、リンまたは硫黄原子などのヘテロ原子で置換されていてもよい。前記基Ｒは、任意に、１個またはそれより多くのその他のアルデヒド基（−ＣＨＯ）で置換されていてもよい。

工程（Ａ）のアルデヒド化合物は、水溶性であることが有利である。

有利な実施態様によれば、工程（Ａ）で用いられるアルデヒド化合物は、少なくとも２個のアルデヒド−ＣＨＯ基を含む化合物であり、このアルデヒド−ＣＨＯ基によって、本発明の方法に従って処理されたインプラント基体のタンパク質繊維うちいくつかを架橋させることができる。このような状況において、工程（Ａ）のアルデヒド化合物は、具体的には一般式（ＩＩ）：ＨＯＣ−Ｒ^２−ＣＨＯで示される化合物であってもよく、ここで式中Ｒ^２は、典型的には２〜１８個の炭素原子、例えば３〜８個の炭素原子を含む炭化水素鎖であり、この炭化水素鎖は、任意に、塩素、フッ素、臭素、窒素、リンまたは硫黄原子などのヘテロ原子で置換されていてもよい。好ましくは、工程（Ａ）のアルデヒド化合物は、グルタルアルデヒドである。

工程（Ａ）の重要な実施態様によれば、本インプラントの基体は、溶液（Ｓ_Ａ）、具体的には上記アルデヒド化合物を含む水溶液中に、少なくとも２週間、好ましくは少なくとも１ヶ月浸漬される。この実施態様に従って用いられる溶液（Ｓ_Ａ）は、具体的には、上記アルデヒド化合物を緩衝液で希釈することによって製造してもよく、溶液（Ｓ_Ａ）のｐＨは、好ましくは５〜９である。一例として、上記アルデヒド化合物がグルタルアルデヒドである場合、溶液（Ｓ_Ａ）のｐＨは、約６〜８である。緩衝液として、具体的には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、または、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）の水溶液を、好ましくは１０〜５０ｍｍｏｌ／ｌの濃度、例えば約２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いてもよい。溶液（Ｓ_Ａ）中のアルデヒド化合物の濃度は、溶液（Ｓ_Ａ）の総体積に対して、典型的には０．１〜１％、例えば約０．６〜０．７重量％である。加えて、上記アルデヒド化合物を、２００〜４００ｍＯｓＭｏｌ／ｌ、例えば約３００ｍＯｓＭｏｌ／ｌの浸透圧モル濃度（溶媒１キログラムあたりの溶質のモル数に相当する）で含む溶液（Ｓ_Ａ）を用いることが好ましい。

好ましくは、工程（Ａ）の処理は、撹拌しながら行われる。加えて、工程（Ａ）の反応媒体の温度は、好ましくは、１０〜７０℃である。例えば、工程（Ａ）は、周囲温度で、典型的には２０〜３０℃で、具体的には約２５℃で行ってもよい。

多くの場合において、工程（Ａ）の処理は、以下の図式的な反応式に従う遊離アミン官能基と上記アルデヒド化合物との反応を生じる。

［基体］−ＮＨ_２＋Ｒ−ＣＨＯ → ［基体］−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ
［式中、Ｒは、上記で定義された意味である］
多くの場合において、そして具体的には、上述の好ましい溶液が用いられる場合、工程（Ａ）は、本インプラントの基体に最初に存在する遊離アミン官能基のほとんど、場合によっては全ての反応を引き起こす。

少なくとも２個のアルデヒド官能基を含む化合物を用いる場合において、工程（Ａ）はさらに、以下のスキームの反応式に従って、基体の繊維のいくつかとの間の架橋を生じる反応を引き起こす：

［式中、Ｒ^２は、上記で定義された意味である］
二官能価のアルデヒド化合物に関して、ある種の場合において、前記アルデヒド化合物のアルデヒド官能基のうち１個が、以下の反応式で示されるように遊離のままであってもよい：

［式中、Ｒ^２は、上記で定義された意味である］
したがって、工程（Ａ）の完了時に、石灰化を誘導すると考えられる遊離のアルデヒド−ＣＨＯ基が残る。さらに、基体には、石灰化の源でもあるイミン官能基（−Ｎ＝Ｃ−）も含まれる。

このタイプの反応は、コラーゲンベースのインプラントが、当業界において既知の方法によってグルタルアルデヒドで処理される場合に観察される。

工程（Ｂ）および（Ｃ）の目的は、実質的に全ての前記遊離のアルデヒド−ＣＨＯ基、および、工程（Ａ）の完了時に導入されたイミン官能基を取り除くことである。

本発明に係る方法の工程（Ｂ）において、基体は、水素化ホウ素を含む化合物で処理されるが、それによりアルデヒド官能基をアルコール官能基に還元することができ、さらにイミン官能基に関しても、上記タンパク質を構成するアミド官能基が改変されないような選択的な方法で、アミン官能基に還元することができる。

工程（Ｂ）で用いられる水素化ホウ素を含む化合物は、好ましくは、アルカリ金属誘導体であり、例えばナトリウム、リチウムまたはカリウムの誘導体である。好ましくは、水素化ホウ素を含む化合物は、金属シアノボロハイドライドであり、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。

好ましい実施態様によれば、工程（Ｂ）は、本発明に係る方法の工程（Ａ）で得られた基体の一部または全体を、水素化ホウ素を含む化合物溶液（Ｓ_Ｂ）に、典型的には少なくとも１時間、一般的には少なくとも５時間、例えば１０〜３０時間、典型的には約２４時間浸漬することによって行ってもよい。この実施態様に従って用いられる溶液（Ｓ_Ｂ）は、具体的には、水素化ホウ素を含む化合物を緩衝溶液で希釈することにより得てもよい。このような溶液（Ｓ_Ｂ）は、典型的には、ｐＨ５〜１１を有する。適切な緩衝液は、具体的には、リン酸二ナトリウムを含む水溶液であり、その濃度は、典型的には２０〜５００ｍｍｏｌ／ｌであり、例えば約２００ｍｍｏｌ／ｌである。水素化ホウ素を含む化合物の濃度は、具体的には、１０〜１６０ｍｍｏｌ／ｌであり、好ましくは約８０ｍｍｏｌ／ｌに等しい。

工程（Ｂ）の処理は、一般的に撹拌しながら行われ、例えば約５０ｒｐｍ^−１で撹拌しながら行われる。工程（Ｂ）の反応媒体の温度は、好ましくは１０〜７０℃である。例えば、工程（Ｂ）は、周囲温度で、例えば２０〜３０℃で、典型的には約２５℃で行うことができる。

典型的には、工程（Ｂ）で起こる反応は、以下の通りである。

［式中、Ｒ^２は、上記で定義された意味である］
したがって、工程（Ｂ）の完了時に、基体には、末端のアルコール官能基が含まれ、このような官能基は、具体的には本インプラントの分解を引き起こすと考えられるリン酸化酵素と反応する可能性がある。実際に、前記酵素のリン酸基は、基体の石灰化が始まると容易にカルシウムカチオンと結合する。結局、このようなインプラントの分解によっても、外科的手段による前記インプラントの交換が必要となると考えられる。

工程（Ｃ）の目的は、工程（Ｂ）で導入された末端アルコール官能基の除去である。この目的のために、本発明の方法の工程（Ｃ）において、工程（Ｂ）で得られた基体は、シラン基を含む誘導体で処理され、アルコール官能基がシロキサン官能基に変換される。このようにして形成されたシロキサン官能基は非反応性であり、アルコール官能基を保護するためのシロキサン官能基への反応は、不可逆的である（脱保護は、基体の破壊を伴うと予想される）という意味からいっても最も確実である。この最も確実な末端アルコール官能基の保護は、生物由来の活性化合物による本インプラントのあらゆる分解を回避できることを意味する。さらに、シロキサン官能基は免疫系によって認識されず、石灰化を促進しない。

一般的に言えば、工程（Ｃ）で用いられるシラン基を含む誘導体は、ケイ素原子に直接結合している電子求引性基を含む。前記電子求引性基は、典型的には、ハロゲン、５〜１５個の炭素原子を含むヘテロアリール基（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素などのハロゲン、元素周期表の第５列に属する元素に相当するニクトゲン（例えば窒素およびリン）、ならびに、周期表の第１６列に属する元素に相当するカルコゲン（例えば酸素および硫黄）からなる群より典型的には選択される２または３個のヘテロ原子を含んでいてもよい）から選択される。

好ましくは、工程（Ｃ）で用いられるシラン基を含む誘導体中に存在する電子求引性基は、塩素原子、臭素原子、または、イミダゾール基である。

その他の形態によれば、電子求引性基は、当業者既知の上述したものが可能である。

好ましくは、工程（Ｃ）で用いられるシラン基を含む誘導体は、トリアルキルシリルイミダゾール、または、ハロゲノトリアルキルシランであり、例えばトリメチルシリルイミダゾール、または、クロロトリメチルシラン（または、以降、クロロメチルシランとも称する）である。

好ましくは、工程（Ｃ）で用いられるシラン基を含む誘導体は、溶液（Ｓ_Ｃ）の形態で導入される、ここで、この溶液（Ｓ_Ｃ）の溶媒として、テトラヒドロフラン、または、ジオキサン、ジグライム、トリグライム、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、または、Ｎ−メチルピロリドンからなる群より選択される少なくとも１つの水溶性の非毒性化合物が用いられる。一例として、シラン基を含む誘導体は、テトラヒドロフランで、１〜２０％の希釈率、好ましくは約１０％に等しい希釈率で希釈してもよい。

典型的には、工程（Ｃ）において、工程（Ｂ）から得られた基体は、上述の溶液（Ｓ_Ｃ）中で、１〜３０分間、例えば４〜６分間、典型的には約５分間処理される。工程（Ｃ）における処理は、具体的には撹拌しながら行ってもよく、例えば約５０ｒｐｍ^−１で撹拌しながら行ってもよい。加えて、工程（Ｃ）において、反応媒体の温度は、好ましくは１０〜３５℃である。例えば、工程（Ｃ）は、周囲温度で、例えば２０〜３０℃、典型的には約２５℃で行うことができる。

好ましい態様によれば、本発明に係る方法は、上述の工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に加えて、工程（Ａ）と（Ｂ）との間に中間工程（Ａ１）を含んでなり、この中間工程において、工程（Ａ）の完了時に得られた基体が、工程（Ｂ）および（Ｃ）が行われる前に、少なくとも２個のアミン官能基を含む化合物で処理される。

本発明の方法のこの形態によれば、以下のスキームの反応式に従って、工程（Ａ）の完了時に形成された遊離のアルデヒド官能基の一部が、工程（Ａ１）で用いられるアミン官能基を含む化合物に存在するアミン官能基上で反応することによって、イミン結合が形成される：

上記の略図で説明されるように、工程（Ａ１）によって、その他の利点のなかでも、基体のタンパク質鎖間の架橋が増加する。

加えて、工程（Ａ１）は、工程（Ａ）が完了した時点で遊離のままであるアルデヒド官能基（−ＣＨＯ）の一部をマスクする。図示したように、このマスキングは、遊離の末端アミン官能基を含むグラフト化された鎖の形成を誘導する可能性がある。しかしながら、このような遊離の末端アミン官能基の存在は、本インプラントの生体適合性に有害ではない。実際には、前記官能基は免疫系によって認識されないため、それによる拒絶は起こらない。

好ましくは、工程（Ａ１）で用いられる少なくとも２個のアミン官能基を含む化合物は、式：ＮＨ_２−Ａ−ＮＨ_２で示されるジアミンであり、ここで、Ａは、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を示し、この炭化水素鎖は、任意に、ハロゲン（例えばフッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、元素周期表の第Ｖｂ列に属する元素に相当するニクトゲン（例えば窒素およびリン）、および、周期表の第Ｖｌｂ列に属する元素に相当するカルコゲン（例えば酸素および硫黄）からなる群より選択される１個またはそれより多くのヘテロ原子で置換されていてもよい。さらにより好ましくは、少なくとも２個のアミン官能基を含む化合物は、ポリ（プロピレングリコール）ビス（２−アミノプロピルエーテル）、リシン、スペルミン、または、プトレシンである。

１つの実施態様によれば、工程（Ａ１）は、少なくとも１個のアミン官能基を含む化合物を、典型的には１０〜２００ｍｍｏｌ／ｌの濃度、好ましくは４０〜８０ｍｍｏｌ／ｌの濃度、例えば約６０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含む水溶液（Ｓ_Ａ１）中に、本発明に係る方法の工程（Ａ）で得られたインプラントの一部または全部を浸漬することによって行ってもよい。典型的には、工程（Ａ１）は、溶液（Ｓ_Ａ１）中に、本インプラントの一部または全部を、典型的には１０〜１００分間、例えば約６０分間浸漬することによって行われる。

工程（Ａ１）での処理は、典型的には、撹拌しながら行ってもよく、例えば約５０ｒｐｍ^−１で撹拌しながら行ってもよい。工程（Ａ１）の反応媒体の温度は、好ましくは、１０〜７０℃である。例えば、工程（Ａ１）は、周囲温度で、例えば２０〜３０℃、典型的には約２５℃で行うことができる。

具体的な実施態様によれば、工程（Ａ）および任意に工程（Ａ１）の後に、かつ工程（Ｂ）の前に、本発明の方法は、反応媒体のｐＨが、具体的にはｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ５．５〜６．５、例えば約６に等しいｐＨになるようにｐＨを改変するための工程をさらに含んでいてもよく、それにより工程（Ｂ）それに続く工程（Ｂ）の還元が促進される。この工程は、具体的には、工程（Ａ）から得られた媒体、および、任意の工程（Ａ１）から得られた媒体を、モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）で１０〜５０時間、好ましくは２０〜３０時間、例えば約２４時間処理することによって行ってもよい。

一実施態様によれば、本発明の方法の各工程の前後に、本インプラントを、水で、典型的には超純水で洗浄してもよい。このような状況において、「超純水」とは、水の抵抗が、約２５℃で約１８．２ＭΩ・ｃｍに等しいことを意味する。水、具体的には超純水で洗浄することによって、本方法のそれぞれ工程の完了時に存在する過量の反応物が除去され、本インプラントにおいて生体の有機体と相互作用する可能性があるあらゆる化合物が存在しないようにする。一例として、工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）、ならびに任意に（Ａ１）それぞれの前後に、本インプラントは、少なくとも２回、好ましくは３回超純水でリンスしてもよい。

１つの実施態様によれば、工程（Ａ）の媒体は、それに続く工程（Ｂ）および（Ｃ）の実施、または、工程（Ａ１）、（Ｂ）および（Ｃ）の実施に関してインプラントが保護されるように分離してもよい。

１つの実施態様によれば、工程（Ａ）、任意に（Ａ１）、（Ｂ）および（Ｃ）に従って処理されたインプラントは、工程（Ｃ）の後にその他の処理を行ってもよい。このような追加の処理は、本インプラントの石灰化に対する耐性がよりいっそう改善されるように行ってもよい。一例として、工程（Ｃ）から得られたインプラントは、従来知られている石灰化を防止する溶液で処理してもよく、このような溶液としては、例えば「滅菌剤」（２２％エタノール、４％ホルムアルデヒド、および、１．２％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（ポリソルベート８０）、その残部は水であり、パーセンテージは、溶液の総体積に対する体積で示される）が挙げられる。

本発明の方法を実施する方法がどのようなものであっても、前記方法の完了時に、石灰化を誘導する可能性がある官能基を実質的に含まないインプラントが得られる。

第二の特徴によれば、本発明はまた、本発明の方法を完了して得られるような処理されたタンパク質ベースのインプラントにも関する。

本発明に従って処理されたインプラントは、一般的に、遊離のアルデヒド官能基（−ＣＨＯ）、および、イミン官能基を実質的に含まない。

加えて、本発明に従って処理されたインプラントは、末端のシロキサン官能基を含む。

末端のシロキサン官能基は、インプラント表面のケイ素原子を介して、ヘテロ原子、例えば窒素、酸素、塩素、臭素、ヨウ素またはリン原子を含む炭化水素鎖を意味する。

従って、本発明に係るインプラントは、石灰化が少ないという利点を有する。

好ましくは、本発明に従って処理されたインプラントは、心臓弁のインプラントである。

以下の非限定的な実施例によれば、本発明の様々な特徴および利点が明らかであろう。

［実施例］
使用した基体
インプラントを製造するために、ウシ心膜の一部を基体として用いた。

溶液の調製
以下の実施例において用いた超純水は、約２５℃で約１８．２ＭΩの抵抗を有する水溶液である。

グルタルアルデヒド溶液（Ｓ１）
約６．２５ｇのグルタルアルデヒドを、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムを約２０ｍｍｏｌ／ｌで含む緩衝溶液（約１ｌ）で希釈した。このようにして得られたグルタルアルデヒドの最終濃度は、溶液（Ｓ１）の総体積に対して約０．６２５重量％であった。

溶液（Ｓ１）に約５．３ｇの塩化ナトリウムを添加することによって、この溶液の浸透圧モルの濃度は約３００ｍＯｓｍｏｌ／ｌに等しくなった。

溶液（Ｓ１）のｐＨは、約７．４であった。

ポリ（プロピレングリコール）ビス（２−アミノプロピルエーテル）（ジェファミン）溶液（Ｓ２）
約１．４３７ｍｌのポリ（プロピレングリコール）ビス（２−アミノプロピルエーテル）を約９８．５６３ｍｌの超純水で希釈した。

溶液（Ｓ２）中のポリ（プロピレングリコール）ビス（２−アミノプロピルエーテル）の濃度は、約６０ｍｍｏｌ／ｌに等しかった。

シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ _３）溶液（Ｓ３）
約０．５ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、一晩かけて約１０ｍｌの超純水に溶解させた。次に、得られた溶液を、２００ｍｍｏｌ／ｌのＮａ_２ＨＰＯ_４を含む他の溶液（約９０ｍｌ）で希釈した。

溶液（Ｓ３）中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの最終濃度は、約８０ｍｍｏｌ／ｌであった。

クロロメチルシラン（クロロトリメチルシラン）溶液（Ｓ４）
約１０ｍｌのクロロメチルシランを約９０ｍｌのテトラヒドロフランで希釈した。

トリメチルシリルイミダゾール溶液（Ｓ５）
約１０ｍｌのトリメチルシリルイミダゾールを、約９０ｍｌのテトラヒドロフランで希釈した。

「滅菌剤」溶液（Ｓ６）
約２２０ｍｌの無水エタノール、１０８ｍｌのホルムアルデヒド（３７％）、および、１２ｍｌのトゥイーン８０を、約６６０ｍｌのリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム緩衝液で希釈した。リン酸塩の最終濃度は約２０ｍｍｏｌ／ｌであり、溶液のｐＨは約７．４であった。

実施例１：本発明の方法の工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）による基体の処理
グルタルアルデヒド溶液（Ｓ１）での処理
基体を、溶液（Ｓ１）で周囲温度（約２５℃）で少なくとも１ヶ月処理した。

前記処理の完了時に、処理された基体を各辺が８ｍｍ、約７ｍｍの四角形に切断して、測定した。

このようにして処理された基体から得られたサンプルを超純水で３回リンスした。

シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（Ｓ３）での処理
上記でリンスしたサンプルを、約１００ｍｌの溶液（Ｓ３）を含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。次にこの反応媒体を、約５０ｒｐｍ^−１で、周囲温度（約２５℃）で約２４時間撹拌した。

このようにして処理されたサンプルを超純水で３回リンスした。

クロロメチルシラン溶液（Ｓ４）での処理
このようにしてリンスしたサンプルを、１００ｍｌのクロロメチルシラン溶液（Ｓ４）を含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。この反応媒体を、約５０ｒｐｍ^−１で、周囲温度（約２５℃）で約５分間撹拌した。

実施例２：本発明の方法の工程（Ａ）、（Ａ１）、（Ｂ）および（Ｃ）による基体の処理
グルタルアルデヒド溶液（Ｓ１）での処理
基体を、溶液（Ｓ１）で周囲温度（約２５℃）で少なくとも１ヶ月処理した。

前記処理の完了時に、処理された基体を各辺が約７ｍｍの四角形に切断した。

ポリ（プロピレングリコール）ビス（２−アミノプロピルエーテル）（ジェファミン（Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ））溶液（Ｓ２）での処理
このようにしてリンスしたサンプルを、１００ｍｌの溶液（Ｓ２）を含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。このボトルを、約５０ｒｐｍ^−１で周囲温度（約２５℃）で約１時間撹拌した。

この反応媒体に、約５．７６ｇのモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）を添加した。この反応媒体を、約５０ｒｐｍ^−１で周囲温度（約２５℃）で約２３時間撹拌した。

この反応媒体の最終的なｐＨは、約６であった。

クロロメチルシラン溶液（Ｓ４）での処理
このようにしてリンスしたサンプルを、約１００ｍｌのクロロメチルシラン溶液（Ｓ４）を含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。次に反応媒体を、約５０ｒｐｍ^−１で、周囲温度（約２５℃）で約５分間撹拌したこのようにして処理されたサンプルを超純水で３回リンスした。

実施例３：本発明の方法の工程（Ａ）、（Ａ１）、（Ｂ）および（Ｃ）による基体の処理
最後の工程（Ｃ）において、クロロメチルシラン溶液（Ｓ４）の代わりにトリメチルシリルイミダゾール溶液（Ｓ５）を用いたことを除いて、同じ手法を繰り返した。

実施例４：本発明の方法の工程（Ａ）、（Ａ１）、（Ｂ）および（Ｃ）、さらにそれに続く石灰化を防止する溶液（滅菌剤）で処理する工程による基体の処理
実施例３の手法を行い、続いて以下の工程を行った。

このようにして処理されたサンプルを、１００ｍｌの溶液（Ｓ６）を含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。次にこの反応媒体を、約５０ｒｐｍ^−１で、周囲温度（約２５℃）で約２４時間撹拌した。

［比較例］
比較例１：工程（Ａ）のみによる基体の処理
基体を、グルタルアルデヒド溶液（Ｓ１）で周囲温度（約２５℃）で少なくとも１ヶ月処理した。

前記処理の完了時に、処理した基体を各片が７ｍｍの四角形に切断した。

このようにして処理された基体から得られたサンプルを超純水で３回リンスし、それらをラットに埋め込むまで（Ｓ１）溶液中で維持した。

比較例２：工程（Ａ）、続いて滅菌剤溶液（Ｓ６）で処理する工程による基体の処理
比較例１と同じ手法を行い、その最後に以下の工程を行った。

このようにしてグルタルアルデヒド溶液（Ｓ１）で処理されたサンプルを、１００ｍｌの水溶液（Ｓ６）を含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。この反応媒体を、約５０ｒｐｍ^−１で約３２℃で約９時間撹拌した。

比較例３：工程（Ａ）、続いてテトラヒドロフランで処理する工程による基体の処理
比較例１と同じ手法を行い、その最後に以下の工程を行った。

このようにしてグルタルアルデヒド溶液（Ｓ１）で処理されたサンプルを、１００ｍｌのテトラヒドロフランを含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。この反応媒体を、約５０ｒｐｍ^−１で、周囲温度（約２５℃）で約２４時間撹拌した。

比較例４：工程（Ａ）、続いて溶液（Ｓ４）を用いた工程（Ｃ）による基体の処理
比較例１と同じ手法を行い、その最後に以下の工程を行った。

このようにしてグルタルアルデヒド溶液（Ｓ１）で処理されたサンプルを、１００ｍｌのクロロメチルシラン溶液（Ｓ４）を含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。次にこの反応媒体を、約５０ｒｐｍ^−１で周囲温度（約２５℃）で約５分間撹拌した。

比較例５：工程（Ａ）、続いて溶液（Ｓ５）を用いた工程（Ｃ）による基体の処理
比較例４の手法を行い、クロロメチルシラン溶液（Ｓ４）の代わりにトリメチルシリルイミダゾール溶液（Ｓ５）を用いた。

比較例６：工程（Ａ）、続いて溶液（Ｓ５）を用いた工程（Ｃ）、続いて滅菌剤溶液（Ｓ６）を用いた処理工程による基体の処理
比較例５の手法を行い、その最後に以下の工程を行った。

このようにしてグルタルアルデヒド溶液（Ｓ１）で処理されたサンプルを、１００ｍｌの溶液（Ｓ６）を含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。次にこの反応媒体を、約５０ｒｐｍ^−１で、周囲温度（約２５℃）で約２４時間撹拌した。

比較例７：（Ａ）工程、（Ａ１）工程、続いて溶液（Ｓ４）を用いた（Ｃ）工程による基体の処理
比較例１と同じ手法を行い、その最後に以下の工程を行った。

ポリ（プロピレングリコール）ビス（２−アミノプロピルエーテル）溶液（Ｓ２）による処理
このようにして溶液で処理されたサンプルを、１００ｍｌの（Ｓ２）溶液を含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。このボトルを、約５０ｒｐｍ^−１で周囲温度（約２５℃）で約１時間撹拌した。

この反応媒体の最終的なｐＨは、約６であった。

クロロメチルシラン溶液（Ｓ４）での処理
このようにしてリンスしたサンプルを、１００ｍｌのクロロメチルシラン溶液（Ｓ４）を含む長方形の断面を有する１５０ｍｌのボトルに移した。次にこの反応媒体を、約５０ｒｐｍ^−１で周囲温度（約２５℃）で約５分間撹拌した。

ラットにおける石灰化の研究
上述の実施例から得られた未処理または処理済のサンプルを、１２日齢の新生児ラットの皮下に埋め込んだ。

このラットを、埋め込み後９日間離乳させ、ラット体重１ｋｇあたり約３３２ｍｇのカルシウム、約２３６ｍｇのリン、約９．６ｍｇの鉄、約６０ＵＩのビタミンＤ３を含む穀類の一部からなるエサを与え、水は無制限に与えた。

埋め込みの１０ヶ月後に、ラットを死なせ、サンプルを解析できるように体外培養した。

このサンプルを超純水を用いて洗浄し、凍結乾燥し、重さを量った（ｍｇ、乾燥重量）。この凍結乾燥したサンプルを約１ｍｌの７０％硝酸で約９５℃で約１５分間消化した。次に、媒体の体積を５ｍｌのメスフラスコ中で超純水で約５ｍｌにした。

前記サンプルのカルシウムを、原子の炎光光度計を用いて分析した。このようにして分析されたカルシウムは、実質的にインプラントの石灰化から生じるものである。

以下の表に、様々な処理で処理されたサンプル、または、未処理のサンプルから得られたカルシウム分析の結果を示す。

上記表に示される結果によれば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで処理され、続いてシラン基を含む誘導体（具体的にはクロロメチルシランまたはトリメチルシリルイミダゾール）で処理された基体は、市販の溶液である滅菌剤を用いた処理と比較して、明らかに石灰化を低減させた。

さらに、本インプラントを少なくとも２個のアミン官能基を含む化合物、ポリ（プロピレングリコール）ビス（２−アミノプロピルエーテル）でさらに処理した場合、石灰化がさらに低減された。

Claims

タンパク質ベースの基体を含むインプラントを処理する方法であって、
（Ａ）タンパク質ベースの基体を、少なくとも１個のアルデヒド基を含む化合物で処理する工程、続いて、
（Ｂ）該基体を、水素化ホウ素を含む化合物で処理する工程、続いて、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた基体を、シラン基を含む誘導体で処理する工程、
を含んでなる、上記方法。
前記タンパク質ベースの基体が、コラーゲンベース、エラスチンベース、フィブリンベース、フィブリノーゲンベース、および／または、プロテオグリカンベースである、請求項１に記載の方法。
前記インプラントが、ウシ、ブタまたはヒツジの大動脈弁および／または心膜の全部もしくは一部を含む心臓弁のインプラントである、請求項１または２に記載の方法。
工程（Ａ）において、少なくとも２個のアルデヒド基を含む化合物が用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記工程（Ｂ）で用いる水素化ホウ素を含む化合物が、アルカリ金属誘導体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記工程（Ｂ）で用いる水素化ホウ素を含む化合物が、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである、請求項５に記載の方法。
前記工程（Ｃ）で用いるシラン基を含む誘導体が、ケイ素原子に直接結合した電子求引性基を含み、ここで該電子求引性基は、ハロゲン、５〜１５個の炭素原子とハロゲン、ニクトゲンおよびカルコゲンからなる群より選択される２または３個のヘテロ原子とを含むヘテロアリール基から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記工程（Ｃ）で用いるシラン基を含む誘導体中に存在する電子求引性基が、塩素原子、臭素原子、または、イミダゾール基である、請求項７に記載の方法。
前記工程（Ｃ）で用いるシラン基を含む誘導体が、トリメチルシリルイミダゾール、または、クロロトリメチルシランである、請求項８に記載の方法。
工程（Ａ）と（Ｂ）との間に中間工程（Ａ１）を含み、ここで、工程（Ｂ）および（Ｃ）が行われる前に、工程（Ａ）の完了時に得られた基体が少なくとも２個のアミン官能基を含む化合物で処理される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも２個のアミン官能基を含む化合物が、式：ＮＨ_２−Ａ−ＮＨ_２で示されるジアミンであり、ここで、Ａは、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を示し、該炭化水素鎖は、任意に、ハロゲン、ニクトゲンおよびカルコゲンからなる群より選択される１個または複数個のヘテロ原子で置換されていてもよい、請求項１０に記載の方法。
前記少なくとも２個のアミン官能基を含む化合物が、ポリ（プロピレングリコール）ビス（２−アミノプロピルエーテル）、リシン、スペルミン、または、プトレシンである、請求項１１に記載の方法。
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の処理方法を完了して得ることができる、タンパク質ベースの処理済インプラント。
前記インプラントが、遊離のアルデヒド−ＣＨＯ官能基、および、イミン官能基を実質的に含まない、請求項１３に記載のインプラント。
前記インプラントが、心臓弁のインプラントである、請求項１３または１４に記載のインプラント。