ES2705704T3 - Método de obtención de una composición rica en citocinas y composición obtenida mediante este método - Google Patents
Método de obtención de una composición rica en citocinas y composición obtenida mediante este método Download PDFInfo
- Publication number
- ES2705704T3 ES2705704T3 ES14798838T ES14798838T ES2705704T3 ES 2705704 T3 ES2705704 T3 ES 2705704T3 ES 14798838 T ES14798838 T ES 14798838T ES 14798838 T ES14798838 T ES 14798838T ES 2705704 T3 ES2705704 T3 ES 2705704T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- supernatant
- serum
- cytokines
- clot
- gravity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 title claims abstract description 152
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 title claims abstract description 152
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 145
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 124
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 163
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 148
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 88
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims abstract description 82
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 76
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims abstract description 62
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 30
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 15
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical group CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 121
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 120
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 120
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 120
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 57
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 54
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 45
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 45
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 claims description 43
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 36
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 claims description 32
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 25
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 24
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 24
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 19
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 18
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 13
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims description 10
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 claims description 4
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 93
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 75
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 66
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 57
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 57
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 50
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 46
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 41
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 24
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 23
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 19
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 19
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 18
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 17
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 13
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 13
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 13
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 12
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 12
- 239000000306 component Substances 0.000 description 12
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 12
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 11
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 11
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 11
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 11
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 11
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 10
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 10
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 9
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 9
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 9
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 9
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 9
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 8
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 7
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 7
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 7
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 7
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 7
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 6
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 6
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 6
- 206010023330 Keloid scar Diseases 0.000 description 6
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 6
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 5
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 5
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 5
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 5
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 5
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 5
- -1 antibodies Substances 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 5
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 5
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 4
- 101000980840 Homo sapiens CD166 antigen Proteins 0.000 description 4
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 4
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 4
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 4
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 4
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 4
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 4
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 4
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 4
- 210000000623 ulna Anatomy 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 4
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 3
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 2
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 101100534229 Caenorhabditis elegans src-2 gene Proteins 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 2
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 2
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002260 Keloid Diseases 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001621 Mucoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010093825 Mucoproteins Proteins 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 208000005764 Peripheral Arterial Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 2
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 2
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 2
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003563 calcium carbonate Drugs 0.000 description 2
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960002283 calcium glubionate Drugs 0.000 description 2
- YPCRNBPOUVJVMU-LCGAVOCYSA-L calcium glubionate Chemical compound [Ca+2].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O.[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YPCRNBPOUVJVMU-LCGAVOCYSA-L 0.000 description 2
- 239000004227 calcium gluconate Substances 0.000 description 2
- 229960004494 calcium gluconate Drugs 0.000 description 2
- 235000013927 calcium gluconate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940095643 calcium hydroxide Drugs 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L calcium;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C([O-])=O NEEHYRZPVYRGPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 230000006623 intrinsic pathway Effects 0.000 description 2
- 210000001117 keloid Anatomy 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 2
- 239000000565 sealant Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108010065972 tick anticoagulant peptide Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- ZDHBBBQAVLNJBL-BJKOFHAPSA-N (2r)-1-[(2s)-3-(4-carbamimidoylphenyl)-2-[(2-methyl-3,4-dihydro-1h-isoquinolin-7-yl)sulfonylamino]propanoyl]-4-methyl-3,6-dihydro-2h-pyridine-2-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](NS(=O)(=O)C1=CC=C2CCN(CC2=C1)C)C(=O)N1[C@H](CC(C)=CC1)C(O)=O)C1=CC=C(C(N)=N)C=C1 ZDHBBBQAVLNJBL-BJKOFHAPSA-N 0.000 description 1
- BISKEOIROPAOGY-RXQQAGQTSA-N (2s)-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]-1-[(2r)-2-(methylamino)-3-phenylpropanoyl]pyrrolidine-2-carboxamide;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C([C@@H](NC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C=O)C1=CC=CC=C1 BISKEOIROPAOGY-RXQQAGQTSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- CDPROXZBMHOBTQ-SJORKVTESA-N 2-[[(2r)-3-cyclohexyl-1-[(2s)-2-[3-(diaminomethylideneamino)propylcarbamoyl]piperidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]acetic acid Chemical compound NC(N)=NCCCNC(=O)[C@@H]1CCCCN1C(=O)[C@H](NCC(O)=O)CC1CCCCC1 CDPROXZBMHOBTQ-SJORKVTESA-N 0.000 description 1
- BYDKEYCXCIVOOV-JTSKRJEESA-N 2-[[(2s)-4-[[(3s)-1-carbamimidoylpiperidin-3-yl]methylamino]-2-(naphthalen-2-ylsulfonylamino)-4-oxobutanoyl]-cyclopropylamino]acetic acid Chemical compound C1N(C(=N)N)CCC[C@H]1CNC(=O)C[C@@H](C(=O)N(CC(O)=O)C1CC1)NS(=O)(=O)C1=CC=C(C=CC=C2)C2=C1 BYDKEYCXCIVOOV-JTSKRJEESA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- XBBVURRQGJPTHH-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyacetic acid;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound OCC(O)=O.CC(O)C(O)=O XBBVURRQGJPTHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBMULXNXJLWLLD-UHFFFAOYSA-N 4,5-bis(4-methoxyphenyl)-2-thiophen-2-yl-1h-imidazole Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(C=2C=CC(OC)=CC=2)NC(C=2SC=CC=2)=N1 XBMULXNXJLWLLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 229920001634 Copolyester Polymers 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- AFSDNFLWKVMVRB-UHFFFAOYSA-N Ellagic acid Chemical compound OC1=C(O)C(OC2=O)=C3C4=C2C=C(O)C(O)=C4OC(=O)C3=C1 AFSDNFLWKVMVRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATJXMQHAMYVHRX-CPCISQLKSA-N Ellagic acid Natural products OC1=C(O)[C@H]2OC(=O)c3cc(O)c(O)c4OC(=O)C(=C1)[C@H]2c34 ATJXMQHAMYVHRX-CPCISQLKSA-N 0.000 description 1
- 229920002079 Ellagic acid Polymers 0.000 description 1
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100028471 Eosinophil peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 229940121854 Factor VII inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 1
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 1
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 108010090290 Growth Differentiation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100040892 Growth/differentiation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101000990912 Homo sapiens Matrilysin Proteins 0.000 description 1
- 101000974356 Homo sapiens Nuclear receptor coactivator 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000582950 Homo sapiens Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101710186630 Insulin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000009065 Netrin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010074223 Netrin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 102100022883 Nuclear receptor coactivator 3 Human genes 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030304 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000000491 Tendinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010043255 Tendonitis Diseases 0.000 description 1
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000008578 acute process Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 229940061720 alpha hydroxy acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001280 alpha hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940090880 ardeparin Drugs 0.000 description 1
- 229960003856 argatroban Drugs 0.000 description 1
- KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N argatroban Chemical compound OC(=O)[C@H]1C[C@H](C)CCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NS(=O)(=O)C1=CC=CC2=C1NC[C@H](C)C2 KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003462 bioceramic Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N bivalirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N 0.000 description 1
- 108010055460 bivalirudin Proteins 0.000 description 1
- 229960001500 bivalirudin Drugs 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;molecular oxygen Chemical compound O=O.O=C=O UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000006790 cellular biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229940107792 certoparin Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000008576 chronic process Effects 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 230000008473 connective tissue growth Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NLCKLZIHJQEMCU-UHFFFAOYSA-N cyano prop-2-enoate Chemical class C=CC(=O)OC#N NLCKLZIHJQEMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000010889 donnan-equilibrium Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000004728 ear cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 108010078659 efegatran Proteins 0.000 description 1
- 229950009814 efegatran Drugs 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 229960002852 ellagic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000004132 ellagic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- LEUOKLJWUZRRGH-SFHVURJKSA-N ethyl (2S)-3-(4-carboxyoxyphenyl)-2-[3-(4-hydroxyphenyl)propanoylamino]propanoate Chemical compound C(C)OC([C@@H](NC(CCC1=CC=C(C=C1)O)=O)CC1=CC=C(C=C1)OC(O)=O)=O LEUOKLJWUZRRGH-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- KANJSNBRCNMZMV-ABRZTLGGSA-N fondaparinux Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NS(O)(=O)=O)[C@@H](OC)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O4)NS(O)(=O)=O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O2)NS(O)(=O)=O)[C@H](C(O)=O)O1 KANJSNBRCNMZMV-ABRZTLGGSA-N 0.000 description 1
- 229960001318 fondaparinux Drugs 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000000025 haemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 108091008044 human SRC Proteins 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229950003291 inogatran Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000003137 locomotive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- DKWNMCUOEDMMIN-PKOBYXMFSA-N melagatran Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1CNC(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H](NCC(O)=O)C2CCCCC2)CC1 DKWNMCUOEDMMIN-PKOBYXMFSA-N 0.000 description 1
- 229960002137 melagatran Drugs 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003061 melanogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- FAARLWTXUUQFSN-UHFFFAOYSA-N methylellagic acid Natural products O1C(=O)C2=CC(O)=C(O)C3=C2C2=C1C(OC)=C(O)C=C2C(=O)O3 FAARLWTXUUQFSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 229960000899 nadroparin Drugs 0.000 description 1
- 229950005835 napsagatran Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000948 non-nucleated cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 239000000082 organ preservation Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 229960004762 parnaparin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940043138 pentosan polysulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036513 peripheral conductance Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 230000018127 platelet degranulation Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000327 preparative centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 239000001054 red pigment Substances 0.000 description 1
- 208000015670 renal artery disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 229960005496 reviparin Drugs 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000003189 scaphoid bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 1
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 208000023516 stroke disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229940030990 tachosil Drugs 0.000 description 1
- 201000004415 tendinitis Diseases 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N thromboxane A2 Chemical compound OC(=O)CCC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)O[C@@H]2O[C@H]1C2 DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940078499 tricalcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 1
- ZXIBCJHYVWYIKI-PZJWPPBQSA-N ximelagatran Chemical compound C1([C@@H](NCC(=O)OCC)C(=O)N2[C@@H](CC2)C(=O)NCC=2C=CC(=CC=2)C(\N)=N\O)CCCCC1 ZXIBCJHYVWYIKI-PZJWPPBQSA-N 0.000 description 1
- 229960001522 ximelagatran Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un método de preparación de un suero que comprende citocinas y factores de coagulación, método que comprende las siguientes etapas: (a) someter una muestra biológica aislada que comprende plaquetas y/o leucocitos a una fuerza de la gravedad comprendida entre 100 y 200 g, obteniéndose un primer coágulo y un sobrenadante; (b) someter solo el coágulo o, como alternativa, el coágulo y el sobrenadante de la etapa (a) a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 2.500 g, obteniéndose un sobrenadante SN1; en el que la fuerza de la gravedad se aplica de manera discontinua y se lleva a cabo por medio de: (i) la centrifugación del coágulo de la etapa (a), o como alternativa, del coágulo y del sobrenadante, a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 500 g; (ii) la recuperación del sobrenadante de la etapa (i), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1ii; (iii) la centrifugación del coágulo restante a una fuerza de la gravedad comprendida entre 1.500 y 2.500 g y la recuperación del sobrenadante de la etapa (iii), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1iii de la etapa (b), constituyendo los sobrenadantes de las etapas (ii) e (iii) el sobrenadante completo SN1; y (c) la recuperación de dicho sobrenadante SN1 de la etapa (b), que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación, en la que la fuerza de la gravedad se aplica mediante un proceso seleccionado del grupo que consiste en centrifugación y succión física.
Description
DESCRIPCIÓN
Método de obtención de una composición rica en citocinas y composición obtenida mediante este método
La presente invención se refiere a un método o a métodos para obtener un suero rico en citocinas y/o factores de crecimiento (incluyendo otros mediadores biológicos), así como aquellos sueros que tienen utilidad para tratar afecciones patológicas causadas por traumatismo, isquemia, inflamación y degeneración en general, y para la reparación y regeneración de tejidos, en particular. Por lo tanto, la invención podría enmarcarse en el campo de la Biomedicina.
Técnica anterior
Muchos animales adultos son capaces de regenerar estructuras corporales complejas tras la lesión tisular, y entre los vertebrados, se sabe que los anfibios tienen una mayor capacidad para responder a estos procesos regenerativos en comparación con los mamíferos, en los que la regeneración parece estar significativamente reducida.
La reparación y la regeneración de la totalidad o de parte de los órganos y tejidos es un proceso común que se produce en respuesta a múltiples patologías tales como traumatismo, isquemia, inflamación aguda y crónica, y procesos degenerativos. La reparación y la regeneración del tejido dañado es un proceso biológico complejo que, inicialmente, depende de la activación, señalización y movilización de células por medio de múltiples moléculas interrelacionadas, secuenciales y/o paralelas, mediadores y otros factores de señalización o inducción. Aunque se ha avanzado en el estudio de los mecanismos moleculares y las vías de señalización que regulan los procesos de regeneración, aún no se sabe con exactitud por qué algunos tejidos y órganos se regeneran correctamente mientras que otros no lo hacen.
Aunque el conocimiento de las vías de señalización que controlan los diferentes procesos regenerativos sigue siendo incompleto, es evidente que hay una superposición significativa en las vías implicadas. Sin embargo, es probable que la función precisa de las señales en los diferentes sistemas de regeneración sea tan diversa como los eventos celulares que se producen. Sin duda, la investigación futura no solo aumentará la lista de nuevos elementos implicados, sino que también revelará diferencias en su función en otros sistemas diferentes.
Dependiendo de factores inherentes a los propios procesos patológicos, la actividad de reparación y de regeneración puede no ser optima. De hecho, en la mayoría de los casos no lo es. Los ejemplos son zonas con cicatrices o fibrosis conocidas como procesos que se produce tras un traumatismo, isquemia, inflamación y degeneración. En este contexto, los tratamientos no solo han dirigido sus esfuerzos a la prevención y al tratamiento de las causas, sino también a potenciar y facilitar la curación (reparación y regeneración de tejido u órgano dañado) intentando reducir al mínimo los efectos negativos de una reparación o regeneración subóptimas. Entre otros productos biológicos, los tratamientos actuales incluyen diversas hormonas, esteroides, HG, EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-2, IL-3 y BMP, usados actualmente en trasplantes de órganos y tejidos, y en medicina regenerativa para recuperar tejidos lesionados o dañados.
La sangre periférica participa plenamente en cualquier proceso hemostático, inflamatorio, reparador y regenerativo. Las células de la sangre periférica (incluyendo los eritrocitos, pero principalmente las plaquetas y los leucocitos) tienen un papel central en la actividad regenerativa y reparadora. Las plaquetas desempeñan un papel primordial en la lesión por hemostasia. Las plaquetas se comportan también con una actividad elevada en el inicio de los ciclos de reparación y regeneración, mediante la síntesis y liberación de moléculas una vez que se produce la fibrinólisis. Estas moléculas, a su vez, activan otras células tales como los leucocitos, creando sucesivas funciones biológicas ("ciclo regenerativo") diseñadas para reparar y regenerar el tejido dañado.
Con el objetivo de potenciar la regeneración de los tejidos, así como de controlar la hemostasia y los procesos inflamatorios, se han empleado productos sanguíneos genéricamente definidos como sangre o derivados de la sangre. Los ejemplos de estos productos incluyen plasma sanguíneo, suero sanguíneo, concentrado de leucocitos, células mononucleares o geles de fibrina ricos en plaquetas (FRP). Entre estos, el plasma conocido como Plasma Rico en Plaquetas (PRP) se ha usado ampliamente desde que se hicieron evidentes algunas mejoras en las condiciones postoperatorias y en la inflamación y el dolor asociados con ciertos procesos agudos y crónicos. No obstante, se han demostrado efectos terapéuticos significativamente deficientes.
Muchas razones pueden influir en la baja respuesta terapéutica del PRP, tales como su preparación, la dosis empleada, la formulación, el sitio de aplicación, el momento de la administración, los componentes celulares contenidos en el PRP, el grado de activación de las respuestas biológicas asociadas a los mecanismos de coagulación y al proceso inflamatorio, así como el estado de salud y el identificador genético del donante y del receptor.
En el documento US 20050252867, se desvelan ejemplos de PRP y métodos de preparación. Este documento
desvela diferentes métodos para obtener PRP a partir de sangre que contiene anticoagulantes. En el documento US20050252867, la sangre anticoagulada se centrifuga para obtenerse el PRP. Se deja que parte de este PRP se coagule para obtenerse un suero que comprende trombina, que se usa como aditivo del PRP previamente obtenido. En varios casos, estos derivados de la sangre se preparan in situ a partir de la sangre del sujeto que se está tratando, por ejemplo, en un quirófano. Esto implica que la sangre extraída debe manejarse lo más rápido posible. No obstante, muchos de los procesos para obtener derivados de la sangre implican largos tiempos de procesamiento, lo que significa que, en caso de necesitarse en una intervención quirúrgica programada, la sangre del sujeto debe extraerse y tratarse para la obtención del derivado con tiempo suficiente. Como es evidente, esto no puede ser posible si el sujeto está siendo tratado en una sala de urgencias.
Por otro lado, una obtención rápida del derivado de la sangre (PRP, FRP, etc.) da lugar a productos que pueden no contener todas las moléculas ni cantidades eficaces de las mismas. Por lo tanto, el tratamiento con estos preparados de sangre, a veces, no es tan eficaz como se desea o se espera.
Otros derivados de la sangre que se están estudiando con el fin de inducir también la regeneración tisular o la potenciación de la curación de enfermedades son los sueros sanguíneos. Un ejemplo de estos puede ser el suero rico en citocinas desvelado por Isogai et al. en “Cytokine-Rich Autologous Serum System for Cartilaginous Tissue Engineering”, Annals of Plastic Surgery - 2008, Vol. n.º 60, pág.: 703-709.
Isogai et al. desvelan un método para obtener un suero útil en el proceso de regeneración del tejido cartilaginoso, e ilustran cómo se puede reconstruir o regenerar un cartílago auricular canino. El suero rico en citocinas se obtiene extrayendo sangre de los perros, mezclando toda la sangre en una bolsa que contiene perlas de vidrio y agitando Mezclar a 30 rpm/min durante 1 hora. Las plaquetas de la sangre se adhieren a las proteínas plasmáticas adsorbidas como el fibrinógeno y la fibronectina dispuestos en las perlas de vidrio, y la rotación aplicada causa la estimulación inducida por cizalla y la activación de las plaquetas. La sangre activada se centrifuga luego a 3.000 rpm, obteniéndose un precipitado que contiene fibrina con perlas, y sobrenadante que es un suero autólogo rico en citocinas.
Una desventaja asociada con el método de Isogai et al. es que la presencia, por ejemplo, de perlas de vidrio aumenta el riesgo de activar las células inmunitarias presentes en la sangre tratada. Esta activación puede conducir a la desregulación del sistema inmunitario del receptor una vez que se administra finalmente el derivado de la sangre, ya que este derivado puede contener en varias proporciones, aquellos componentes que informan al sistema inmunitario del receptor que también debe activarse. Una activación aberrante o no adecuada del sistema inmunitario implica el riesgo de reacciones alérgicas o incluso el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Además, la preparación del suero rico en citocinas de Isogai et al. implica la realización de etapas técnicamente complejas que alargan el proceso de obtención del suero y lo hacen no aplicable in situ, por ejemplo, en el quirófano.
Por último, otros derivados de la sangre propuestos como sellantes o como agentes tisulares regenerativos son las denominadas fibrinas ricas en plaquetas (FRP). La FRP se forma cuando la sangre completa extraída sin anticoagulante se deja coagular al mismo tiempo que se centrifuga. Se separan tres fases: (1) una capa de glóbulos rojos coagulados; (2) un gel rígido y elástico de FRP, que una vez exprimido permite obtener una membrana de fibrina para aplicaciones clínicas; y (3) un suero líquido sobrenadante, que, en general, se desecha. Algunos documentos desvelan que la parte liberada (el líquido) de esta fracción de FRP contiene factores de crecimiento que aumentan ligeramente durante un período comprendido entre 1 y 2 horas tras la extracción de la sangre completa. Su et al. en "In vitro release of growth factors from platelet-rich fibrin (PRF): a proposal to optimize the clinical applications of PRF", Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral radiol Endod - 2009, n.º de vol 108, pág.: 56-61 proponen un ejemplo de esto. Su et al. sugieren el uso de FRP en el transcurso de la primera hora después de su obtención y sin desechar la fracción liberada, ya que observaron que se podrían liberar factores de crecimiento durante este período de tiempo de la FRP nueva. El documento propone entonces usar la FRP, así como la fracción liberada en aplicaciones terapéuticas.
Otro punto crítico en la regeneración tisular por medio de derivados de la sangre, en especial cuando se usan coágulos de fibrina (FRP) o geles de fibrina es el tiempo y el método de administración de estos productos. En cirugía, por ejemplo, se aplican coágulos o geles de fibrina en la zona dañada cuando ya se ha iniciado el proceso de formación del tapón hemostático primario o local de plaquetas. Esto le da un efecto sellante debido a la adhesión a los tejidos (vasculares y conjuntivos) de la zona afectada. Sin embargo, la señalización a otras células está restringida, tiene un efecto paracrino local y, a veces, ineficacia terapéutica.
Por lo tanto, aunque se dispone de varios derivados de la sangre para su administración a sujetos en necesidad de reparación o regeneración tisular, o en necesidad de composiciones sellantes en quirófanos, es necesario diseñar uno o más productos, fáciles y rápidos de obtener, y que contengan altas cantidades de citocinas eficaces y de otros factores de crecimiento, encontrados de manera natural en procesos reparadores y regenerativos.
Sumario de la invención
Los inventores determinaron que usando sangre completa aislada u otras muestras biológicas que contengan plaquetas y/o leucocitos, e induciendo la formación de coágulos, el coágulo se podría entonces someter a un esfuerzo por medio de un método que diera lugar a sueros muy enriquecidos en citocinas y en otros factores de crecimiento, así como que comprendieran factores de coagulación. El método de obtención de los sueros incluye una primera activación suave de las plaquetas y/o los leucocitos contenidos en el coágulo, y etapas adicionales, en las que se induce una fuerte activación de las plaquetas y/o los leucocitos, dicha fuerte activación se realiza, en particular, por medio de al menos dos etapas de activación adicionales o una etapa adicional con un aumento de la fuerza de gravedad a lo largo del tiempo.
La invención es como se define en las reivindicaciones.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método para preparar un suero rico en citocinas, o lo que es el mismo, un suero que comprende citocinas y factores de coagulación, método que comprende las siguientes etapas:
(a) someter una muestra biológica aislada que comprende plaquetas y/o leucocitos a una fuerza de la gravedad comprendida entre 100 y 200 g, obteniéndose un coágulo y un sobrenadante;
(b) someter solo el coágulo o, como alternativa, el coágulo y el sobrenadante de la etapa (a) a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 2.500 g, obteniéndose un sobrenadante SN1; en el que la fuerza de la gravedad se aplica de manera discontinua y se lleva a cabo por medio de:
(i) la centrifugación del coágulo de la etapa (a), o como alternativa, del coágulo y del sobrenadante, a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 500 g;
(ii) la recuperación del sobrenadante de la etapa (i), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1ii; (iii) la centrifugación del coágulo restante a una fuerza de la gravedad comprendida entre 1.500 y 2.500 g y la recuperación del sobrenadante de la etapa (iii), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1iii de la etapa (b), constituyendo los sobrenadantes de las etapas (ii) e (iii) el sobrenadante completo SN1; y
(c) la recuperación de dicho sobrenadante SN1 de la etapa (b), que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación,
en la que la fuerza de la gravedad se aplica mediante un proceso seleccionado del grupo que consiste en centrifugación y succión física.
Con este método, la activación de las plaquetas y/o de los leucocitos se consigue debido al hecho de que la fuerza de la gravedad pone cada célula en contacto entre sí, permitiendo así iniciar los procesos de señalización entre ellas. Además, la alta fuerza de la gravedad potencia la ruptura de las células y la liberación del contenido en sus gránulos. La fuerza de la gravedad es la causa principal del proceso, y se puede aplicar a la muestra biológica mediante varios medios y, en particular, mediante centrifugación. De hecho, se puede llevar a cabo cada una de las etapas (a) y (b) para separar las células de la muestra biológica, para activar la cascada de coagulación y para romper la red de fibrina (causando fibrinólisis). Las diferentes fuerzas de la gravedad aplicadas en cada etapa, permiten obtener diferentes citocinas y factores de crecimiento a lo largo del tiempo.
Como se ilustrará en los siguientes ejemplos, el patrón de fuerza de gravedad aplicada, con las diversas realizaciones o versiones incluidas en el presente documento, permite una potente activación final de las plaquetas y/o de los leucocitos que tiene la ventaja de proporcionar sueros con altos niveles de citocinas y factores de crecimiento. Ventajosamente, estos altos niveles de citocinas y factores de crecimiento en los sueros se obtienen en ausencia de cualquier activador de plaquetas de la fase de contacto de coagulación artificial (tales como vidrio, perlas de vidrio, caolín y ácido elágico).
De acuerdo con el conocimiento de los inventores, esta es la primera vez que se está definiendo un sistema en el que la fibrinólisis es realizada por la fuerza de la gravedad (mediante medios físicos). Otros enfoques de la técnica anterior incluyen el uso de medios químicos o bioquímicos.
A lo largo de la presente descripción, la fuerza de la gravedad se aplica, en particular, por medio de centrifugaciones. Sin embargo, la invención también engloba otros medios físicos o químicos equivalentes (tales como la succión física o el contacto con colágeno) que conducen al mismo efecto, en concreto, a la activación de las células.
Como se ha anunciado anteriormente, las etapas y la secuencia de etapas del método propuesto de la invención conduce inesperadamente a un suero con altas concentraciones de citocinas. Este suero es capaz de potenciar la reparación tisular en mayor grado que otros derivados de la sangre. Además, el método de obtención de los sueros se puede realizar rápidamente, si es necesario, sin comprometer la calidad ni el efecto de los sueros. Por lo tanto, el método de producción de estos sueros se puede realizar en quirófano o mientras que el sujeto está siendo tratado con otros medios. De esta manera, el método permite la obtención de un suero autólogo rico en citocinas (o suero
que comprende citocinas y factores de coagulación). El suero es muy eficaz en términos de tratamiento, ya que contiene concentraciones más altas de citocinas y de otras moléculas que las producidas en fenómenos naturales cuando, por ejemplo, se activan la cascada de coagulación y otros procesos.
Por lo tanto, como se muestra en los siguientes ejemplos, el método de la invención proporciona sueros y otros derivados de la sangre con concentraciones más altas de citocinas y de otros mediadores biológicos que los presentes en la muestra inicial. Con estos sueros, se obtiene además una mayor respuesta celular. Los datos mostrados en las Tablas 1 y 2, y en las FIG. muestran que la concentración de ciertas citocinas aumenta e incluso que aparecen nuevas citocinas, factores de crecimiento y otros mediadores biológicos de la respuesta celular. Entre las citocinas (incluyendo los factores de crecimiento) que experimentaron un aumento significativo cuando se aplica el método de la invención, se encuentran, por ejemplo, el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β1), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), interleucina 10 (IL-10), factor de crecimiento derivado P (PDGF), Factor VII, factor de von Willebrand. Todos alcanzan niveles con un valioso potencial terapéutico. La presencia de todas estas moléculas es el resultado de la activación y señalización de las células en el coágulo, dicha activación potenciada por el método de la invención.
La preparación de los sueros de la presente invención en condiciones "ex vivo" se lleva a cabo en un entorno que no comprende los factores condicionantes de un comportamiento "in vivo". Esto potencia la activación de la síntesis y de la liberación de múltiples proteínas y otras moléculas, que alcanzan altas concentraciones y que, a su vez, permiten una mayor activación "ex vivo» de las células. Por otra parte, esta alta concentración de las moléculas deseadas permite que, cuando se administra el suero a un sujeto, esas poblaciones de células "in vivo" se activan en el sitio de administración. Incluso por medio de una señalización biológica mejorada, se puede realizar la activación y reclutarse células muy relacionadas.
Por otra parte, gracias a la velocidad a la que se puede realizar el método, el suero (que puede ser autólogo o alogénico) incluye aquellas citocinas y aquellos factores de coagulación de corta vida útil, pero de gran interés para el objetivo terapéutico.
Por lo tanto, el objetivo final de la presente invención es proporcionar un nuevo método para conseguir diferentes tipos de suero y otros derivados cuyas características y contenidos iniciales desencadenan y/o modulan una respuesta biológica. y de ese modo, ejercen un papel terapéutico en el ciclo de reparación y regeneración de los tejidos.
En resumen, el método de la invención permite producir factores biológicos regeneradores e inductores (citocinas, tales como interleucinas, factores de crecimiento, etc.) a partir de muestras aisladas de un sujeto a través de métodos físicos y/o bioquímicos "ex vivo". Todas estas moléculas se pueden volver a administrar por vía tópica o sistémica de una manera alogénica o autóloga. Es especialmente ventajoso usar el suero obtenido mediante el método de forma autóloga, reduciendo así al mínimo los posibles efectos secundarios, tales como las reacciones de rechazo o inflamatorias.
Otro aspecto de la invención es, por tanto, un suero que comprende citocinas y factores de coagulación que se pueden obtener mediante el método desvelado anteriormente.
Este suero comprende concentraciones significativas de citocinas (incluyendo factores de crecimiento) y los factores de coagulación seleccionados del grupo que consiste en:
- el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β1), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 30,0 ng/ml y 50,0 ng/ml;
- el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 3,0 ng/ml y 6,0 ng/ml;
- el factor de crecimiento epidérmico (EGF), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 65,0 pg/ml y 80,0 pg/ml;
- el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 65,0 pg/ml y 80,0 pg/ml;
- interleucina 10 (IL-10), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 5,0 pg/ml y 10,0 pg/ml; - factor de crecimiento derivado P (PDGF), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 35,0 ng/ml y 45,0 ng/ml;
- Factor VII, cuya concentración en el suero final está comprendida entre 170,0 U/dl y 250,0 U/dl, significando U unidades enzimáticas;
- factor de von Willebrand, cuya concentración en el suero final está comprendida entre 100,0 U/dl y 150,0 U/dl; y mezclas de los mismos.
El suero es capaz de inducir la proliferación de células de médula ósea de manera que, a partir de un cultivo de células de médula ósea sembradas en una placa de Petri con una densidad comprendida entre 150 células/cm2 y
250 células/cm2, mediante la adición del suero en un porcentaje en peso comprendido entre el 10 % y el 30 % en el cultivo final, la cantidad de células hematopoyéticas identificadas por el marcador de membrana CD34 está comprendida entre 1,0 x 106 y 1,5 x 106 medida 15 días después del contacto de las células de la médula ósea con el suero. El medio de cultivo complementado con una cantidad de suero comprendida entre el 10 % y el 30 % p/p puede ser cualquiera de los conocidos por el experto en la materia, en el que puedan crecer las células de la médula ósea. Un ejemplo es un medio modificado de Dulbecco que comprende glucosa y que tiene L-glutamina 4 mM y 0,05 unidades de penicilina y 0,05 g de estreptomicina.
Las ventajas de este suero se han mencionado anteriormente mientras se definía el método de la invención. Se ha de destacar que los sueros también son concebibles como sueros autólogos que se pueden obtener en condiciones "ex vivo", en otras palabras, de una muestra aislada de un sujeto, que luego se procesa, obteniéndose finalmente una composición con citocinas y de factores de coagulación que pueden administrarse al mismo sujeto.
También forma parte de la invención un proceso para preparar una composición de gel de fibrina que comprende plaquetas y/o leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, comprendiendo dicho gel también un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuesto entre la matriz de fibrina, pudiéndose obtener dicho gel de fibrina mediante el proceso desvelado anteriormente para la preparación de un suero que comprende citocinas y factores de coagulación, y que además comprende mezclar el sobrenadante SN1 de la etapa (c) con una composición que comprenda fibrinógeno, plaquetas y/o leucocitos seleccionados del grupo que consiste en un plasma rico en plaquetas, un concentrado de plaquetas, un plasma rico en leucocitos, un concentrado de leucocitos, un plasma pobre en plaquetas, un concentrado de plasma y mezclas o combinaciones de los mismos; y añadir a la mezcla de la etapa anterior una fuente de calcio iónico para ajustar el calcio iónico a una concentración final de 1,0 µmol/ml a 50,0 µmol/ml, obteniéndose un segundo coágulo, que es una composición de gel de fibrina que comprende plaquetas y/o leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, comprendiendo dicho gel también un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuesto entre la matriz de fibrina.
También forma parte de la invención una composición de gel de fibrina que comprende plaquetas y/o leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, comprendiendo dicho gel también un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuesto entre la matriz de fibrina que se puede obtener mediante el proceso desvelado anteriormente.
También es otra parte de la invención un proceso para preparar otro suero que comprende citocinas y factores de coagulación, también denominado a lo largo de la presente descripción sobrenadante SN2, pudiéndose obtener dicho suero mediante el proceso desvelado anteriormente para la preparación de una composición de gel de fibrina; y además someter este gel de fibrina a medios físicos y/o químicos y/o bioquímicos para romper la matriz de fibrina mediante estos medios, obteniéndose un sobrenadante SN2; y recuperar el sobrenadante SN2, que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación.
Por lo tanto, también forma parte de la invención un sobrenadante SN2, que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación que puede obtenerse mediante el proceso desvelado anteriormente.
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica, que comprende cualquiera de los sueros definidos anteriormente o la composición de gel de fibrina como se ha definido anteriormente, o mezclas de los mismos, junto con cantidades apropiadas de excipientes y/o vehículos farmacéuticos aceptables.
También es un aspecto de la invención cualquiera de los sueros que comprenden citocinas y factores de coagulación según lo definido anteriormente, o como alternativa, una composición de gel de fibrina como se ha definido anteriormente o, como alternativa, una composición farmacéutica según lo definido anteriormente para su uso como un medicamento.
Por lo tanto, aunque la presente invención desvela métodos de tratamiento en los que los sueros de la invención, o como alternativa, la composición de gel de fibrina o las composiciones farmacéuticas según lo definido anteriormente se aplican a un sujeto que lo necesita, estos no se reivindican.
La invención también engloba, como un aspecto, una composición líquida para la perfusión en órganos ex vivo que comprende como ingrediente cualquiera de los sueros definidos anteriormente o, como alternativa, las composiciones farmacéuticas definidas anteriormente o mezclas de los mismos.
Otro aspecto de la invención es cualquiera de los sueros definidos anteriormente o una composición de gel de fibrina según lo definido anteriormente, o una composición farmacéutica definida anteriormente o mezclas de los mismos, para su uso como un agente de proliferación celular y/o de diferenciación celular in vitro y/o ex vivo y/o in vivo. Esto significa que los sueros, la composición de gel de fibrina o las composiciones farmacéuticas que los comprenden son para usar como un agente que respalda el proceso de regeneración tisular.
En otro aspecto, la invención también se refiere a los sueros definidos anteriormente o una composición de gel de
fibrina según lo definido anteriormente, o una composición farmacéutica definida anteriormente o mezclas de los mismos, para su uso como agentes inductores de la síntesis celular de citocinas in vitro, y/o ex vivo y/o in vivo. Esto significa que se potencia, se inicia o se mejora la síntesis celular de citocinas.
Todos estos efectos de los sueros, o de la composición de gel de fibrina, realizados en células de diferentes tipos (otras plaquetas, leucocitos, Fibroblastos, etc.) tienen el objetivo de obtener composiciones con una mayor capacidad de tratamiento. Por ejemplo, si se induce la síntesis de citocinas, a composición ex vivo o el entorno in vivo son equivalentes a una situación en la que el sistema natural de reparación corporal fue altamente incentivado, estimulado o activado. Esto permite un proceso de curación mejor y más rápido que el natural. Esto es especialmente ventajoso para los sujetos cuyo sistema que incluye los componentes comprendidos en los sueros o en las composiciones de la invención (citocinas y factores de coagulación) está comprometido (es decir, sujetos inmunodeficientes, sujetos con hemofilia, etc.).
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un diagrama de barras que muestra en el eje Y las cantidades (pg/ml) de TGF-β, IGF-1 y HGF y PDGFAA en diferentes muestras (S) enumeradas en el eje X. La expresión "fracción liberada" se describe como el líquido o el resultado de activación de plaquetas obtenidas con cloruro de calcio y la formación de degradación de coágulos. PRP: plasma rico en plaquetas; SRC: suero rico en citocinas; PRL: plasma rico en leucocitos; cPLT: concentrado de plaquetas.
La FIG.2 es otro diagrama de barras que muestra, en el eje Y, las cantidades de EGF y VEGF de las diferentes muestras (S) enumeradas en el eje X. La expresión "fracción liberada" se describe como el líquido o el sobrenadante resultante de la activación de plaquetas obtenidas con cloruro de calcio y la formación de degradación de coágulos. PRP: plasma rico en plaquetas; SRC: suero rico en citocinas; PRL: plasma rico en leucocitos; cPLT: concentrado de plaquetas.
La FIG. 3 muestra las cantidades (pg/ml) en el eje Y de TNF-alfa, IL-10 e IL-1β en las diferentes muestras (S) enumeradas en el eje X. Las abreviaturas y la expresión "fracción liberada" tienen el mismo significado que el indicado para las FIG.1 y 2.
La FIG.4 muestra las cantidades (pg/ml) en el eje Y de IL-6, IL-8, BMP-9 y FGF en las diferentes muestras (S) enumeradas en el eje X. Las abreviaturas y la expresión "fracción liberada" tienen el mismo significado que el indicado para las FIG.1 y 2.
La FIG. 5 muestra las cantidades (pg/ml) en el eje Y de fibrinógeno, trombina, Factor VII y Factor de von Willebrand en las diferentes muestras (S) enumeradas en el eje X. Las abreviaturas y la expresión "fracción liberada" tienen el mismo significado que el indicado para las FIG.1 y 2.
La FIG.6 es un gráfico que representa el número de células de la médula ósea (eje Y, número de células; NC) en diversos momentos (T en días, d) creciendo con un medio basal complementado con suero de ternera fetal (FCS o suero de ternera fetal) o complementado con diferentes concentraciones ((10, 20, 50 y 80 % p/p) de un suero rico en citocinas, SRC2, de la invención. El panel (A) muestra el número de células a lo largo del tiempo en las diferentes condiciones analizadas (% diferente del suero de la invención). En el Panel (B), se muestra la duplicación acumulada de células (CDC) en contacto con los diferentes medios.
La FIG. 7 muestra diferentes imágenes de microscopio electrónico (x100) de las células de la médula ósea cultivadas como se indica en la FIG.6; células en medio basal complementado con suero de ternera fetal (FCS) o con diversas concentraciones de SRC 2 (10 %, 20 %, 50 % y 80 %). La morfología celular se mantiene en todos los ensayos. Las cantidades crecientes de SRC2 aumentan el número total de células por campo (densidad celular).
La FIG.8 es un diagrama con el análisis fenotípico de las células de la médula ósea sometidas a las condiciones indicadas en las FIG. 6 y 7, es decir, crecimiento en un medio suplementado con FCS o con diferentes concentraciones de SRC 2 (10 %, 20 %, 50 % y 80 %). El fenotipo se determina por los niveles de expresión de varios antígenos de membrana o marcadores para cada una de las condiciones ensayadas (eje X). El eje Y muestra el número de células de cada tipo. CD45: marcador de leucocitos; marcador hematopoyético CD34, marcador de linaje mesenquimal CD90, marcador de linaje estromal CD166; marcador del linaje endotelial CD105.
La FIG. 9 representa la evolución cinética de las diferentes poblaciones celulares en cultivos de células de médula ósea a lo largo del tiempo (eje X, T en días (d)). CD45: marcador de leucocitos; marcador hematopoyético CD34, marcador de linaje mesenquimal CD90, marcador de linaje estromal CD166; marcador del linaje endotelial CD105.
La FIG. 10 es una imagen de resonancia magnética (MRI) que muestra la regeneración ósea de la mandíbula. En el lado izquierdo (Panel A) aparece el estado mandibular en el momento del tratamiento quirúrgico, y en el lado derecho (Panel B) la regeneración ósea producida a los 4 meses de la cirugía y después de algunas infiltraciones o tratamiento con el suero de acuerdo con la invención.
La FIG. 11 también es una imagen de MRI que muestra la regeneración del hueso escafoides y el cúbito producida con un suero de acuerdo con a la invención. En el lado izquierdo (Panel A), el estado del hueso en el momento de la cirugía. En el lado derecho (Panel B), el hueso formado a los 6 meses de la cirugía.
La FIG.12 muestra fotografías de la evolución de una cicatriz hipertrófica antes (Panel A) de la inyección de un suero de acuerdo con la invención, y después de la inyección de dos dosis del suero (Panel B) y 40 días después de completar el tratamiento (Panel C). La flecha muestra la posición de la cicatriz.
Descripción detallada de la invención
Todos los términos, como se usan en la presente solicitud, salvo que se indique de otra forma, se entenderán en su significado común, tal como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas para ciertos términos como se usan en la presente solicitud son las establecidas a continuación y pretenden aplicarse uniformemente a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a menos que una definición expuesta expresamente de otra manera proporcione una definición más amplia. Las siguientes definiciones se incluyen con el fin facilitar la comprensión. En la sangre, el "suero" es el componente que no es ni una célula sanguínea (el suero no contiene glóbulos blancos ni rojos) ni un factor de coagulación; es el plasma sanguíneo con los fibrinógenos retirados. El suero incluye todas las proteínas no usadas en la coagulación de la sangre (coagulación) y todos los electrolitos, anticuerpos, antígenos, hormonas y sustancias exógenas (por ejemplo, fármacos y microorganismos). El suero se obtiene por centrifugación de la sangre para retirar los componentes celulares. La sangre anticoagulada produce plasma que contiene fibrinógeno y factores de coagulación. La sangre coagulada produce suero sin fibrinógeno, aunque pueden quedar algunos factores de coagulación. Aunque asociado con la sangre, también se considera suero, cualquier fluido de una muestra biológica con leucocitos y/o plaquetas y fibrinógeno que se deja que forme un coágulo. En la presente descripción, las expresiones "suero que comprende citocinas y factores de coagulación" y "suero rico en citocinas" se usan indistintamente, y se refieren a una composición obtenida a partir de sobrenadantes recogidos tras someter una muestra aislada que comprende plaquetas y/o leucocitos a una fuerza de la gravedad específica. Esta fuerza de la gravedad se puede aplicar mediante varios medios, incluyendo, por ejemplo, la centrifugación de la muestra. Un "factor de coagulación" es una proteína implicada en la cascada de coagulación. En general, los factores de coagulación son proteasas de serina (enzimas), que actúan dividiendo las proteínas cadena abajo, aunque hay algunas excepciones (el FVIII y el FV son glicoproteínas y el factor XIII es una transglutaminasa). Los ejemplos de factores de coagulación son: Factor XII (factor Hageman), Factor XI (tromboplastina plasmática), Factor X, Factor IX (factor de Christmas), Factor V, Factor XIII (factor estabilizador de la fibrina), Factor VII, factor tisular (TF), protrombina, trombina y fibrinógeno. Como se indica, los factores de coagulación participan en la cascada de coagulación, que tiene dos vías que conducen a la formación de fibrina. Estas son la vía de activación por contacto (también conocida como vía intrínseca) y la vía del factor tisular (también conocida como vía extrínseca). Las vías son una serie de reacciones, en las que un zimógeno (precursor de enzima inactiva) de una serina proteasa y su cofactor de glicoproteína se activan para convertirse en componentes activos que luego catalizan la siguiente reacción de la cascada, lo que finalmente produce fibrina reticulada. En general, los factores de coagulación se indican con números romanos, con una minúscula que se anexa para indicar una forma activa.
El término "citocina", en la presente invención, se refiere a cualquier molécula biológica que señaliza entre células. Estas moléculas son producidas por las propias células e incluyen, por ejemplo, péptidos, proteínas, glicoproteínas, mucoproteínas, hormonas, factores de crecimiento o enzimas que tienen actividad o están relacionadas con procesos inmunitarios, procesos inflamatorios y procesos reparadores o regenerativos en general. Las citocinas (cito- del griego, célula; célula; y -cinos, movimiento) es el nombre usado para describir un grupo diverso de proteínas solubles, péptidos o glicoproteínas que actúan como reguladores humorales o moléculas de señalización a concentraciones de nano a picomolares, y que ayudan en la señalización celular. El término "citocina" engloba una familia grande y diversa de reguladores producidos en todo el organismo por células de diverso origen embrionario. El termino "citocina" se ha usado para referirse a los agentes inmunomoduladores, tales como las interleucinas y los interferones. Son reguladores de las respuestas del hospedador a la infección, a respuestas inmunitarias, a la inflamación y al traumatismo. Algunos de ellos son proinflamatorios, estos son necesarios para iniciar una respuesta inflamatoria necesaria para reclutar granulocitos, y más tarde, linfocitos, para combatir una enfermedad. La inflamación excesiva, sin embargo, en ocasiones, es la patogenicidad de ciertas enfermedades. Otras citocinas son antiinflamatorias, y sirven para reducir la inflamación y potenciar la curación una vez que la lesión/infección/cuerpo extraño se haya destruido.
La expresión "factor de crecimiento", en ocasiones, se usa indistintamente entre los científicos con el término citocina. Históricamente, las citocinas se asociaron con células hematopoyéticas (formadoras de sangre) y células
del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos y células tisulares de bazo, timo y ganglios linfáticos). Para el sistema circulatorio y la médula ósea en los que las células pueden aparecer en una suspensión líquida y no estar unidas en tejido sólido, tiene sentido que se comuniquen mediante moléculas de proteínas circulantes y solubles. Sin embargo, a medida que convergían las diferentes líneas de investigación, se hizo evidente que algunas de las mismas proteínas de señalización usadas por el sistema hematopoyético e inmunitario, también estaban siendo usadas por todo tipo de otras células y tejidos, durante el desarrollo y en el organismo maduro. Mientras que el factor de crecimiento implica un efecto positivo en la división celular, la citocina es un término neutro con respecto a si una molécula afecta a la proliferación. Mientras que algunas citocinas pueden ser factores de crecimiento, tales como G-CSF y el GM-CSF, otras tienen un efecto inhibidor sobre el crecimiento o la proliferación celular. Algunas citocinas, tales como el ligando Fas, se usan como señales de "muerte"; hacen que las células diana sufran muerte celular programada o apóptosis. Por lo tanto, en el sentido de la presente invención, la expresión "factor de crecimiento" engloba a todas las demás moléculas, tales como proteínas de señalización, péptidos, glicoproteínas, mucoproteínas u hormonas que no se consideran citocinas, pero que ejercen una función de señalización entre las células.
Por "fuerza de la gravedad" se ha de entender la fuerza que experimentan mutuamente dos cuerpos que tienen una masa especificada. Debido a su masa, un cuerpo genera un campo gravitatorio. También es posible aplicar un campo gravitatorio externamente a un cuerpo mediante varios medios. Uno de estos medios incluye la centrifugación que, debido a la aceleración centrífuga, impone a la masa un efecto similar al de la gravedad.
El término "centrifugación" se refiere a un método mediante el que los sólidos de diferentes densidades se separan de los líquidos a través de una fuerza de rotación, que aplica a la mezcla una fuerza centrífuga superior a la de la gravedad. Los sólidos y las partículas de mayor densidad se sedimentan. Los ejemplos de centrifugación incluyen, sin limitación:
- Centrifugación diferencial: basada en la diferencia en la densidad de las moléculas. Esta diferencia debe ser lo suficientemente grande como para observarse mediante centrifugación. Las partículas que tienen densidades similares se sedimentan juntas. Este método no es específico, por lo que se usa como centrifugación preparativa para separar componentes de la mezcla (por ejemplo, para retirar los núcleos y la membrana de las mitocondrias), pero no es útil para separar moléculas.
- Centrifugación isopícnica: basada en el hecho de que las partículas con el mismo coeficiente de sedimentación se separan mediante diferentes medios de densidad. En general, se usa para la separación del ADN.
- Centrifugación zonal: las partículas se separan por la diferencia en la velocidad de sedimentación debido a la diferencia en su masa. La muestra se coloca encima de un gradiente de densidad previamente formado. Mediante la fuerza centrífuga, las partículas se asientan a diferentes velocidades a través del gradiente de densidad de acuerdo con su masa. Debe tenerse en cuenta el tiempo de centrifugación porque, si se supera, todas las moléculas podrían asentarse en el fondo del tubo de ensayo.
- Ultracentrifugación: permite estudiar las características de sedimentación de las estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y biomoléculas.
El término "plaquetas", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades de células pequeñas (2-3 micrómetros de diámetro), ovaladas y sin núcleo generadas en condiciones normales en la médula ósea a partir de la fragmentación citoplasmática de los megacariocitos. Las plaquetas circulan en la sangre de todos los mamíferos y participan en la hemostasia, participando en la formación de los coágulos de sangre. Las plaquetas liberan un gran número de factores de crecimiento y/o citocinas, incluyendo el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, también abreviado como PDGFAA), un potente agente quimiotáctico y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β1), que estimula la formación de la matriz extracelular. Dependiendo de ciertas condiciones, las plaquetas también sintetizan muchas otras moléculas esenciales del proceso inflamatorio, y del proceso reparador y regenerativo de los tejidos. Estos factores de crecimiento o moléculas han demostrado desempeñar un papel importante en la regeneración y reparación del tejido conjuntivo. Otras proteínas y factores de crecimiento producidos por plaquetas y procesos inflamatorios asociados, Reparadores y regenerativos incluyen el factor de crecimiento de fibroblastos básico (BFGF), el factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1), el factor de crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2), el factor de crecimiento epitelial (EGF), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la interleucina 8, el factor de crecimiento de queratinocitos, el factor de crecimiento del tejido conjuntivo. La aplicación local de todos estos factores de crecimiento, moléculas y proteínas producidos por las plaquetas participa en y acelera el proceso de curación de diferentes lesiones. Las plaquetas también liberan grandes cantidades de trombina y adenosina difosfato ADP, calcio, tromboxano A2, PF4, PAI-1, fibrinógeno, fibronectina, trombomodulina, FV, FXIII, RANTES, trombospondina, WWF PF-3, serotonina, enzimas hidrolíticas, etc.
El término "leucocito" o la expresión "glóbulos blancos", que se usan de manera indistinta en el presente documento, se refiere a células sanguíneas que forman parte de los efectores celulares del sistema inmunitario. Son células con capacidad migratoria que usan la sangre como vehículo para acceder a las diferentes partes del organismo. Los leucocitos son responsables de destruir los agentes infecciosos y las células infectadas. También secretan citocinas, factores de crecimiento y sustancias protectoras, tales como anticuerpos, que combaten las infecciones. También
activan funciones biológicas en otras células. Basándose en las características microscópicas de su citoplasma (tinción) y de su núcleo (morfología), se dividen en:
- granulocitos y células polimorfonucleares (neutrófilos, basófilos y eosinófilos) y tienen un núcleo polimorfo y numerosos gránulos en el citoplasma, con tinción diferencial de acuerdo con los tipos de células; y
- agranulocitos o células monomorfonucleares (linfocitos y monocitos): carecen de gránulos de citoplasma y tienen un núcleo redondo.
La expresión "cantidades equivalentes de otra fuente de calcio soluble", en la presente invención, se refiere a cantidades de fuentes de calcio que permiten la formación de calcio ionizado en una cantidad similar a la indicada en el método. Las fuentes de calcio solubles son, por ejemplo, sin limitación, acetato de calcio, carbonato de calcio, glubionato de calcio, gluconato de calcio, hidróxido de calcio, nitrato de calcio, sulfonato de calcio, fosfato de calcio u otras fuentes conocidas por los expertos en el campo. El cambio de las fuentes de calcio y el cálculo de cantidades equivalentes es sencillo y fácil de realizar por un experto en la materia.
La expresión "farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acordes con una relación beneficio/riesgo razonable. Cada vehículo, excipiente, etc., debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con el resto de ingredientes de la formulación. Los vehículos, excipientes, etc. adecuados se pueden encontrar en textos farmacéuticos convencionales, e incluyen, como ejemplo, conservantes, aglutinantes, humectantes, emolientes y antioxidantes. La expresión "cantidad eficaz”, como se usa en el presente documento, significa una cantidad de un agente activo suficientemente alta para proporcionar el beneficio deseado (ya sea el tratamiento o la prevención de la enfermedad), pero suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves dentro del alcance de juicio médico. El término "fibrinógeno", en la presente invención, se refiere a una proteína soluble del plasma sanguíneo que se sintetiza en el hígado. Es responsable, junto con la trombina, de la formación de la fibrina en los coágulos sanguíneos. Cuando hay una herida presente, la cascada de coagulación finalmente transforma el fibrinógeno unido a la trombina en fibrina.
El término "trombina", en la presente invención, se refiere a una enzima de glicoproteína que no es un constituyente normal de la sangre en circulación, sino que se genera a partir de protrombina y el factor II en presencia de iones de calcio y mediante una reacción catalizada por el factor activado Xa, en la etapa final de las dos cascadas convergentes de reacciones, la vía intrínseca y la vía extrínseca de la coagulación. La trombina activa la degradación del fibrinógeno en monómeros de fibrina, además de activar el factor XIII o el factor estabilizador de la fibrina. Caben señalar otras funciones biológicas importantes de la trombina: 1) la activación de las plaquetas para que liberen los componentes (citocinas) de sus gránulos α y gránulos densos; 2) la potenciación de la síntesis, liberación y expresión de proteínas de las células endoteliales (angiogénesis); y 3) inducción potente de quimiotaxis de los neutrófilos (factores inflamatorios) y macrófagos (producción de citocinas).
El término "fibrina", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína fibrilar con la capacidad de formar redes tridimensionales. Esta proteína desempeña un papel importante en el proceso de coagulación en vista de sus propiedades. Tiene la estructura de un polo con tres áreas globulares. Tiene la capacidad de crear agregados con otras moléculas que forman un coágulo blando. No se encuentra normalmente en la sangre, se forma a partir del fibrinógeno circulante, que, mediante la acción de la enzima denominada trombina, se convierte en fibrina, que tiene efectos coagulantes.
La expresión "composición de gel de fibrina" se refiere al gel rígido y elástico (composición semisólida) formado como capa intermedia cuando, debido a la centrifugación de una composición que comprende plaquetas y/o leucocitos y fibrinógeno (por ejemplo, sangre), se produce la activación de la cascada de coagulación y la síntesis de trombina para inducir finalmente la formación de fibrina. A continuación, la fibrina forma redes tridimensionales que comprenden, enredadas, un suero (líquido) que comprende citocinas, plaquetas y/o leucocitos entre las fibras de fibrina que constituyen la red o matriz. El gel de fibrina también puede denominarse matriz de fibrina o armazón de fibrina, usado en el presente documento indistintamente como sinónimo.
El término "muestra", en la presente invención, incluye sangre, médula ósea, sangre de cordón umbilical, tejido adiposo, placenta, menstruación o cualquier sustancia de un sujeto, obtenida mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para llevar a cabo cualquiera de los métodos proporcionados por la presente invención. Es decir, una muestra que comprende al menos plaquetas y leucocitos.
El término "sangre", como se usa en el presente documento, se refiere a un fluido tisular que fluye a través de los capilares, venas y arterias de todos los vertebrados. Su característico color rojo se debe a la presencia del contenido de pigmento rojo de los eritrocitos. Es un tipo especializado de tejido conjuntivo con una matriz coloidal líquida y
constitución compleja. De hecho, la sangre comprende una fase sólida formada por células (incluyendo leucocitos, eritrocitos y plaquetas) y una fase líquida, representada por el plasma. Su función principal es la distribución logística y la integración sistémica, cuya contención en los vasos (espacio vascular) apoya su distribución (circulación sanguínea) en la mayor parte del organismo. La expresión "sangre periférica" se refiere al volumen de sangre circulante distante del corazón, es decir, la sangre que fluye a través del (por el) organismo de un sujeto.
El término "eritrocitos" o "glóbulos rojos" o "RBC", en el sentido usado en la presente descripción, se refiere a los corpúsculos sanguíneos que transportarán el oxígeno y el dióxido de carbono en la sangre. Se sabe que los corpúsculos carecen de núcleos y orgánulos (solo en mamíferos), por lo que no pueden considerarse estrictamente células. Contienen algunas vías enzimáticas, y su citoplasma está ocupado casi por completo por la hemoglobina, una proteína responsable del transporte de oxígeno. En la membrana plasmática de los eritrocitos se encuentran las glicoproteínas (CD) que definen los diferentes grupos sanguíneos y otros identificadores celulares. Los eritrocitos tienen forma de disco, son bicóncavos, deprimidos en el centro; esto aumenta el área de superficie eficaz de la membrana. Los RBC maduros carecen de núcleo, porque se desaloja en la última etapa de la maduración en la médula ósea antes de introducirse en el torrente sanguíneo.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal con circulación sanguínea, preferentemente un mamífero, más preferentemente un primate, y aún más preferentemente, un ser humano, varón o mujer, de cualquier edad o raza. Además, el sujeto puede ser un sujeto sano o un sujeto diagnosticado de cualquier patología o enfermedad.
El término "anticoagulante", en el sentido usado en la presente descripción, se refiere a una sustancia endógena o exógena que interfiere con o inhibe la coagulación de la sangre. Los ejemplos no limitantes de anticoagulantes son los activadores de antitrombina III y la heparina, ardeparina de bajo peso molecular, certoparina, nadroparina, logiparina, parnaparina, reviparina y tedelparina, y antitrombina recombinante III, inhibidor del factor tisular (TF)-Factor Vila, como los mutantes TF, anticuerpos anti-TF, inhibidores del factor VII, inhibidores de la trombina tales como inhibidores del factor Xa antiestatina, TAP (péptido anticoagulante de garrapatas), DX9065, lefaxina, fondaparinux, terostatina, YM-75466 y ZK-807,834, anticuerpos contra el factor IXa y Xa, activadores de la vía de la proteína C e inhibidores selectivos de la trombina como argatrobán, bivalirudina, efegatrán, H376/95, hirugeno, inogatrán, melagatrán, napsagatrán, UK-156406 y ximelagatrán, y compuestos químicos que capturan los iones de calcio, tales como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), citrato (en general, citrato de sodio) y oxalato.
La expresión "plasma rico en plaquetas" o "PRP", en la presente invención, se refiere a un plasma en presencia de plaquetas. El PRP puede prepararse mediante cualquier método convencional conocido por los expertos en la materia, tal como, el método desvelado en el documento US 20050252867. Un ejemplo de fácil preparación de PRP es un método que comprende:
I) extraer una muestra de sangre de un sujeto en presencia de citrato de sodio como anticoagulante;
II) centrifugar la muestra a 150 g durante 10 minutos; e
III) obtener el sobrenadante, siendo el sobrenadante PRP.
La expresión "plasma pobre en plaquetas" o "PPP", en la presente invención, se refiere a una fracción de plasma que queda tras la separación y la obtención de un concentrado de plaquetas o "cPLT".
La expresión "concentrado de plaquetas" o "cPLT", en la presente invención, se refiere a un preparado de plaquetas con una concentración de plaquetas que es al menos tres veces superior al valor medio basal en sangre. Es la fracción restante de plasma tras la obtención de un "plasma pobre en plaquetas" o "PPP".
La expresión "concentrado de plasma" y/o "concentrado de suero", en la presente invención, se refiere a un plasma o suero con una concentración más alta de proteína. Un ejemplo de obtención de un plasma o suero concentrado puede ser, por ejemplo, sin limitación, el método que comprende:
I. centrifugar un plasma o suero a una velocidad de entre 5.000 g y 6.500 g durante 5 a 10 minutos;
II. retirar del sobrenadante y volver a suspender el sedimento en el sobrenadante restante.
El término "plasma" o la expresión "plasma sanguíneo", en la presente invención, se refiere a la fracción líquida de sangre. Se compone de agua al 90 %, proteína al 7 % y el 3 % restante de grasa, glucosa, vitaminas, hormonas, oxígeno, dióxido de carbono y nitrógeno, además de productos de desecho metabólicos como el ácido úrico. Es el componente principal de la sangre, que representa aproximadamente el 55 % del volumen total de sangre, mientras que el 45 % restante corresponde a los elementos formados. La viscosidad del plasma sanguíneo es 1,5 veces la del agua. Las principales proteínas plasmáticas son las siguientes: albúmina, que también participa en el transporte de lípidos; globulinas, que están relacionadas principalmente con los mecanismos de defensa del organismo (por ejemplo, inmunoglobulinas) o con el transporte del hierro (transferrina); fibrinógeno, una proteína que es esencial para la coagulación de la sangre; protrombina, proteína que participa en el proceso de coagulación; y las lipoproteínas y las lipoproteínas de baja densidad (LDL y HDL, respectivamente) que participan en el transporte del
colesterol. El conjunto de proteínas plasmáticas, también denominadas "factores plasmáticos", realiza las funciones, entre otras, de:
- mantener el volumen plasmático y el volumen sanguíneo,
- proteger y mantener la estabilidad del pH de la sangre,
- participar en la viscosidad de la sangre, y por lo tanto, contribuir mínimamente a la resistencia vascular periférica y la presión vascular (presión arterial), e
- intervenir en la concentración de iones de equilibrio electroquímico (denominado efecto Donnan).
La expresión "plasma rico en leucocitos" o "concentrado de leucocitos plasmáticos" (PRL), en la presente invención, se refiere a una muestra de sangre que se ha tratado para eliminar todos los tipos de células diferentes de los leucocitos, y que tiene una concentración de leucocitos superior a la original en la muestra de sangre. Un ejemplo de un método para obtener plasma rico en leucocitos puede ser, por ejemplo, un método que comprende:
I) Una muestra de sangre completa recogida y separada por centrifugación en glóbulos rojos empaquetados y plasma que contiene glóbulos blancos (capa leucocítica).
II) En una segunda etapa, la fracción de plasma que contiene glóbulos blancos (capa leucocítica) se centrifuga para separar el plasma o el sobrenadante de los glóbulos blancos (capa leucocítica).
III) Una vez retirado el plasma o el sobrenadante, la muestra restante (sedimento) son leucocitos (capa leucocítica) o plasma rico en leucocitos, se puede ajustar el volumen final.
La expresión "regeneración de tejido" o "regeneración tisular", en la presente invención, se refiere al proceso de renovación total o parcial, la restauración y el crecimiento de células, tejidos y órganos después de que se han interrumpido o dañado. La regeneración tisular se refiere a los procesos bioquímicos, morfológicos y funcionales concebidos para reparar y mantener la integridad del estado fisiológico y morfológico de los mismos. Reparación y regeneración son sinónimos en muchos casos, incluso en el caso de la regeneración, se hace mayor hincapié en una recuperación más completa, tanto morfológica como fisiológicamente. De hecho, un "agente reparador de tejido" es un agente que permite que el tejido recupere su función normal aunque no se haya creado tejido (o células) nuevo.
La expresión "agente proliferativo celular" se refiere a cualquier compuesto o composición que favorece la división celular. Por " agente de diferenciación celular " se ha de entender cualquier compuesto o composición que favorezca que las células inmaduras se conviertan en células maduras con funciones específicas y diferenciadas.
Como se ha indicado anteriormente, la invención desvela un método para la preparación de sueros que comprenden citocinas y factores de coagulación, método que comprende las etapas de (a) someter una muestra biológica aislada que comprende plaquetas y/o leucocitos a una fuerza de la gravedad comprendida entre 100 y 200 g, obteniéndose un primer coágulo y un sobrenadante; (b) someter el coágulo o, como alternativa, el coágulo y el sobrenadante de la etapa (a) a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 2.500 g, obteniéndose un sobrenadante SN1; en el que la fuerza de la gravedad se aplica de manera discontinua y se lleva a cabo por medio de:
(i) la centrifugación del coágulo de la etapa (a), o como alternativa, del coágulo y del sobrenadante, a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 500 g;
(ii) la recuperación del sobrenadante de la etapa (i), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1ii;
(iii) la centrifugación del coágulo restante a una fuerza de la gravedad comprendida entre 1.500 y 2.500 g y la recuperación del sobrenadante de la etapa (iii), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1iii de la etapa (b), constituyendo los sobrenadantes de las etapas (ii) e (iii) el sobrenadante completo SN1; y (c) la recuperación de dicho sobrenadante SN1 de la etapa (b), que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación, en la que la fuerza de la gravedad se aplica mediante un proceso seleccionado del grupo que consiste en centrifugación y succión física.
Por lo tanto, este método permite la obtención de un suero que comprende citocinas y factores de coagulación en el mismo, denominado sobrenadante SN1.
En una realización particular de este método, antes de la etapa (b), el coágulo o, como alternativa, el coágulo y el sobrenadante de la etapa (a) se somete a una fuerza de la gravedad comprendida entre 1 g a 10 g. Esta particularidad del método permite estabilizar el coágulo, que luego será capaz de producir muchas citocinas. Por lo tanto, aunque no es esencial para el método, si la fuerza de la gravedad se reduce entre las etapas (a) y (b), o si se permite un período de reposo, se obtienen mejores resultados (más concentraciones de citocinas y factores de coagulación).
También es particularmente beneficioso si la etapa (a) se lleva a cabo no más tarde de 5 minutos después del aislamiento de la muestra. De esta manera, los factores de coagulación de la muestra se encuentran en condiciones especialmente buenas para desempeñar su papel. Es decir, se reduce al mínimo la desnaturalización de la proteína.
En otra realización particular del primer aspecto de la invención, se realiza una etapa adicional (d) tras la etapa (c). En esta etapa (d), se realiza el ajuste del calcio iónico a una concentración final de 1,0 µmol/ml a 50,0 µmol/ml y del pH de la solución final a un pH comprendido entre 7,0 y 7,6, mediante la adición de una fuente de calcio iónico al sobrenadante recuperado y, opcionalmente, un agente de ajuste del pH. El agente de ajuste del pH puede ser la propia fuente de calcio iónico si el anión acompañante del calcio es un anión de un tampón fisiológicamente aceptable (véase más adelante).
El método de la invención puede, por tanto, incluir una etapa final en la que se añada una fuente de calcio para permitir la formación de calcio ionizado en la muestra y, de ese modo, para ajustar el pH de 7,2 a 7,6. Esta formación de calcio ionizado es esencial para muchos procesos celulares y biológicos. El calcio es un importante segundo mensajero intracelular (transporte en el citoplasma) y regulador biológico requerido para la función celular normal, es requerido por muchas proteínas, enzimas y moléculas para la actividad y la señalización celular.
La relación entre el calcio y el pH es lineal desde un valor de pH entre 7,20 y 7,60 con niveles normales de proteínas totales. Además, el ajuste del pH es importante para lograr un entorno homeostático, en el que pueda tener lugar una actividad y señalización celular adecuada. Las fuentes de calcio iónicas adecuadas incluyen sales farmacéuticamente aceptables de calcio, tales como cloruro de calcio, acetato de calcio, carbonato de calcio, glubionato de calcio, gluconato de calcio, hidróxido de calcio, nitrato de calcio, sulfonato de calcio y fosfato de calcio. Estas fuentes de calcio son todas tampones de pH adecuados. También se pueden usar otros tampones de pH, mientras que la fuerza iónica de la muestra no se pone en peligro y no se introducen sustancias tóxicas para los compuestos celulares.
Cuando la muestra biológica es, en particular, sangre, esta etapa (d) no es necesaria si la sangre está en las condiciones fisiológicas consideradas normales, lo que significa una concentración de calcio iónico de 1,0 µmol/ml a 50,0 µmol/ml; y un pH de 7,0 a 7,6. De todos modos, si se ha de usar suero, por ejemplo, para estimular otras células o para activar composiciones con plaquetas y/o leucocitos, se prefieren ajustar el pH y la concentración de calcio. El ajuste también se puede realizar si el suero tiene que ser almacenado durante un tiempo.
Como se ha indicado anteriormente, la fuerza de la gravedad se aplica, en particular, por centrifugación. La centrifugación impone un efecto equivalente a la gravitación mediante una fuerza de rotación.
En otra realización particular, cuando se aplica la fuerza de la gravedad de una magnitud especificada en una etapa, independientemente de si se aplica por centrifugación o no, el tiempo de esta aplicación está comprendido entre 2 y 30 minutos. En otra realización más particular, la fuerza de la gravedad se aplica durante de 5 a 15 minutos y, en particular, durante 10 minutos. Dependiendo de este tiempo, se obtiene un perfil de citocinas diferente, así como una concentración diferente de cada una de las citocinas. En cualquier caso, sin embargo, el suero está enriquecido en citocinas y factores de coagulación, ya que la fuerza de la gravedad activa las células del material de partida (muestra biológica aislada).
En una realización particular, la fuerza de la centrifugación o la fuerza de la gravedad de la etapa (i) es de 450 g; y la de la etapa (iii) es de 1.500 g.
La centrifugación de la etapa (iii) implica una fuerza de la gravedad (o centrifugación) suficiente para romper los enlaces y producir la degradación de la fibrina en el precipitado formado en la etapa (i). Además, la fuerza de la gravedad debe ser suficiente para producir una liberación de las células atrapadas en el coágulo de fibrina presente en este precipitado. De esta manera, las células pueden activarse para desencadenar la producción de citocinas sin dar lugar a su lisis.
Por lo tanto, en el método desvelado en el presente documento, las etapas de permitir la aplicación de un patrón especificado de la fuerza de la gravedad, que, en casos particulares, es una fuerza centrífuga. En primer lugar, el someterse a una fuerza de la gravedad de 100 a 200 g permite la formación del coágulo (que contiene plaquetas y/o leucocitos incrustados en una matriz de fibrina) y una activación leve del mismo. Es decir, potenciar el inicio de la interacción entre las células y la síntesis o liberación de citocinas primarias, básicamente, de las plaquetas de la muestra biológica. Después, por medio de una fuerza de la gravedad más alta (de 400 a 2.500 g), el coágulo se activa vigorosamente, de manera que las plaquetas y los leucocitos de la muestra liberan otras citocinas al sobrenadante. Estas otras citocinas son en su mayoría aquellas que aparecen tarde cuando se activa la vía de coagulación. También incluyen las moléculas que se necesitan más adelante en la señalización entre las células, cuando sea necesario modular otros eventos tardíos en los procesos en los que participan estos tipos de células. En una realización particular, la fuerza de la gravedad de la etapa (a) es de 150 g, aplicada mediante la centrifugación de la muestra o por otros medios (es decir, aspiración).
Además, el método, en particular, se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 18 ºC y 40 ºC. En particular,a 37 ºC, imitando así las condiciones fisiológicas. El control de la temperatura garantiza que no se produzca ninguna degradación del producto obtenido.
En otra realización particular del método de la invención, entre las etapas (a) y (b), o entre las sucesivas subetapas (i) e (iii), se llevan a cabo períodos de reposo suficientes para formar el coágulo. Esto permite completar el ciclo de coagulación (activación y desgranulación plaquetaria/liberación de citocinas y factores de crecimiento de los gránulos α y gránulos densos), y además de iniciar la fibrinólisis. Por lo tanto, esta etapa de reposo debe estar comprendida en particular entre 1 y 60 minutos, más concretamente, de 1 a 30 minutos, y aún más particularmente de 5 minutos.
Otra realización particular y específica del método de la invención se refiere a un método para la preparación de sueros ricos en citocinas, sueros que comprenden citocinas y factores de crecimiento, comprendiendo el método: - centrifugar una muestra biológica aislada previamente obtenida de un sujeto en ausencia de anticoagulantes y que contenga una cantidad final de 15 µmol/ml de una fuente de calcio en la muestra, tal como CaCl2 (a partir de una solución al 10 % p/p, que comprende así 2,5 mg/ml en la fuente de calcio) u otras fuentes de calcio ionizado; - dejar el precipitado durante 1 a 60 minutos a una temperatura comprendida entre 18 y 40 ºC;
- centrifugar la muestra de la etapa anterior;
- extraer el sobrenadante de la muestra de la etapa anterior;
- centrifugar el precipitado en reposo de la etapa de centrifugación;
- extraer el sobrenadante de esta segunda etapa de centrifugación;
- mezclar los sobrenadantes o sueros obtenidos en las etapas anteriores;
- añadir una fuente de calcio ionizado a una concentración final de 1,1 a 1,4 mol/ml en la muestra (de 4,5 a 5,6 mg/dl) y ajustar el pH entre 7,2 y 7,6.
En otra realización particular de este primer aspecto de la invención, la muestra biológica aislada se selecciona de sangre, médula ósea, sangre de cordón umbilical, tejido adiposo y placenta. En una realización preferida, la muestra es sangre aislada. En una realización más preferida, la sangre es sangre periférica. El problema principal es que la muestra aislada contiene fibrinógeno, plaquetas y/o leucocitos. De este modo, pueden formar un coágulo (o precipitado) que contiene las plaquetas y/o los leucocitos en una matriz de fibrina.
El método de la invención puede comprender además una etapa en la que se han eliminado los eritrocitos casi por completo. Los eritrocitos (glóbulos rojos), además de su contribución como transportadores del oxígeno, no desempeñan un papel significativo en el proceso regenerativo. Esta extracción de glóbulos rojos se puede realizar por medio de varias técnicas conocidas en la técnica, tales como aunque no de forma limitativa, succión por capas, o sedimentación por gravedad o centrifugación. De hecho, los eritrocitos se sedimentan en el fondo del tubo cuando se aplica centrifugación a una muestra. Se pueden retirar fácilmente.
Así pues, en una realización preferida del método de la invención, el método comprende además la extracción de la fracción de los glóbulos rojos después de la etapa (a) o (b), o después de una etapa de reposo opcional.
Por otro lado, sin embargo, una baja concentración de glóbulos rojos puede ser beneficiosa. De este modo, si una cantidad de al menos el 2 % p/p permanece en la muestra o en cualquiera de los coágulos y sobrenadantes obtenidos a lo largo de la realización del método, los glóbulos rojos pueden actuar como fuente de oxígeno (debido a la hemoglobina) y ayudar en el metabolismo celular.
El método de la invención puede contener además otras etapas para enriquecer ciertas citocinas en el producto final dependiendo de los requisitos de cada caso, y en función de la utilidad del suero. Estos elementos adicionales representan el complemento de uno de los productos (sueros) que se pueden obtener mediante el método de la invención.
Por lo tanto, el método puede comprender además la etapa de:
- mezclar el sobrenadante SN1 de la etapa (c) con una composición que comprende fibrinógeno, plaquetas y/o leucocitos seleccionados del grupo que consiste en un plasma rico en plaquetas, un concentrado de plaquetas, un plasma rico en leucocitos, un concentrado de leucocitos, un plasma pobre en plaquetas, un concentrado de plasma y mezclas o combinaciones de los mismos;
- añadir a la mezcla de la etapa anterior una fuente de calcio iónico para ajustar el calcio iónico a una concentración final de 1,0 µmol/ml a 50,0 µmol/ml, obteniéndose un segundo coágulo, que es una composición de gel de fibrina que comprende plaquetas y/o leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, comprendiendo dicho gel también un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuesto entre la matriz de fibrina.
Por lo tanto, también forma parte de la invención un método para preparar una composición de gel de fibrina que comprende plaquetas y/o leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, comprendiendo dicho gel también un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuesto entre la matriz de fibrina, método que comprende las siguientes etapas:
(a) someter una muestra biológica aislada que comprende plaquetas y leucocitos a una fuerza de la gravedad comprendida entre 100 y 200 g, obteniéndose un coágulo y un sobrenadante;
(b) someter solo el coágulo o, como alternativa, el coágulo y el sobrenadante de la etapa (a) a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 2.500 g, obteniéndose un sobrenadante SN1, en el que la fuerza de la gravedad se aplica de manera discontinua y se lleva a cabo por medio de:
(i) la centrifugación del coágulo de la etapa (a), o como alternativa, del coágulo y del sobrenadante, a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 500 g;
(ii) la recuperación del sobrenadante de la etapa (i), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1ii; (iii) la centrifugación del coágulo restante a una fuerza de la gravedad comprendida entre 1.500 y 2.500 g y la recuperación del sobrenadante de la etapa (iii), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1iii de la etapa (b), constituyendo los sobrenadantes de las etapas (ii) e (iii) el sobrenadante completo SN1;
(c) la recuperación de dicho sobrenadante SN1 de la etapa (b), que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación;
(d) mezclar el sobrenadante SN1 de la etapa (c) con una composición que comprende fibrinógeno, plaquetas y/o leucocitos seleccionados del grupo que consiste en un plasma rico en plaquetas, un concentrado de plaquetas, un plasma rico en leucocitos, un concentrado de leucocitos, un plasma pobre en plaquetas, un concentrado de plasma y mezclas o combinaciones de los mismos; y
(e) añadir a la mezcla de la etapa anterior una fuente de calcio iónico para ajustar el calcio iónico a una concentración final de 1,0 µmol/ml a 50,0 µmol/ml;
en la que la fuerza de la gravedad se aplica mediante un proceso seleccionado del grupo que consiste en centrifugación y succión física.
Todavía, se considerará como objeto de la invención esta composición de gel de fibrina que comprende las plaquetas y/o los leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, y que también comprende un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuestos entre medias de la matriz de fibrina. Este producto semisólido (es decir, gel) es, de hecho, una composición de gel rígida y elástica que comprende el suero definido por el sobrenadante SN1, junto con una fuente de células y calcio iónico.
En una realización particular de este método anterior, la composición de gel de fibrina con las plaquetas y/o los leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, y que comprende un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuesto entre medias de la matriz de fibrina, se somete a medios físicos y/o químicos y/o bioquímicos para romper la matriz de fibrina por estos medios, y así obtener un sobrenadante SN2. Este sobrenadante SN2 se recupera y también es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación.
Por lo tanto, también forma parte de la invención un método para preparar un suero que comprende citocinas y factores de coagulación, denominado SN2, método que comprende las siguientes etapas:
(a) someter una muestra biológica aislada que comprende plaquetas y/o leucocitos a una fuerza de la gravedad comprendida entre 100 y 200 g, obteniéndose un primer coágulo y un sobrenadante;
(b) someter solo el coágulo o, como alternativa, el coágulo y el sobrenadante de la etapa (a) a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 2.500 g, obteniéndose un sobrenadante SN1; en el que la fuerza de la gravedad se aplica de manera discontinua y se lleva a cabo por medio de:
(i) la centrifugación del coágulo de la etapa (a), o como alternativa, del coágulo y del sobrenadante, a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 500 g;
(ii) la recuperación del sobrenadante de la etapa (i), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1ii; (iii) la centrifugación del coágulo restante a una fuerza de la gravedad comprendida entre 1.500 y 2.500 g y la recuperación del sobrenadante de la etapa (iii), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1iii de la etapa (b), constituyendo los sobrenadantes de las etapas (ii) e (iii) el sobrenadante completo SN1;
(c) la recuperación de dicho sobrenadante SN1 de la etapa (b), que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación;
(d) mezclar el sobrenadante SN1 de la etapa (c) con una composición que comprende fibrinógeno, plaquetas y/o leucocitos seleccionados del grupo que consiste en un plasma rico en plaquetas, un concentrado de plaquetas, un plasma rico en leucocitos, un concentrado de leucocitos, un plasma pobre en plaquetas, un concentrado de plasma y mezclas o combinaciones de los mismos;
(e) añadir a la mezcla de la etapa anterior una fuente de calcio iónico para ajustar el calcio iónico a una concentración final de 1,0 µmol/ml a 50,0 µmol/ml, obteniéndose un segundo coágulo, que es una composición de gel de fibrina con las plaquetas y/o los leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, y que comprende un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuesto entre medias de la matriz de fibrina; (f) someter la composición de gel de fibrina a medios físicos y/o químicos y/o bioquímicos para romper la matriz
de fibrina mediante estos medios, obteniéndose un sobrenadante SN2; y
(g) recuperar el sobrenadante SN2;
en la que la fuerza de la gravedad en las etapas (a) y (b) se aplica mediante un proceso seleccionado del grupo que consiste en centrifugación y succión física.
Este método permite la obtención de otra generación de sueros ricos en citocinas (sueros que comprenden citocinas y factores de coagulación). Estos sueros finales, también identificados en el presente documento como sobrenadantes SN2, confieren características únicas y representan composiciones de naturaleza inexistente, debido a que los niveles y el equilibrio de citocinas y factores de coagulación que pueden obtenerse son mayores. Por lo tanto, los sobrenadantes finales SN2 tendrán un potencial terapéutico superior al de los sistemas corporales naturales.
Estos sueros SN2 también pueden definirse por su composición, de modo que, comprenden citocinas (incluyendo los factores de crecimiento ) y factores de coagulación seleccionados del grupo que consiste en:
- el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β1), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 100,0 ng/ml y 200,0 ng/ml;
- factor de crecimiento de la insulina-1 (IGF-1), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 200,0 ng/ml to 350,0 ng/ml
- el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 10,0 ng/ml y 50,0 ng/ml;
- el factor de crecimiento epidérmico (EGF), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 70,0 pg/ml y 200,0 pg/ml;
- el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 200,0 pg/ml y 700,0 pg/ml;
- interleucina 6 (IL-6, cuya concentración en el suero final está comprendida entre 3,0 pg/ml y 50,0 pg/ml;
- interleucina 8 (IL-8, cuya concentración en el suero final está comprendida entre 2,0 pg/ml y 100,0 pg/ml;
- interleucina 10 (IL-10, cuya concentración en el suero final está comprendida entre 5,0 pg/ml y 30,0 pg/ml;
- factor de crecimiento derivado P (PDGF), cuya concentración en el suero final está comprendida entre 40,0 ng/ml y 250,0 ng/ml;
- Factor VII, cuya concentración en el suero final está comprendida entre 200,0 U/dl y 350,0 U/dl, significando U unidades enzimáticas;
- factor de von Willebrand, cuya concentración en el suero final está comprendida entre 120,0 U/dl y 300,0 U/dl; y mezclas de los mismos.
El suero SN2 es capaz de inducir la proliferación de células de médula ósea de manera que, a partir de un cultivo de células de médula ósea sembradas en una placa de Petri con una densidad comprendida entre 150 células/cm2 y 250 células/cm2, mediante la adición del suero en un porcentaje en peso comprendido entre el 10 % y el 30 % en el cultivo final, la cantidad de células hematopoyéticas identificadas por el marcador de membrana CD34 está comprendida entre 1,0 x 106 y 1,5 x 106 medida 15 días después del contacto de las células de la médula ósea con el suero. El medio de cultivo complementado con una cantidad de suero comprendida entre el 10 % y el 30 % p/p puede ser cualquiera de los conocidos por el experto en la materia, en el que puedan crecer las células de la médula ósea. Un ejemplo es un medio modificado de Dulbecco que comprende glucosa y que tiene L-glutamina 4 mM y 0,05 unidades de penicilina y 0,05 g de estreptomicina.
El principio de esto es que el sobrenadante de la etapa (c), que es un suero con citocinas y factores de coagulación, actúa como una fuente de la trombina (factor de coagulación) y de un patrón especificado de citocinas que activan los elementos celulares de la composición que comprende fibrinógeno, plaquetas y/o leucocitos. Además, la fuente de calcio añadida para potenciar la coagulación también actúa como mediador químico o activador de las células. Como resultado, las plaquetas y/o los leucocitos sintetizan y producen citocinas y factores de coagulación adicionales. En una realización particular, la fuente de calcio iónico se añade en la etapa (e) a una concentración final en la mezcla de 24 µmol/ml. Un ejemplo de fuente es una solución de CaCl2 al 10 % p/p (4 mg/ml). Sin embargo, cualquier fuente de calcio también sería útil como se ha indicado anteriormente.
En otra realización particular, cuando el sobrenadante SN1 de la etapa (c) se mezcla con una composición que comprende fibrinógeno, plaquetas y/o leucocitos para obtener finalmente un coágulo (es decir, una composición de gel de fibrina), se usa una fuerza de gravedad comprendida entre 400 g y 2.500 g como medio físico para romper la matriz de fibrina para obtener y recuperar nuevamente un sobrenadante SN2. En una realización particular, los medios físicos son la centrifugación.
En otra realización particular, los medios físicos para romper la matriz de fibrina es también una fuerza de la gravedad aplicada de manera discontinua por medio de:
(i) la centrifugación de la composición de gel de fibrina con las plaquetas y/o los leucocitos incrustados en una
matriz de fibrina, y que comprende un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuesto entre medias de la matriz de fibrina, a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 500 g;
(ii) la recuperación del sobrenadante de la etapa (i), que constituye parcialmente el sobrenadante SN2; y (iii) la centrifugación de la composición de gel de fibrina restante a una fuerza de la gravedad comprendida entre 1.500 y 2.500 g y la recuperación del sobrenadante de la etapa (iii), que constituye parcialmente el sobrenadante SN2, constituyendo los sobrenadantes de las etapas (ii) e (iii) el sobrenadante completo SN2, que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación.
Como alternativa, los medios físicos para romper la matriz de fibrina es una fuerza de gravedad aplicada como un gradiente creciente continuo de fuerza de la gravedad de 400 g a 2.500 g.
Para que sea de la coagulación adecuada y la formación adecuada de citocinas adicionales, el suero/sobrenadante de la etapa (c) y la composición que comprende fibrinógeno y plaquetas y/o leucocitos, en particular, se mezclan en proporciones adecuadas. Por lo tanto, en una realización particular, la proporción del suero de la etapa (c) y la composición indicada está comprendida entre 10:1 y 1:1.
Por otro lado, cabe señalar que cualquier formación de coágulos (composición de gel de fibrina) es esencial para desencadenar la producción de citocinas correctamente. La velocidad de formación de coágulos depende de los factores de coagulación del donante o de la muestra aislada. Sin embargo, si el suero SN2 resultante tiene que administrarse finalmente al sujeto (es decir, en un quirófano, por ejemplo), la formación de coágulos debe ser rápida para que el proceso se lleve a cabo en poco tiempo. Por lo tanto, en una realización más preferida, el coágulo o la composición de gel de fibrina con las plaquetas y/o los leucocitos incrustados en una matriz de fibrina y que comprende un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuestos entre la matriz de fibrina se produce en un tiempo inferior a un minuto. Lo mismo se aplica con respecto al coágulo de la etapa (a) si el sobrenadante SN1 (suero) se usa además en el tratamiento de un sujeto en un quirófano.
La degradación de la matriz de fibrina se puede producir por medios mecánicos o por métodos bioquímicos o biológicos, tales como por centrifugación, agitación o adición de enzimas. Sin embargo, la adición de elementos foráneos puede causar contaminación en las muestras, o la inclusión de elementos no compatibles con el organismo que finalmente recibirá los sueros para su uso en cualquier tratamiento. Por lo tanto, la degradación de la fibrina se realiza ventajosamente por medios físicos tales como agitación o centrifugación. Esta agitación o centrifugación debe llevarse a cabo con una intensidad suficiente para degradar la matriz de fibrina sin causar el deterioro de otros factores significativos en el suero final. Por lo tanto, en otra realización más preferida, la degradación de la fibrina de la etapa (f) se realiza mediante centrifugación de 400 g a 2.000 g.
En una realización particular y específica del método de la invención, cuando se añade una composición que comprende plaquetas y/o leucocitos y fibrinógeno, el método comprende las etapas de:
- mezclar el sobrenadante o suero obtenido en la etapa (c) con una composición seleccionada a partir de un plasma rico en plaquetas, un concentrado de plaquetas, un plasma rico en concentrado, un concentrado de leucocitos, un plasma pobre en plaquetas y un plasma concentrado;
- añadir CaCl2 a la mezcla de la etapa anterior a una concentración de CaCl224 µmol/ml al 10 % (4 mg/ml) en la muestra o cantidades equivalentes de otra fuente de calcio soluble;
- permitir o esperar la formación de un coágulo en la mezcla;
- degradar la matriz de fibrina del coágulo formado en la etapa anterior por medios físicos, bioquímicos o biológicos;
- obtenerse el sobrenadante o las muestras de suero derivadas de las combinaciones de las etapas anteriores; y - añadir calcio ionizado a una concentración final comprendida entre 1,1 y 1,4 µmol/ml (4,5-5,6 mg/dl) y ajustar el pH entre 7,2 y 7,6.
Todas estas variantes del método de la invención permiten la producción de sueros o de composiciones de gel de fibrina, con altas concentraciones de citocinas y factores de coagulación como se expone en los ejemplos anteriores. En otra realización, las composiciones farmacéuticas que comprenden los sueros, o como alternativa, las composiciones de gel de fibrina de la invención, son aquellas en las que además de cualquier vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, comprenden un ingrediente seleccionado del grupo que consiste en células madre, células del sistema inmunitario, un plasma rico en plaquetas, un concentrado de plaquetas, un plasma rico en leucocitos, un concentrado de leucocitos, un plasma pobre en plaquetas, un concentrado de plasma y mezclas o combinaciones de los mismos.
La activación del componente celular de estos tipos de composiciones puede tener lugar de forma espontánea o puede ser ayudado por la adición de una fuente de calcio en el momento de uso o en un momento adecuado anterior al uso de las composiciones, como se ha expuesto anteriormente.
Los sueros que se pueden obtener mediante el método de la invención se pueden usar independientemente o junto
con otros elementos conocidos por los expertos, por ejemplo, para conservar o mantener las propiedades del suero, o para complementar su actividad. Las composiciones que comprenden estos elementos adicionales tienen la misma utilidad que el suero de la invención. Los ejemplos de elementos que pueden incluirse en estas composiciones son elementos que mejoran la actividad del suero, o vehículos que pueden funcionar como soporte o armazón para una mejor aplicación del suero. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de aquí en adelante, composición de la invención que comprende el suero de la invención. En una realización preferida, estas composiciones comprenden además fibrina, sellante de fibrina, Tachosil, matriz hemostática FloSeal®, agentes hemostáticos a base de gelatina, parches hemostáticos quirúrgicos, ácido hialurónico, glicosaminoglucanos, alginatos, colágeno, glucógeno, glucosamina, ácido glucurónico, amilosa, dextrinas, poli (alfa-hidroxiácidos) y copoliésteres de ácido láctico y ácido glicólico (láctico), polietilenglicol, almidón de hidroxietilo y variantes, quitina y quitosán, dextrano, polietilenglicol y derivados cianoacrilatos, polipropileno, liposomas de moléculas relacionadas con PEG/dextrano/L-DOPA, liposomas, híbrido de liposoma-hidrogel, proteína morfogénica ósea (BMP), factores de crecimiento, netrina-1, MMP7, matriz bioactiva compuesta de moléculas activas, silicona, poli(carbonato de DTE), Matrigel®, micropartículas de hidrogel, materiales biocerámicos, glutaraldehído, sulfato de condroitina y/o polisulfato de pentosano.
Los sueros o, como alternativa, las composiciones de gel de fibrina, o, como alternativa, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención son para su uso como un medicamento. En una realización particular de este aspecto de la invención, los sueros, o las composiciones de gel de fibrina o las composiciones farmacéuticas que comprenden citocinas y factores de coagulación, son para su uso en el tratamiento de una enfermedad o patología seleccionada del grupo que consiste en una patología inflamatoria, una enfermedad degenerativa, una enfermedad causada por isquemia, una enfermedad vascular, un proceso patológico inmunológico y un traumatismo. Los ejemplos de patologías inflamatorias incluyen artritis reumatoide, que es también un proceso patológico inmunológico (enfermedad autoinmune); artritis y tendinitis. Las enfermedades degenerativas incluyen osteoporosis, esclerosis múltiple y distrofia muscular. Las enfermedades vasculares incluyen aterosclerosis, la enfermedad vascular periférica (PVD) y la enfermedad de la arteria renal. Los procesos patológicos inmunológicos incluyen el lupus eritematoso sistémico, la diabetes de tipo 1 y el síndrome de Guillain-Barré. Las enfermedades causadas por isquemia incluyen enfermedad arterial periférica (PAD), apoplejía y cardiopatías. Estas enfermedades son aquellas cuyo origen se debe a una restricción en el suministro de sangre a los tejidos, causando una escasez de oxígeno y glucosa necesarios para el metabolismo celular. Por último, el traumatismo se relaciona con lesiones causadas por accidentes o intervenciones quirúrgicas.
Esta realización particular también pueden formularse como el uso de los sueros según lo definido anteriormente, o de las composiciones de gel de fibrina como se ha definido anteriormente, o de las composiciones farmacéuticas como se ha definido anteriormente, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o patología seleccionada del grupo que consiste en una patología inflamatoria, una enfermedad degenerativa, una enfermedad causada por isquemia, una enfermedad vascular, un proceso patológico inmunológico y un traumatismo. La presente invención también se refiere a un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o patología seleccionada del grupo que consiste en una patología inflamatoria, una enfermedad degenerativa, una enfermedad causada por isquemia, una enfermedad vascular, un proceso patológico inmunológico y un traumatismo, que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de cualquiera de los sueros como se ha definido anteriormente, o de la composición de gel de fibrina junto con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables, en un sujeto que los necesita, incluyendo un ser humano.
En una realización particular, los sueros de la invención o cualquier composición que comprende los mismos (por ejemplo, las composiciones de gel de fibrina), son para su uso en cualquiera de las patologías enumeradas anteriormente, en la que la enfermedad o patología es en una zona del cuerpo seleccionada del grupo que consiste en el aparato locomotor, en el sistema osteoarticular, en la piel, en las mucosas, en el sistema vascular, en el sistema cardiovascular, en el sistema reproductor, en el sistema ocular, en el sistema gastrointestinal, en el sistema auditivo, en el sistema nervioso central, en el sistema nervioso periférico y en el sistema inmunitario.
De hecho, los sueros, la composición de gel de fibrina y/o las composiciones farmacéuticas son, especialmente, para el tratamiento de las heridas. Usando estos productos de acuerdo con la invención (sueros, geles y composiciones farmacéuticas), los tejidos lesionados se reparan o regeneran rápidamente.
Las heridas se definen como lesiones en una zona del cuerpo de un ser humano o animal. Aunque la mayoría de las heridas conocidas son las producidas en la superficie de la piel, las superficies internas de los órganos también pueden lesionarse, por ejemplo, mediante cirugía o ruptura debido a un traumatismo. Con los sueros de la invención, se puede curar cualquier herida, ya sea externa o interna, gracias a la facultad de proporcionar en la herida o cerca todos esos componentes para una curación acelerada.
Por lo tanto, en otra realización particular, los sueros y las composiciones (composiciones de gel de fibrina y composiciones farmacéuticas) de la invención son para su uso como órgano y/o tejido reparador y agentes regenerativos.
También en otra realización particular, los sueros, así como las composiciones de gel de fibrina (o cualquier composición farmacéutica que comprenda las mismas) se pueden usar en el tratamiento de cicatrices, tales como cicatrices epidérmicas, ya que las citocinas presentes en los sueros o las composiciones en grandes cantidades son, además, capaces de potenciar una correcta cicatrización y la reversión de cualquier cicatriz patológica (es decir, queloides) o antiestética.
Aún en otra realización particular, los sueros y las composiciones que los comprenden son para su uso como agentes capaces de activar y/o potenciar la angiogénesis y/o vasculogénesis.
Los sueros de la invención, o las composiciones de gel de fibrina, son para su uso en la modulación y regulación de enfermedades inflamatorias, enfermedades inmunitarias, la modulación y la regulación de la regeneración de tejidos. En el sentido de la invención, la modulación y regulación significa afectar al equilibrio, y a las cantidades de las moléculas y células que participan en los procesos inflamatorios que finalmente conducen a la reparación o recuperación de tejidos lesionados debido a cualquier etiología (traumatismo, enfermedad inmunitaria, etc.).
La expresión reparación o recuperación de tejido significa que el tejido u órgano adquiere lo perdido debido a las funciones bioquímicas y fisiológicas afectadas, y a las características morfológicas afectadas.
La invención también engloba una composición líquida "ex vivo" de perfusión de órganos que comprende, como ingrediente, el suero rico en citocinas (SN1 o SN2) como se define anteriormente o cualquier composición líquida que comprende este suero rico en citocinas.
De forma destacable, los sueros (SN1, SN2) de la invención tienen utilidad para aumentar la compatibilidad de los órganos perfundidos que se incorporan en el suero de la invención antes de la implantación en un paciente. Esta utilidad se mejora aún más cuando el suero que se puede obtener mediante el método de la invención procede del receptor del órgano del trasplante. Las citocinas regulan tanto las respuestas inflamatorias como la respuesta inmunitaria específica. Se producen cambios inflamatorios en el trasplante de órganos como resultado del traumatismo tisular y de la lesión por isquemia/reperfusión en el órgano donante y en el momento de la operación de trasplante. En total, las citocinas desempeñan un papel importante en la mediación de estos cambios. Estos cambios inflamatorios pueden no solo afectar a la función del injerto, sino también influir en la inmunogenicidad del rechazo y la vulnerabilidad del injerto. Las citocinas orquestan la respuesta inmunitaria específica inducida por el trasplante de órganos.
La identificación y medición de las citocinas circulantes en los fluidos biológicos producidos en el trasplante de órganos puede ayudar en el diagnóstico del rechazo de injertos y otras complicaciones tras un trasplante. La isquemia orgánica y la lesión por reperfusión determinan en parte la supervivencia del injerto a corto y largo plazo. Las condiciones de conservación del órgano parecen desempeñar un papel decisivo. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de un suero que se puede obtener mediante el método de la invención para mantener la perfusión de órganos o "ex vivo".
Los sueros SN1 y SN2 se pueden obtener mediante los métodos de la invención, presentan las características óptimas para su uso como medios en los que mantener o reproducir células de diferenciación, ya que comprende los elementos necesarios para esta función, la mayoría de las citocinas y factores de crecimiento. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de un suero que se puede obtener mediante el método de la invención como medio de cultivo celular in vitro o ex vivo.
Otro aspecto de la invención es un suero rico en citocinas SN1 o SN2 como se ha definido anteriormente o cualquier composición que lo comprende, para su uso como un agente de proliferación celular y/o de diferenciación celular in vitro y/o ex vivo y/o in vivo.
El método de la invención se puede realizar manualmente por un técnico, o puede llevarse a cabo de manera totalmente automatizada. Esto se puede hacer usando un dispositivo médico que comprenda de manera integrada muchas tecnologías, tales como mecánicas, eléctricas, electromecánicas, electrónicas, hidráulicas, ópticas (escáner, láser), ondas y radiofrecuencia. Los elementos físicos del dispositivo incluyen bombas, centrifugadoras, sensores, detectores, transductores y/o software de control y monitorización. El método también se puede realizar empleando dispositivos médicos de un solo uso que pueden ir juntos o por separado y conectados a equipos eléctricos que sean de un solo uso, estériles y no pirogénicos. Está compuesto de plásticos, polímeros, derivados de los mismos o similares. La principal razón para usar este dispositivo es el control de las infecciones y para evitar la transmisión de agentes infecciosos a operadores y pacientes. Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un dispositivo electromédico y/o desechable para realizar el método de la invención.
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones, el término "comprende" y las variaciones del término, no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Además, el término "comprende" abarca el caso de "que consiste en". Objetos adicionales, ventajas y características de la invención resultarán obvias
para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las combinaciones posibles de realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos específicos proporcionados en la presente patente ilustran la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitaciones de la invención reivindicada. Por lo tanto, los ejemplos descritos a continuación ilustran la invención sin limitar el alcance de la misma. A continuación, se ilustrará la invención mediante pruebas realizadas por los inventores, que muestran la utilidad del método de la invención como suero obtenido.
EJEMPLO 1. Preparación de los sueros.
Los diferentes sueros y combinaciones de los mismos se obtuvieron de la siguiente manera:
Se obtuvo sangre venosa de cinco (5) donantes; se incluyeron tres varones y dos mujeres sanos voluntarios en este estudio o determinación, con una edad media de ± DT, 31,6 ± 10,9 años. Los criterios de inclusión eran adultos sanos que aceptaran participar libremente en el estudio, y los criterios de exclusión eran tener antecedentes médicos de no haber padecido ninguna enfermedad hematológica o enfermedad derivada de la sangre, o no haber sido tratados con ningún medicamento que pudiera afectar a o alterar la función de algún elemento o componente hemático, en especial, plaquetas y factores de coagulación durante un mínimo de 2 semanas antes de la prueba. Se recogió sangre en tubos de 9 ml (Vacuette, ref. 455322) que contenían citrato de sodio al 3,2 % como anticoagulante, y tubos de 9 ml (Terumo, VENOSAFE ref. VF-109SP), vacíos sin contenido, aditivo o anticoagulante. Se obtuvieron cuatro tubos por donante, un total de 36 ml de sangre periférica. Tras la extracción de sangre de las muestras (tubos) sin aditivos o sin anticoagulante (Terumo, VENOSAFE ref. VF-109SP), se añadió CaCl2 a una concentración final en la muestra de 15 µmol/ml (solución al 10 % (2,5 mg/ml), llegando a 135 moles de CaCl2 total. El promedio de plaquetas y leucocitos iniciales o basales de los cinco donantes de acuerdo con las muestras de CBC fue de 268,6 x109/l y de 8,6 x109/l, respectivamente. Todas las muestras resultantes de los diversos preparados se mantuvieron durante 24 horas a 37 ºC. Tras este tiempo, se tomaron muestras para el análisis y la determinación de citocinas y factores de crecimiento.
Las muestras (tubos) con citrato de sodio, y los tubos de muestra sin citrato de sodio y con cloruro de calcio se centrifugaron a 150 g a la vez durante 10 min a temperatura ambiente con un rotor angular Cencom II (JP Selecta, modelo 7002240), con el objetivo para fraccionar la sangre en los tubos con citrato de sodio y de formar coágulos en los tubos sin citrato de sodio y con cloruro de calcio.
Para todos los preparados que figuran a continuación, se usó el rotor angular Cencom II (JP Selecta, modelo 7002240). En esto Rotor, 150 g son equivalentes a aprox.1.200 rpm; 450 g son equivalentes a aprox.2000 rpm; y 1.500 g son equivalentes a aprox.3.700 rpm.
Preparación de PRP: Tras el tiempo de centrifugación, se extrajo de la muestra (tubo) con citrato de sodio todo del sobrenadante (que contenía principalmente plasma y plaquetas o PRP "PRP") hasta la capa leucocítica (capa leucocítica) y se depositó en un tubo de vacío sin aditivos (muestra A). Se extrajeron 2 ml de esta muestra de PRP para el análisis de citocinas y factores de crecimiento.
Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP) y de concentrado de plaquetas (cPLT): Se reemplazó en la centrifugadora la muestra residual (principalmente, los glóbulos rojos) de los tubos de citrato de sodio por la "muestra A", y se dejó coagular la muestra sin anticoagulante durante cinco minutos.
Ambas muestras, la muestra A y los tubos sin citrato de sodio y con cloruro de calcio, se centrifugaron a 450g durante 10 min a temperatura ambiente. Después de esta centrifugación, apareció en la "Muestra A" (tubo) un sedimento o sedimentación de plaquetas y PPP sobrenadante pobre en plaquetas. El PPP sobrenadante de la "muestra A" se extrajo dejando en el tubo los 2 ml restantes, que era un concentrado de plaquetas (cPLT). Las plaquetas se agitaron y se produjo desagregación. Luego, se homogeneizó la muestra y se dejó reposar. Se obtuvieron 2 ml de cada una de las muestras, PPP y cPLT para el análisis de citocinas y factores de crecimiento. Preparación de suero rico en citocinas (SRC, también denominado SN1): A partir de una muestra de sangre sin anticoagulante y con 15 µmol/ml de CaCl2 (10 %), previamente centrifugada a 150 g, se extrajo el sobrenadante liberado del coágulo formado en una centrifugación a 450 g, quedando la mayor parte del coágulo formado que aún no se había degradado. Se dispuso el sobrenadante en un tubo vacío sin aditivos (muestra B). Luego, se centrifugó el coágulo en reposo sin anticoagulante a 1.500 g durante 10 min. Después de esta centrifugación, se retiró el sobrenadante y se mezcló con la "Muestra B", enriqueciendo los sueros con citocinas (SRC; SN1). Se extrajeron 2 ml para el análisis de citocinas y factores de crecimiento.
Preparación de plasma rico en leucocitos (PRL): En una muestra de sangre periférica anticoagulada (tubos de 9 ml (Vacuette, ref. 455322) que contenía citrato de sodio al 3,2 %), se añadió almidón de hidroxietil HES al 20 % v/v (Hes Grifols "6 %) sobre el volumen de la muestra. Se dejó reposar el tubo en posición vertical durante 30 min. Después de este tiempo, se observó una sedimentación de los eritrocitos y un sobrenadante de leucocitos. Se retiró el sobrenadante y se centrifugó a 700 g durante 10 min. A continuación, se retiró el sobrenadante. Se eliminó un resto de 2 ml del tubo y se agitó para desagregar los leucocitos y homogeneizar la muestra.
Preparación de PRP liberado y cPTL liberado: A una muestra de PRP y a una muestra de cPLT,se añadió cloruro de calcio hasta una concentración final de 24 µmol/ml (de una solución de CaCl2 al 10 % p/p). Se dejaron reposar los tubos para formar un coágulo y se mantuvieron durante 24 horas a 37 ºC. Después de este tiempo, se tomaron muestras de cada uno de los líquidos para el análisis de citocinas y factores de crecimiento. La expresión "fracción liberada" se describe como el líquido o el sobrenadante resultante de la activación de plaquetas y la coagulación de un coágulo formado y la degradación de la fibrina.
Preparación de suero SRC1 (un tipo o una realización particular de SN2) derivado de SRC (SN1) y PRP: Se preparó una mezcla de SRC y PRP en una proporción de 1:1, y se añadió cloruro de calcio (CaCl2 al 10 %) para alcanzar una concentración de aproximadamente 24 µmol/ml sobre el volumen de PRP para formar un coágulo (matriz de fibrina). Se procedió con la misma técnica de centrifugación doble (patrón de centrifugación particular de la etapa (b) para el método de obtención de SN1, en la que se aplica una fuerza de la gravedad de 400 g a 2.500 g) y la retirada del sobrenadante usado para realizar el SRC. Es decir, 10 min de centrifugación a 450 g, retirada del sobrenadante, 10 min de centrifugación del coágulo en reposo a 1.500 g, extracción del sobrenadante y mezcla de ambos. Esta técnica permitió romper el coágulo (matriz de fibrina) aplicando determinadas fuerzas de la gravedad de un modo discontinuo. Se dejó reposar la muestra durante 24 horas a 37 ºC y se tomó una muestra para el análisis de citocinas y factores de crecimiento.
Preparación de suero SRC2 (un tipo o una realización particular de SN2) derivado de SRC (SN1) y cPLT. Se preparó una mezcla de cPLT y SRC en una proporción de 1:1, y se mezcló la muestra y cPLT SRC en una proporción de 1:1, y se añadió cloruro de calcio (CaCl2) al 10 % hasta una concentración de aproximadamente 24 µmol/ml sobre el volumen de cPLT. Se dejó reposar para formar un coágulo (matriz de fibrina). Luego se procedió con la misma técnica de centrifugación doble (patrón de centrifugación particular de la etapa (b) para el método de obtención de SN1, en la que se aplica una fuerza de la gravedad de 400 g a 2.500 g) y la retirada del sobrenadante usado para realizar el SRC. Es decir, 10 min de centrifugación a 450 g, retirada del sobrenadante, 10 min de centrifugación del coágulo en reposo a 1.500 g, extracción del sobrenadante y mezcla de ambos. Esta técnica permitió romper el coágulo (matriz de fibrina) aplicando determinadas fuerzas de la gravedad de un modo discontinuo. Se dejó reposar la muestra durante 24 horas a 37 ºC y se tomó una muestra para el análisis de citocinas y factores de crecimiento.
Preparación de suero SRC3 (un tipo o una realización particular de SN2) derivado de PRL SRC (SN1) PPP. Se preparó una mezcla de SRC, PRL y PPP en una proporción de 1:1:1. Luego se añadió cloruro de calcio (CaCl2 al 10 %) hasta alcanzar una concentración de 24 µmol/ml sobre la suma de los volúmenes de muestra de PRL y PPP. La mezcla se dejó reposar hasta la formación de un coágulo (matriz de fibrina). Luego se procedió con la misma técnica de centrifugación doble (patrón de centrifugación particular de la etapa (b) para el método de obtención de SN1, en la que se aplica una fuerza de la gravedad de 400 g a 2.500 g) y la retirada del sobrenadante usado para realizar el SRC. Es decir, 10 min de centrifugación a 450 g, retirada del sobrenadante, 10 min de centrifugación del coágulo en reposo a 1.500 g, extracción del sobrenadante y mezcla de ambos. Esta técnica permitió romper el coágulo (matriz de fibrina) aplicando determinadas fuerzas de la gravedad de un modo discontinuo. Se dejó reposar la muestra durante 24 horas a 37 ºC y se tomó una muestra para el análisis de citocinas y factores de crecimiento.
Preparación de suero SRC4 (un tipo o una realización particular de SN2) derivado de SRC (SN1) PRP PRL: Se preparó una mezcla de SRC, PRP y PRL en una proporción de 1:1:1. Luego se añadió cloruro de calcio (CaCl2 al 10 %) hasta alcanzar una concentración de 24 µmol/ml sobre la suma de los volúmenes de muestra de PRP y PRL. La mezcla se dejó reposar hasta la formación de un coágulo (matriz de fibrina). Luego se procedió con la misma técnica de centrifugación doble (patrón de centrifugación particular de la etapa (b) para el método de obtención de SN1, en la que se aplica una fuerza de la gravedad de 400 g a 2.500 g) y la retirada del sobrenadante usado para realizar el SRC. Es decir, 10 min de centrifugación a 450 g, retirada del sobrenadante, 10 min de centrifugación del coágulo en reposo a 1.500 g, extracción del sobrenadante y mezcla de ambos. Esta técnica permitió romper el coágulo (matriz de fibrina) aplicando determinadas fuerzas de la gravedad de un modo discontinuo. Se dejó reposar la muestra durante 24 horas a 37 ºC y se tomó una muestra para el análisis de citocinas y factores de crecimiento.
Preparación de suero SRC5 (un tipo o una realización particular de SN2) derivado de cPLT SRC (SN1) PRL: Se preparó una mezcla de SRC, cPLT y PRL en una proporción de 1:1:1. Luego se añadió cloruro de calcio (CaCl2 al 10 %) hasta alcanzar una concentración de 24 µmol/ml sobre la suma de los volúmenes de muestra de PRL y cPLT. La mezcla se dejó reposar hasta la formación de un coágulo (matriz de fibrina). Luego se procedió con la misma técnica de centrifugación doble (patrón de centrifugación particular de la etapa (b) para el método de obtención de SN1, en la que se aplica una fuerza de la gravedad de 400 g a 2.500 g) y la retirada del sobrenadante usado para realizar el SRC. Es decir, 10 min de centrifugación a 450 g, retirada del sobrenadante, 10 min de centrifugación del
coágulo en reposo a 1.500 g, extracción del sobrenadante y mezcla de ambos. Esta técnica permitió romper el coágulo (matriz de fibrina) aplicando determinadas fuerzas de la gravedad de un modo discontinuo. Se dejó reposar la muestra durante 24 horas a 37 ºC y se tomó una muestra para el análisis de citocinas y factores de crecimiento. EJEMPLO 2: Niveles de citocinas en diferentes células y sueros que se pueden obtener mediante el método de la invención.
La cantidad de plaquetas y glóbulos blancos tanto de la sangre periférica como de las muestras se midió con un analizador automatizado diferencial CELL-DYN 1700 (División de Abbott Diagnostics, Santa Clara, CA).
El panel de citocinas y factores de crecimiento descritos en la Tabla 1 y 2 se determinó mediante ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a una enzima) usando kits Quantikine humanos (R & D Systems, Minneapolis, Minnesota). Se midieron varias citocinas en diferentes sueros obtenibles mediante el método de la invención (los del Ejemplo 1). En las Tablas 1 y 2, se muestran valores de diferentes citocinas, factores de crecimiento y células presentes en cada uno de los sueros analizados. En estas tablas, se observa que los sueros ricos en citocinas obtenidos mediante el método de la invención (SRC, SRC1 a SRC5) presentan una mayor concentración de citocinas en comparación con el plasma, PRP y PRP liberado, y cPLT liberado.
Tabla 1: Concentraciones de al unas citocinas en diversos derivados de lasma en un SRC.
Tabla 2: Concentraciones de diferentes citocinas en diversos sueros de acuerdo con la invención.
Por lo tanto, estas tablas muestran que el método de la invención es útil para la producción de suero que tiene altos niveles de citocinas a partir de una muestra aislada. Estos sueros, debido a los altos niveles de citocinas, tienen diversos y múltiples usos, como se ilustra en los siguientes ejemplos.
Los datos de las Tablas 1 y 2 se ilustran en la FIG. 1, FIG. 2, FIG. 3, FIG. 4 y FIG. 5. Allí, para cada una de las composiciones, se representan las concentraciones de algunas de las citocinas como se indica en la breve descripción de los dibujos. En cada una de las FIG. 1 a 5, cada barra que representa un tipo de composición probada para una citocina o un compuesto (S) específico indicado en el eje X se representa en el siguiente orden de izquierda a derecha: Plasma, PRP, PRP liberado, cPLT liberado, SRC, SRC+PRP, SRC+cPLT, SRC+PRL, SRC+PRP+PRL, SRC+cPLT+PRL.
EJEMPLO 3: Prueba demostrativa y comparativa de varias dosis de SRC humano que se puede obtener mediante el método de la invención. Acción sobre la proliferación de células de la médula ósea.
Por medio de este ensayo se determinó el grado de proliferación de las células de médula ósea con diferentes dosis de suero rico en citocinas (SRC) obtenido mediante el método descrito en la presente patente. Este ejemplo ilustra los efectos del suero SRC2 (un tipo o realización particular de SN2), ya que parece ser el más apropiado debido a la concentración de citocinas y al equilibrio entre citocinas (tipos de citocinas).
Se cultivaron células de médula ósea en tres condiciones de cultivo diferentes, y se sembraron uniformemente en placas de Petri con una densidad de 200 células/cm2 durante 15 días. Se obtuvieron muestras de células de la médula ósea a partir de aspirados de médula ósea de 3 pacientes/donantes. Los aspirados eran para la regeneración del tejido óseo, de varones de 28 a 44 años con una edad media de 36 años. Se obtuvo el consentimiento de estos pacientes/donantes de acuerdo con los estándares éticos del comité de ética local. Tras recoger las células adherentes, se contaron y se realizaron estudios de expresión celular del antígeno de superficie celular.
Se determinó la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano (Sigma-Aldrich), y se contaron las células usando un cámara de Neubauer (Marienfeld GmbH, Lauda-Königshofen, Alemania).
El suero rico en citocinas (SRC2) demostró ser un medio significativamente mejor que el suero de ternera fetal (FCS) para la proliferación de células de médula ósea a todas las concentraciones estudiadas de SRC2 (FIG.6A, 6B y 7). Estos datos se pueden derivar directamente de la FIG. 6A, en la que se representa el número de células de la médula ósea (eje Y) en varios momentos (T en días, d). Las células se cultivaron en medios basales complementados con suero de ternera fetal (FCS; el control) o complementados con diferentes concentraciones ((10, 20, 50 y 80 % p/p) de un suero rico en citocinas, SRC2, de la invención. El panel (A) muestra el número de células a lo largo del tiempo en las diferentes condiciones analizadas (% diferente del suero de la invención). En el
Panel (B), se muestra la duplicación acumulada de células en contacto con los diferentes medios.
Con el fin de hacer más visible el efecto del suero de la invención, en la FIG.7, se representan diferentes imágenes de microscopio electrónico (x 100) de las células de la médula ósea cultivadas como se indica en la FIG. 6. La morfología celular se mantiene en todos los ensayos. Las cantidades crecientes de SRC2 aumentan el número total de células por campo (densidad celular).
El inmunofenotipo de las células se realizó por citometría de flujo (citómetro de flujo FACScan - software CellQuest (Becton Dickinson)), usando los siguientes anticuerpos antihumanos de ratón conjugados: CD45, CD34, CD90, CD166, CD105 (Immunotech-Coulter). Los resultados se presentan en las FIG.8 y 9.
La FIG. 8 es un diagrama con el análisis fenotípico de las células de la médula ósea sometidas a las condiciones indicadas en las FIG.6 y 7. El fenotipo se determinó por los niveles de expresión de varios antígenos de membrana o marcadores para cada una de las condiciones ensayadas (eje X). El eje Y muestra el número de células de cada fenotipo. marcador de leucocitos CD45; marcador hematopoyético CD34; marcador de linaje mesenquimal CD90; marcador de linaje estromal CD166; y marcador del linaje endotelial CD105.
La FIG. 9 representa la evolución cinética de las diferentes poblaciones celulares en cultivos de células de médula ósea a lo largo del tiempo (eje X, T en días (d)). En el eje Y,se indica el porcentaje de cada tipo de célula con respecto al total de células en el medio. Se puede observar que, a lo largo del tiempo, el porcentaje de leucocitos (representado por las células con el marcador CD45) en la muestra inicial (de los aspirados de médula ósea) se reduce progresivamente. Por otro lado, el resto de los tipos de células aumenta. Estas células que se convirtieron en mayoría corresponden a células progenitoras o células madre también presentes en la muestra inicial de médula ósea. Por consiguiente, con el suero de la invención, estas células progenitoras podrían proliferar. Por consiguiente, la capacidad de proliferación celular de la médula ósea mediante estos tipos de células se mantuvo haciendo posible la regeneración del tejido óseo.
Como medio base, se usó medio de Eagle modificado por Dulbecco, que tiene niveles bajos de glucosa (DMEM-LG, Cambrex, Walkersville) y que tiene L-glutamina 4 mM (PAA, Pasching, Austria) y 0,05 unidades de penicilina y 0,05 g de estreptomicina (PAA). El medio base se complementó con:
(a) medio base con suero de ternera fetal al 10 % (FCS - Cambrex)
(b) medio base con SRC2 al 10 %
(c) medio base con SRC2 al 20 %
(d) medio base con SRC2 al 50 %
(e) medio base con SRC2 al 80 %.
Como se indica en la FIG. 7, la morfología y expansión de las células de la médula ósea (aumento x100) en diferentes porcentajes de SRC2 fue mayor que la de las células solo con FCS. Las células en medio de SRC2 mantuvieron su morfología durante los 15 días de cultivo. Además, la duplicación de la población y la velocidad de expansión celular aumentaron significativamente hasta el medio de saturación que contenía SRC2 en todas las muestras después de 12 días de cultivo. Estos resultados revelaron que los sueros ricos en citocinas (SRC2) derivados de la sangre contenían abundantes factores de crecimiento y diferenciación, siendo útiles como posibles elementos de proliferación de las células de la médula ósea.
La expresión de la población de marcadores de superficie celular analizada fue positiva en todas las condiciones de cultivo (FIG.8 y 9).
EJEMPLO 4: Uso de los sueros de la invención para la regeneración de tejidos.
Se realizaron tres análisis usando el suero de la invención para la regeneración de varios tipos de tejido dañado. En un paciente (52 años) con traumatismo craneofacial durante 12 años, pérdida ósea masiva, dolor crónico, disfunción oral y osteomielitis, se realizó una elevación del seno bilateral con múltiples infiltraciones (inyecciones) que contenían fosfato tricálcico y SRC2 alrededor de las lesiones. En la Fig. 10, se muestra cómo tuvo lugar la regeneración ósea en un corto período de tiempo (6 meses) debido a la infiltración con SRC2. El panel A es la imagen de MRI tomada tras la elevación del seno, y el panel B muestra la zona (área) tratada con infiltraciones durante 6 meses (una infiltración por mes).
En otro paciente varón (32 años de edad) que padecía fractura del escafoides y cúbito de la mano derecha, que había sido sometido a la inmovilización de un miembro durante un tiempo sin éxito, se llevó a cabo la fijación por cirugía usando material de osteosíntesis y se asoció una resección del cúbito distal. Se realizaron infiltraciones posquirúrgicas en el cúbito con suero rico en citocinas (SRC2) que apoyó la regeneración de tejido óseo (cuatro dosis de 6 ml en la zona a afectada cada veinte días). Como se muestra en la FIG. 11, la región de regeneración ósea fue satisfactoria y la movilidad de la muñeca y la fuerza muscular se restablecieron de manera satisfactoria. El
paciente se volvió asintomático y pudo realizar una vida normal.
El tercer paciente es una mujer (24 años), que presenta un queloide durante dos años. Las cicatrices queloides son una anomalía de la curación, y se definen como una cicatriz anormal que crece más allá del límite de la superficie original de la lesión de la piel. Aunque cualquiera puede tener una cicatriz queloide, algunos grupos étnicos tienen un mayor riesgo de desarrollarlas. No se entiende por completo la etiología ni cómo se forman las cicatrices queloides. El traumatismo de la piel parece ser la causa más común, aunque a veces se pueden formar y no parece haber una relación causal aparente. Existe una predisposición genética o un factor genético heredado para desarrollar cicatrices queloides. Otras causas incluyen la deficiencia o el exceso de producción y la liberación de melanina (melanogénesis) por los melanocitos de la piel, la disminución de las tasas de colágeno maduro y el aumento de las cantidades de colágeno soluble, o el bloqueo de los vasos sanguíneos con la consiguiente falta de oxígeno en el tejido dérmico y epidérmico. Se estableció un tratamiento con tres dosis de infiltración en la lesión con 4 ml de suero rico en citocinas (SRC2) cada 10 días. Como se muestra en la FIG.12, se producen claramente la regeneración y la curación adecuada de los tejidos. No se observaron reacciones adversas ni irritación de la piel en la zona tratada. Referencias citadas en la solicitud
- US 20050252867
- Isogai et al. en "Cytokine-Rich Autologous Serum System for Cartilaginous Tissue Engineering", Annals of Plastic Surgery - 2008, Vol. n.º 60, pág.: 703-709.
- Su et al. en "In vitro release of growth factors from platelet-rich fibrin (PRF): a proposal to optimize the clinical applications of PRF", Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral radiol Endod - 2009, Vol. No.108, pág.: 56-61.
Claims (16)
1. Un método de preparación de un suero que comprende citocinas y factores de coagulación, método que comprende las siguientes etapas:
(a) someter una muestra biológica aislada que comprende plaquetas y/o leucocitos a una fuerza de la gravedad comprendida entre 100 y 200 g, obteniéndose un primer coágulo y un sobrenadante;
(b) someter solo el coágulo o, como alternativa, el coágulo y el sobrenadante de la etapa (a) a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 2.500 g, obteniéndose un sobrenadante SN1; en el que la fuerza de la gravedad se aplica de manera discontinua y se lleva a cabo por medio de:
(i) la centrifugación del coágulo de la etapa (a), o como alternativa, del coágulo y del sobrenadante, a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 500 g;
(ii) la recuperación del sobrenadante de la etapa (i), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1ii; (iii) la centrifugación del coágulo restante a una fuerza de la gravedad comprendida entre 1.500 y 2.500 g y la recuperación del sobrenadante de la etapa (iii), que constituye parcialmente el sobrenadante SN1iii de la etapa (b), constituyendo los sobrenadantes de las etapas (ii) e (iii) el sobrenadante completo SN1; y
(c) la recuperación de dicho sobrenadante SN1 de la etapa (b), que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación,
en la que la fuerza de la gravedad se aplica mediante un proceso seleccionado del grupo que consiste en centrifugación y succión física.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que, antes de la etapa (b), el coágulo o, como alternativa, el coágulo y el sobrenadante de la etapa (a) se someten a una fuerza de la gravedad comprendida entre 1 g y 10 g.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que, tras la etapa (c), se realiza una etapa (d) adicional de ajuste del calcio iónico a una concentración final de 1,0 µmol/ml a 50,0 µmol/ml y del pH de la solución final a un pH comprendido entre 7,0 y 7,6, mediante la adición de una fuente de calcio iónico al sobrenadante recuperado y, opcionalmente, un agente de ajuste del pH.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la fuerza de la gravedad se aplica por centrifugación.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además:
- mezclar el sobrenadante SN1 de la etapa (c) con una composición que comprende fibrinógeno, plaquetas y/o leucocitos seleccionados del grupo que consiste en un plasma rico en plaquetas, un concentrado de plaquetas, un plasma rico en leucocitos, un concentrado de leucocitos, un plasma pobre en plaquetas, un concentrado de plasma y mezclas o combinaciones de los mismos;
- añadir a la mezcla de la etapa anterior una fuente de calcio iónico para ajustar el calcio iónico a una concentración final de 1,0 µmol/ml a 50,0 µmol/ml, obteniéndose un segundo coágulo, que es una composición de gel de fibrina que comprende plaquetas y/o leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, comprendiendo dicho gel también un suero con citocinas y factores de coagulación en forma líquida dispuesto entre la matriz de fibrina.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además las etapas de
- someter el segundo coágulo, que es una composición de gel de fibrina que comprende plaquetas y/o leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, a medios físicos y/o químicos y/o bioquímicos para romper la matriz de fibrina mediante estos medios, obteniéndose un sobrenadante SN2; y
- recuperar el sobrenadante SN2, que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que se usa una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 2.500 g como medio físico para romper la matriz de fibrina.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que los medios físicos son la centrifugación.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que el medio físico para romper la matriz de fibrina es una fuerza de la gravedad aplicada de manera discontinua por medio de:
(I) la centrifugación del coágulo formado por las plaquetas y/o los leucocitos incrustados en una matriz de fibrina a una fuerza de la gravedad comprendida entre 400 g y 500 g;
(ii) la recuperación del sobrenadante de la etapa (i), que constituye parcialmente el sobrenadante SN2; y (iii) la centrifugación del coágulo restante a una fuerza de la gravedad comprendida entre 1.500 y 2.500 g y la recuperación del sobrenadante de la etapa (iii), que constituye parcialmente el sobrenadante SN2, constituyendo los sobrenadantes de las etapas (ii) e (iii) el sobrenadante completo SN2, que es un suero que comprende citocinas y factores de coagulación.
10. Un suero que comprende citocinas y factores de coagulación que se puede obtener mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
11. Una composición de gel de fibrina que comprende plaquetas y/o leucocitos incrustados en una matriz de fibrina, comprendiendo también dicho gel un suero con citocinas y factores de coagulación, que se puede obtener mediante el método de acuerdo con la reivindicación 5.
12. Un suero que comprende citocinas y factores de coagulación que se puede obtener mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-9.
13. Una composición farmacéutica que comprende el suero según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12, o que comprende la composición de gel de fibrina según lo definido en la reivindicación 11 junto con vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
14. Un suero como se define en la reivindicación 10 o, como alternativa, un suero como se define en la reivindicación 12 o, como alternativa, una composición de gel de fibrina como se define en la reivindicación 11 o, como alternativa, una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 13, para su uso como un medicamento.
15. El suero como se define en la reivindicación 10 o, como alternativa, el suero como se define en la reivindicación 12 o, como alternativa, la composición de gel de fibrina como se define en la reivindicación 11 o, como alternativa, la composición farmacéutica como se define en la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o patología seleccionada del grupo que consiste en una patología inflamatoria, una enfermedad degenerativa, una enfermedad causada por isquemia, una enfermedad vascular, un proceso patológico inmunológico y un traumatismo.
16. El suero como se define en la reivindicación 10 o, como alternativa, el suero como se define en la reivindicación 12 o, como alternativa, la composición de gel de fibrina como se define en la reivindicación 11 o, como alternativa, la composición farmacéutica como se define en la reivindicación 13, para su uso como un agente regenerativo y/o reparador de órganos y/o de tejidos.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13192928 | 2013-11-14 | ||
PCT/EP2014/074493 WO2015071364A1 (en) | 2013-11-14 | 2014-11-13 | Method for obtaining a cytokine-rich composition and composition obtained by means of this method |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2705704T3 true ES2705704T3 (es) | 2019-03-26 |
Family
ID=49578201
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES14798838T Active ES2705704T3 (es) | 2013-11-14 | 2014-11-13 | Método de obtención de una composición rica en citocinas y composición obtenida mediante este método |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20160263193A1 (es) |
EP (1) | EP3068410B1 (es) |
ES (1) | ES2705704T3 (es) |
WO (1) | WO2015071364A1 (es) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ITUB20160205A1 (it) * | 2016-02-05 | 2017-08-05 | Andrea Dominijanni | Metodo di preparazione di sangue periferico per l’ottenimento di un preparato con alte concentrazioni di fattori di crescita |
CN113797316A (zh) * | 2020-06-17 | 2021-12-17 | 是光隽恒(北京)生物科技有限公司 | 用于修复组织损伤的组合物及其制备方法和应用 |
CN114146096B (zh) * | 2021-11-25 | 2024-04-02 | 成都清科生物科技有限公司 | 一种富含细胞因子的条件血清的制备方法及应用 |
CN115125202B (zh) * | 2022-07-08 | 2023-08-04 | 上海揽微赛尔生物科技有限公司 | 一种自体血细胞因子和外泌体血清及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000062828A1 (en) * | 1996-04-30 | 2000-10-26 | Medtronic, Inc. | Autologous fibrin sealant and method for making the same |
WO2007027178A2 (en) * | 2005-08-30 | 2007-03-08 | Walker Mackie J Jr | Lyophilized platelet rich plasma for the use in wound healing and bone or tissue grafts or repair |
JP5577569B2 (ja) * | 2007-03-07 | 2014-08-27 | 株式会社ジェイ・エム・エス | 血清調製方法 |
WO2009052221A2 (en) * | 2007-10-15 | 2009-04-23 | The Regents Of The University Of Colorado | Methods for extracting platelets and compositions obtained therefrom |
WO2010118979A1 (en) * | 2009-04-07 | 2010-10-21 | Velin-Pharma A/S | Method and device for treatment of conditions associated with inflammation or undesirable activation of the immune system |
-
2014
- 2014-11-13 ES ES14798838T patent/ES2705704T3/es active Active
- 2014-11-13 EP EP14798838.0A patent/EP3068410B1/en active Active
- 2014-11-13 WO PCT/EP2014/074493 patent/WO2015071364A1/en active Application Filing
- 2014-11-13 US US15/036,052 patent/US20160263193A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3068410A1 (en) | 2016-09-21 |
US20160263193A1 (en) | 2016-09-15 |
WO2015071364A1 (en) | 2015-05-21 |
EP3068410B1 (en) | 2018-10-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2735139C2 (ru) | Полученные из лизата тромбоцитов человека внеклеточные везикулы для применения в медицине | |
US10441634B2 (en) | Treatment of peripheral vascular disease using protein solutions | |
US20180243376A1 (en) | Methods and non-immunogenic compositions for treating inflammatory disorders | |
US9878011B2 (en) | Treatment of inflammatory respiratory disease using biological solutions | |
JP6649257B2 (ja) | 濃厚血小板から誘導可能な生理活性組成物並びにその調製方法及び使用方法 | |
CA2916190C (en) | Treatment of collagen defects using protein solutions | |
ES2639561T3 (es) | Procedimiento de preparación de un concentrado de factores de crecimiento derivado de plaquetas humanas | |
EP2304023B1 (en) | Platelet fraction deriving from placental blood | |
Arora et al. | Platelet derived biomaterials for therapeutic use: review of technical aspects | |
ES2705704T3 (es) | Método de obtención de una composición rica en citocinas y composición obtenida mediante este método | |
JP2022186992A (ja) | 細胞拡大培養方法及び治療用組成物 | |
WO2018065092A1 (en) | Compositions comprising adjustable concentrations of growth factors derived from blood serum and clot hypoxia-conditioned medium and methods of their production | |
GB2593712A (en) | Viral infections - treatment with convalescent plasma /serum | |
WO2020174005A1 (en) | Regenerative combination of plasma and adipose tissue | |
JP2021532169A (ja) | 免疫細胞の活性化 | |
TWI344963B (en) | Clottable concentrate of platelet growth factors and preparation method thereof |