CN1162252A - 钙化抗性生物修复组织及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

用环氧化物交联剂处理天然产生的生物修复材料，在一些实施方案中，将组织在水溶液中于高pH值下用低分子量环氧化物交联。在另一些实施方案中，在叔胺或季胺如Tris或咪唑的催化下将组织在生理pH值用环氧化物交联剂交联。在一个优选的实施方案中，生物修复组织是用抗钙化剂如多膦酸酯抗钙化剂利用多膦酸酯：聚环氧化物单加成物进行交联和衍生化。

Description

钙化抗性生物修复组织及其制备方法
发明背景
本发明一般地涉及对体内钙化作用有抗性的材料，特别是涉及用环氧化物交联剂制备适于在活体内植入的钙化抗性生物材料的方法。
每年要在病人体内植入100,000个以上心瓣膜修复物。瓣膜置换外科手术通常是治疗心脏瓣膜疾病的唯一手段。目前使用的置换瓣膜包括全部由合成聚合材料如聚氨酯组成的机械瓣膜、衍生于牛心包膜或猪主动脉瓣的生物修复瓣膜、以及主动脉同种移植物。
使用机械瓣膜常常并发血栓形成和组织过度生长而使瓣膜功能不全。与机械瓣膜修补物相比，生物修复心脏瓣膜改善了血栓形成性和血液动力学性质。然而，钙化是导致从猪主动脉瓣或牛心包膜制造的生物修复心脏瓣膜之临床功能不全的最常见原因。人主动脉同种移植物虽然比生物修复心脏瓣膜钙化速率慢，但也已观察到涉及瓣膜组织及相邻主动脉壁的病理性钙化。病理性钙化导致狭窄和/或回流形式的瓣膜功能不全，因而需要重新移植。因此，由于生物修复心脏瓣膜和同种移植物易于钙化，而使这些组织的使用受到限制。事实上，已发现儿科病人有加速的钙化速率，因而这一年龄组病人忌用生物修复性心脏瓣膜。
不幸的是，病理性钙化还进一步累及合成的血管移植物及其他人工心脏装置如心室辅助系统的使用，因为它影响用于生产该装置的合成聚合物的柔曲性。
有关心血管组织病理性钙化的机制尚不完全明了。总地说来，术语“病理性钙化”是指磷酸钙矿物盐的不希望的沉积。钙化可能是由于宿主因素、移植物因素及机械应力等外在因素导致的。有某些证据提示，钙的沉积与失去生命力的细胞，特别是细胞膜有关，其中负责维持低细胞内钙水平的钙泵(Ca+2-Mg+2-ATPase)不再发挥功能或者是功能低下的。已观察到钙化随着作为羟基磷灰石存在的钙和磷的积聚而开始，其发展成小节结并最终导致瓣膜功能不全。
在移植前制备生物修复组织一般包括对组织上和组织中的分子特别是胶原进行交联处理，以使之稳定化而足以对抗继后的体内酶降解。已为此目的使用了各种醛类物质如乙醛酰、甲醛和戊二醛。但优选的是戊二醛。除了固定组织外，戊二醛还是好的消毒剂，并且可降低组织的抗原性。迄今为止，戊二醛是唯一用于制备待移植组织的可在含水和生理pH条件下使用的有效交联剂。不幸的是，现已知道戊二醛可促进钙化。因此，本技术领域中需要一种不会促进钙化的交联生物修复组织的方法。
已研究了非醛交联剂例如聚环氧化物(如由Nagasi Chemicals，Osaka，Japan以商标Denacol出售的聚甘油聚缩水甘油醚)，但还没有获得足以证明聚环氧化物体内交联组织的效力的研究结论。
有关抑制生物修复组织钙化的研究主要集中于用去污剂或二膦酸盐抗钙化剂预处理组织上。已证明用非共价连接的去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)，和共价结合的去污剂如氨基油酸进行去污剂预处理，对于暴露于循环血液的材料是有效的。但由于血液-材料相互作用，去污剂和二膦酸盐趋向于随时间延长从被植入的生物修复组织中洗去。因此，这些处理只不过是延迟不可避免的钙化过程的发生。所以也需要提供一种能使易于体内病理性钙化作用的生物修复性心脏瓣膜及其他可植入的生物材料长期有钙化抗性的方法。
另外，去污剂对组织的不利影响可导致作为材料强度、耐用期和完整性的重要测量标准的胶原变性温度或皱缩温度(Ts)的降低。在某些情况下，使用去污剂可导致局部毒性。因此，需要有一种赋予生物修复组织以抗钙化性质并且不伴有去污剂之有害作用的有效方法。
根据外植样品的钙含量测知，所有前述技术仍导致某种程度的体内病理性钙化。因此，需要有一种在更大程度上抑制钙化的处理方法。
系统应用抗钙化剂如二膦酸会导致对骨骼以及整体生长的明显的副作用，因此需要一种具有低局部药物水平和最小副作用的防止病理性钙化的位点特异性疗法。
因此，本发明的一个目的是提供具有对体内病理性钙化有增加的抗性的用于移植到哺乳动物中的生物材料。
本发明的另一个目的是提供具有对体内病理性钙化有长期或延长的抗性的用于移植到哺乳动物中的生物材料。
本发明的再一个目的是提供具有局部的钙化抑制作用因而避免了抗钙化剂的系统给药引起的毒副作用的用于移植到哺乳动物中的生物材料。
本发明的又一个目的是提供用环氧化物交联剂制备和/或处理用于移植到哺乳动物中的生物材料以使生物材料对体内病理性钙化更具有抗性的方法。发明概述
本发明实现了前述和其他一些发明目的，一方面，其提供了适于移植到活体内部的生物材料，该生物材料与有效量的环氧化物交联剂不可逆地结合以稳定组织并阻断钙化位点，从而使所述的生物材料基质对体内病理性钙化有抗性。
在本发明的另一方面，生物材料用多膦酸酯：聚环氧化物单加成物交联和衍生化，如本文所用，术语“衍生化”是指将抗钙化剂如前述的多膦酸酯通过环氧键共价附着到生物材料组织的表面。
本文中术语“生物材料”是指可得自不同动物，特别是哺乳动物的胶原材料。该生物材料一般是适于移植的材料，如生物修复组织等，但本发明不只限于这些。具体实例包括但不限于心脏瓣膜特别是猪心脏瓣膜、主动脉根、壁和/或小叶；牛心包膜；结缔组织衍生的材料如硬脑膜；同种移植组织如主动脉同种移植物和隐静脉旁路移植物；肌腱、韧带、皮瓣、动脉、静脉等。当然，任何其他已知的或将会已知的适于在活体内留置使用的生物学衍生材料均将包括于本发明范围内。
任何环氧化合物，优选水溶性的能作为钙拮抗剂的环氧化合物均包括在本发明范围内。合适的环氧化物交联剂的例子包括但不限于单环氧化物或双环氧化物，如二环氧甘油丁二醇酯，乙二醇二环氧甘油酯，赤藓醇酐(EDE)，丁二醇二环氧甘油醚(GAB)，以及多官能环氧化物，如由Nagasi Chemicals，Osaka，Japan以商标Denacol出售的聚甘油聚缩水甘油醚。例如，Denacol 512每分子具有4个环氧化物，Denacol 521每分子具有5个环氧化物。如本文所用的，术语“聚环氧化物”是指每分子至少具有2个环氧基组分的反应性多官能环氧化物。
如本文所使用的，术语“多膦酸酯”包括每分子至少具有2个膦酸酯的化合物，这种多膦酸酯可以是市售的，也可以由本领域熟练技术人员合成。多膦酸酯的例子包括3-氨基-1-羟丙烷-1，1-二膦酸(APD)和乙羟基二膦酸酯(EHDP)。在一些实施方案中，优选的是其它的膦酸酯，如氨基甲基三膦酸和丁基戊膦酸。另外的例子包括但不限于己亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)和二亚乙基三胺戊(亚甲基膦酸)。然而，具有至少一种与环氧官能度反应的官能度的任何抗钙化剂均适用于本发明实践。其它含氨基抗钙化剂如磷酸柠檬酸酯的氨基衍生物也是合适的。另外的例子包括但不限于抗钙化剂的羟基或巯基衍生物。
在本发明的方法的一个方面中，通过将生物材料基质在高pH进行聚环氧化物预处理以在聚环氧化物和生物材料基质之间形成不可逆的共价键，交联并阻断钙化位点而使生物材料对体内钙化具有抗性。
在本发明的方法的另一个方面中，通过在生理pH，7.0-8.0，用环氧化物交联剂交联或固定组织而制备钙化抗性生物修复组织。一种催化体系能使生物修复组织在生理pH下在含水条件下进行聚环氧化物的交联，例如，已发现在聚环氧化物的水溶液中掺入叔胺或季胺催化剂可以产生钙化抗性组织。
在本发明的另一个方法实施方案中，在聚环氧化物保持过量的条件下形成了多官能抗钙化剂如多膦酸酯和聚环氧化物的单加成物。过量的环氧基交联组织并且单加成物的反应性环氧官能度附着于组织蛋白质的氨基基团，从而将含膦酸酯的加成物与组织永久地共价结合。
附图的简述描述
结合下述附图阅读下文中给出的详细说明将有利于理解本发明，附图中：
图1显示在按本发明方法处理的猪主动脉瓣样品在大鼠皮下植入21天后的钙含量(μg/mg)；
图2显示按本发明方法用高分子量聚环氧化物交联的猪主动瓣样品在大鼠皮下植入21天后的钙含量(μg/mg)；
图3显示猪主动脉瓣样品暴露于催化剂后的钙含量(μg/mg)；
图4显示在另一种催化剂的存在下猪主动脉瓣样品在暴露于高pH值(10-11)环氧化物交联剂后的钙含量(μg/mg)；
图5显示在由pH10或11环氧化物交联剂处理的猪主动脉瓣小叶样品的胶原变性温度(℃)；以及
图6显示在催化剂的存在下，在pH范围为6-12时，由聚环氧化物交联剂Denacol处理的猪主动脉瓣小叶样品的胶原变性温度(℃)。
发明的详细描述
给出下述几个按照本发明的原则生产钙化抗性生物材料的特定举例说明性技术。虽然所给出的实施例都是针对制备钙化抗性心瓣膜组分的，但本文所描述的技术也适用于产生其他任何包含用于内部留置或手术移植装置的生物材料的装置、修复物或移植物。I、用环氧化物交联生物修复组织
A、高pH方法
在本发明的一个方法实施方案中，将新鲜的生物修复组织在水溶性环氧化物交联剂的水溶液中于pH10或更高pH下保温一段足以不可逆交联和阻断钙化位点的时间。环氧化物交联剂可以是反应性多官能环氧化物或二环氧化物，其浓度优选为约0.01M-1.0M，更优选为0.05M-0.5M。溶液用本领域已知的任何方法，例如用0.5M硼酸钠缓冲至pH大于10，优选为pH10-11。
在优选实施方案中，保温时间在24小时和21天之间，典型地是7天，但是上述实施方案中保温时间的长短是举例性的，本领域熟练技术人员可以改变。然而应注意的是在所建议的7天时间里未观察到对生物修复组织有损坏作用。保温温度可以从约4℃-63℃，这样组织中的蛋白质不会变性。优选地，温度高于20℃，最优选在25-37℃。
生物修复物如猪主动脉瓣小叶或牛心包膜典型地在收获后于戊二醛中稳定和保存，例如在0.05HEPES缓冲液(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸，购自Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)中的0.2％戊二醛溶液。然后戊二醛保存的生物修复物可以储存在4℃一段时间。根据本发明的有利的实施方案，根据本发明的原则在环氧化物交联剂水溶液中保温的戊二醛预处理的生物修复组织显示出优异的钙化抗性。
在一个具体的实施方案中，猪主动脉瓣小叶在低分子量环氧化物的高pH(＞10，优选在pH10.5-11.5)溶液中于25℃稳定和保存7天以赋予稳定性并阻断钙化位点，所述的低分子量环氧化物优选为4-6个碳原子核心链长度，如0.1M丁二醇二环氧甘油醚。
B、生理pH方法
在本发明的另一个方法实施方案中，生物修复组织被暴露于缓冲至生理pH，即pH7.0-8.0，优选pH7.4的水溶性环氧化物交联剂水溶液中。该交联溶液含有叔胺或季胺，叔胺或季胺起“催化剂”的作用以使生物修复组织在含水条件下在生理pH值发生聚环氧化物交联，用于本发明实践的合适的叔胺或季胺包括但不限于三(羟甲基)氨基甲烷盐酸(Tris)，和咪唑。在一些实施方案中，催化剂还缓冲溶液。
环氧化物交联剂在水溶液中的浓度为0.005M-0.5M。催化剂浓度典型地为约0.01M，但可根据环氧化物交联剂的浓度而变化。其它反应条件，如时间和温度，是根据上述高pH实施方案。
在一具体的举例性实施方案中，一种聚环氧化物如0.1M Denacol 521用0.01M咪唑或Tris缓冲至pH7.4。将一生物修复组织样品在25℃暴露于该环氧化物溶液7天。II、用多膦酸酯：聚环氧化物单加成物交联和衍生化生物修复组织
根据本发明的一个有利的实施方案，生物修复组织可以用多膦酸酯：聚环氧化物单加成物同时进行交联和衍生化。多膦酸酯以至少1∶2、优选1∶10的摩尔比与纯聚环氧化物储液不掺水地结合，在这些条件下，优先形成多膦酸酯：聚环氧化物单加成物，并余下过量的未反应的聚环氧化物。含单加成物的混合物用水稀释至浓度为0.005M-0.5M，优选约0.1M。在一些实施方案中，含单加成物的混合物可以用上述催化性胺、Tris或咪唑缓冲至生理pH。
将新鲜或戊二醛预处理的生物修复组织暴露在稀释的含单加成物的混合物中足够一段时间以将多膦酸酯与生物修复组织交联并反应性结合。更具体地，仍含有过量未反应聚环氧化物的含单加成物的混合物是用未反应的聚环氧化物交联组织，而单加成物的反应性环氧官能团附着于组织的氨基基团以使含膦酸的加成物永久地与组织共价结合。
在本发明这一方面的一个举例性实施方案中，将1M APD加入到10M反应性聚环氧化物如GAB中，置放30分钟以形成单加成物。将该单加成物溶液用水稀释至0.1M并缓冲至pH为7.5-10。将新鲜的生物修复组织在25℃暴露于该稀释的单加成物溶液24小时至21天以使之交联和衍生化。
应注意的是给出的二膦酸盐(纯化的酸形式)的浓度范围仅是举例性的，并可由本领域熟练技术人员改变以优化结合和举例。另外，在上述实施方案中指定的温度和时间长短也是举例性的并可由本领域熟练技术人员改变。
另外，尽管由于有机溶剂对生物学为基的组织有损坏作用因此推荐使用生物修复组织的水溶液，但有机溶剂当然仍属于本发明范围。例如异丙醇和乙醇已安全用于生物修复组织。实验部分在大鼠皮下模型中的生物修复组织
屠宰成熟的牛后获得牛心包壁层形式的生物修复组织品并立即放入37℃、pH10和11的低分子量环氧化物二环氧甘油丁二醇酯(GAB)溶液和高分子量环氧化物Denacol521(DEN)溶液，放置7天。为比较起见，一些样品还在pH11的0.6％戊二醛中于37℃保温7天。
牛心包膜样品植入在断奶大鼠(雄性，CD，Sprague-Dawley，体重50-60g)腹壁中切开的两个皮下小袋中。一段时间后(21天和60天)，取出样品并测定组织中Ca+2离子水平以检查钙化程度。结果示于下表I。
                          表1环氧化物    pH  膦酸酯    移植时结合试剂    移植天数(天)    Ca2+(μg/mg)GAB         11    -             -                21         19.0±5.9GAB         11    -             -                60         23.4+10.6GAB         10    -             -                21         61.3+12.4DEN         11    -             -                60         107.8±12.7GLT         11    -             -                21         63.5+7.3GLT         11    -             -                60         109.4+14.6注：GAB＝二环氧甘油丁二醇酯DEN＝Denacol 521(聚缩水甘油醚-环氧戊烷)GLT＝戊二醛
表I显示于高pH下在低分子量环氧化物中处理的牛心包膜样品具有明显的抗钙化抑制作用。
将猪主动脉瓣小叶形式的生物修复组织样品在25℃暴露于pH为10和11的GAB和Denacol 521溶液中7天。其他样品在25℃暴露于pH10的含单加成物的APD∶GAB和APD∶Denacol(1M多膦酸酯∶10M聚环氧化物)的溶液中7天。
暴露于环氧化物交联剂后，洗掉小叶样品的交联溶液并植入在断奶大鼠腹壁中切开的两个皮下小袋中。21天后，取出样品并测定组织中Ca+2离子水平以检查钙化程度。结果示于图1，图1是代表钙含量的示意图，每种样品以μg/mg组织表示。示出未交联的组织(新鲜)以用于对比。
图2显示根据本发明的两种方法用高分子量聚环氧化物，Denacol 521交联的猪主动脉瓣样品的钙含量(μg/mg)。在第一种方法中，样品暴露于用咪唑缓冲至pH7.4的Denacol 521水溶液。在第二种方法中，戊二醛预处理的样品暴露于用咪唑缓冲至pH7.4的APD∶Denacol 521(1∶10)单加成物的水稀释液中。对照组样品是根据现有技术用戊二醛交联。为对比起见，戊二醛预处理的样品暴露于pH7.4的二膦酸，APD。如图2所示，植入大鼠皮下小袋21天后根据本发明方法处理的样品比对照组的钙含量低。
为证实环氧化物交联剂起钙化抗性作用，将戊二醛预处理的猪主动脉瓣小叶置入25℃的pH7.4的咪唑水溶液和用咪唑缓冲至pH7.4的Denacol 521水溶液中7天。戊二醛预处理的猪主动脉瓣组织包含对照。图3是外植21天时样品的钙含量(μg/mg)示意图。咪唑催化的Denacol溶液产生明显降低的钙含量。
图4是在0.1M Tris存在下猪主动脉瓣样品在25℃暴露于高pH值(10-11，用NaOH缓冲)的低分子量环氧化物(GAB)和高分子量环氧化物(Denacol)后的钙含量(μg/mg)示意图。当将图4的结果与图1和表I的结果相比时可以清楚地看出Tris催化的抑制效果。
图5示出根据本发明方法将猪主动脉瓣小叶用pH10或11的GAB或Denacol处理后的胶原变性温度或称皱缩温度Ts相当于用戊二醛处理得到的Ts。分别示出新鲜、未处理的小叶和戊二醛处理的对照组小叶的胶原变性温度以对比。
另外，通过使用0.01M Tris或咪唑利用生理pH的环氧化物交联剂可以获得相同满意效果的皱缩温度。图6示出了在25℃暴露于用NaOH缓冲至pH6-1 2的各种带有0.01M咪唑的0.1M Denacol水溶液中7天的猪主动脉瓣小叶的皱缩温度。戊二醛处理的组织的皱缩温度约为87℃。
虽然已在特定实施方案和应用方面描述了本发明，但本领域技术人员可基于这些教导在不超出本发明权利要求范围或背离本发明精神的前提下得出其他实施方案。因此，应明确的是，本文中给出的附图和文字描述旨在有利于理解本发明，而不构成对本发明范围的限制。

Claims (14)

1.用于活体内移植的生物学衍生生物材料，所述的生物材料在宿主体内基本上是不溶的并且其不可逆地结合有效量的环氧化物交联剂以稳定生物材料基质并阻断钙化位点，从而赋予所述的生物材料基质对体内病理性钙化的抗性。
2.权利要求1的生物材料，其中环氧化物交联剂是低分子量环氧化物，选自二环氧甘油丁二醇酯、乙二醇二环氧甘油酯、丁二醇二环氧甘油醚和4-6个碳原子的聚甘油聚缩水甘油醚。
3.权利要求2的生物材料，其中环氧化物交联剂是聚环氧化物。
4.权利要求1或3的生物材料，进一步包括聚环氧化物：多官能抗钙化剂的单加成物，该单加成物在生物学衍生的生物材料的与环氧官能团反应的位点与该生物材料共价结合，所述的抗钙化剂具有至少一种与环氧官能度反应的官能团。
5.权利要求1或4的生物材料，其中所述的生物学衍生的生物材料基质选自牛心包膜、猪心脏瓣膜小叶、隐静脉旁路移植物、主动脉同种移植物和硬脑膜。
6.处理生物修复组织的方法，包括将生物修复组织在pH大于10的环氧化物交联剂溶液中保温足够使生物修复组织交联的时间。
7.权利要求6的方法，其中环氧化物交联剂是低分子量环氧化物，选自二环氧甘油丁二醇酯、乙二醇二环氧甘油酯、丁二醇二环氧甘油醚和4-6个碳原子的聚甘油聚缩水甘油醚。
8.权利要求6的方法，其中足够使生物修复组织交联的时间为24小时至21天。
9.处理生物修复组织的方法，包括将生物修复组织在生理pH的环氧化物交联剂和催化剂溶液中保温足够使生物修复组织交联的时间。
10.权利要求9的方法，其中催化剂是叔胺或季胺。
11.权利要求9的方法，其中催化剂选自Tris和咪唑。
12.处理生物修复组织的方法，包括下述步骤：
(a)形成带有过量聚环氧化物的多官能抗钙化剂和聚环氧化物的单加成物；
(b)用水稀释所述的单加成物；以及
(c)将生物修复组织放入单加成物的稀释水溶液足够长时间以交联组织并用多膦酸酯抗钙化剂在生物材料的与环氧官能团反应的位点不可逆地衍生化生物修复组织。
13.权利要求12的处理生物修复组织的方法，其中多官能抗钙化剂具有至少一个与环氧官能度反应的官能团。
14.权利要求12的处理生物修复组织的方法，其中多官能抗钙化剂是多膦酸酯。
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