CN111569050B - 超活性多细胞生长因子sPL的保护剂及其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

超活性多细胞生长因子sPL的保护剂及其制备方法及应用，涉及一种细胞生长因子的保护剂及其制备方法及应用。是要解决sPL在长时间放置、经过温度改变或震动后，出现不稳定现象，有不溶性成分析出的问题。该保护剂包括A液和B液；A液包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖脂肪酸酯和乙醇溶液；B液包括的黄原胶、帕洛沙姆‑188、海藻酸钠、肝素钠和纯净水。方法：将A液加入B液中，搅拌至呈均一状态，即得到保护剂。该保护剂对多种复杂组分的sPL具有保护作用，加入保护剂的sPL液体呈现均匀状态，无明显析出物析出，其稳定性不受温度变化、运输震动、时间长短的影响。本发明用于保护超活性多细胞生长因子sPL。

Description

超活性多细胞生长因子sPL的保护剂及其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种细胞生长因子的保护剂及其制备方法及应用。
背景技术
哺乳动物的血液由55％血浆和45％血液细胞组成的，其中血液细胞又可以分为红细胞、白细胞和血小板三类。血小板在血液细胞中占比小于1％，在生理状态下，起到维持血管内皮的完整性，参与止血和凝血作用，当身体受到创伤后，血小板启动凝血机制，释放出凝血因子、促血管活性因子和生长因子等成分，对早期的创伤愈合、血栓形成、组织修复起着重要的调节作用。
正常人血液中血小板计数为100×109～300×109个/升，当血液中血小板过低时容易出血。有些疾病会伴随着血小板缺少症，因此在临床疾病治疗上输入血小板可以用于救治一些因各种原因造成的血小板减少或功能异常的患者，例如白血病、再生障碍性贫血、淋巴瘤、骨髓移植前等血液病患者以及因放化疗而引起骨髓抑制的癌症病人，其中有很多患者需要依靠不间断地输注血小板来维持生命。另外，研究表明，血小板中有很多细胞生长因子和调节因子，在多种生理病理条件下可以起到对机体的修复作用，比如血小板衍生生长因子(PDGF)是由血小板的α颗粒合成的糖蛋白，主要通过与成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞上的a受体结合，激活衰老受损局部细胞的有丝分裂，增加细胞基质产物，使再生细胞增多，在激发新血管形成和促进已有血管生长中也起到重要作用，PDGF是一种对高效促有丝分裂的因子，尤其对中胚层来源的细胞，包括肌肉细胞和间质细胞有促进分裂和繁殖作用；转化生长因子-β(TGF-β)是一种可以控制细胞增殖和分化的糖蛋白，可以促进成纤维细胞的扩增、促进合成胶原和纤维蛋白原又掉骨基质的沉淀和抑制骨吸收，同时TGF-β参与体内许多炎症反应，是体内多功能的基础抗炎细胞因子；纤维细胞生长因子(FGF)能促进血管新生，激发成纤维细胞生产，加速损伤组织修复和胚胎发育；表皮生长因子(EGF)能够修复上皮细胞，加速细胞繁殖和分化；血管内皮生长因子(VEGF)能产生胶原蛋白，激生透明质酸，从而有较强修复组织作用和促进血管生成作用；胰岛生长因子-1(IGF-1)是成纤维细胞趋化剂并能促进蛋白合成和骨形成。
利用血小板中营养因子制备成超活性多细胞因子制剂sPL进行临床治疗方法就是将制备完成的尽量少含红细胞的富血小板血浆利用高效诱导技术、冻融原理进行裂解，快速血小板中营养因子释放方法，在骨、软骨修复、皮肤损伤修复、常规方法难以修复的韧带损伤修复、以及由于手术造成的骨缺损、颌面部重构、牙龈缺损修复等过程都起到重要作用。研究对比超活性多细胞因子制剂sPL和富血小板血浆发现，富血小板血浆存在较强的免疫原性，多用于自体移植，而血小板裂解液制备过程中不仅去除了残余细胞结构，降低了免疫原性，而且还保留了其中的多种生长因子，可为异体或异种移植创造条件。因此，如作为构建组织工程化组织的潜在选择，超活性多细胞因子制剂sPL可能具有比富小板血浆更优越的应用前景。
超活性多因子制剂sPL制备后，经过梯度离心、温度改变和过滤等过程，去掉了纤维蛋白和颗粒性成分，但剩余的成分仍包括血小板中的多种细胞因子、促粘附因子、促血管形成因子、趋化因子、凝血因子、免疫调节因子以及血浆中的部分蛋白成分、脂膜成分、核酸成分等，超过150多种成分。这些成分在sPL中呈现富集状态。正常情况下，将制备完成的sPL会在短时间内使用，不会出现不稳定现象，对骨科、皮肤修复等需要制备后短时间内进行应用的过程不会造成影响。当在用于细胞培养等需要存放时间长、温度改变、震动等过程后，会出现不稳定现象，样品中有不溶性成分析出，而不溶性析出物也会将营养因子同时裹挟带走，影响sPL产品使用效果。
发明内容
本发明是要解决sPL在长时间放置、经过温度改变或震动后，出现不稳定现象，有不溶性成分析出的问题，提供一种超活性多细胞生长因子sPL的保护剂及其制备方法。
本发明超活性多细胞生长因子sPL的保护剂包括A液和B液；其中A液按重量份数包括0.1份的磷脂酰乙醇胺、0.025份的磷脂酰肌醇、0.05份的聚乙烯吡咯烷酮、0.11份的蔗糖脂肪酸酯和15～16份乙醇溶液；
B液包括0.5-1.1mg/mL的黄原胶、0.2-0.4mg/mL的帕洛沙姆-188、0.6-1.2mg/mL的海藻酸钠、180-220U/mL的肝素钠和纯净水；
其中A液和B液的体积比为1:(45-55)。
进一步的，所述乙醇溶液的体积浓度为95％。
本发明还提供超活性多细胞生长因子sPL的保护剂的制备方法，包括以下步骤：
一、A液配置方法：按重量份数称取0.1份的磷脂酰乙醇胺、0.025份的磷脂酰肌醇、0.05份的聚乙烯吡咯烷酮和0.11份的蔗糖脂肪酸酯，加入到15～16份的乙醇溶液中，高速搅拌至溶解；
二、B液配制方法：将黄原胶、帕洛沙姆-188、海藻酸钠和肝素钠加入到纯净水中，搅拌至溶解；B液中黄原胶的浓度为0.5-1.1mg/mL，帕洛沙姆-188的浓度为0.2-0.4mg/mL，海藻酸钠的浓度为0.6-1.2mg/mL，肝素钠的浓度为180-220U/mL；
三、将A液加入B液中，边加入边搅拌，直至呈均一状态，即得到保护剂；其中A液和B液的体积比为1:(45-55)。
进一步的，步骤一中所述乙醇溶液的体积浓度为95％。
进一步的，步骤一中所述高速搅拌的速度为200-300rpm。
本发明还提供上述保护剂在保护超活性多细胞生长因子sPL中的应用。
进一步的，保护剂在保护超活性多细胞生长因子sPL的具体方法为：将所述保护剂在无菌条件下逐滴加入到sPL中，混匀。
进一步的，sPL液体与保护剂的体积比为100：(0.5-2)。
本发明的有益效果：
超活性多细胞生长因子sPL在制备过程中，经过血液分离、诱导、离心、破壁等过程，血小板内释放出很多的成分，虽然在sPL制备的最后一步也经过离心、过滤等过程，形成相对稳定的均一态液体。但是随着放置时间的延迟、温度的改变和环境振动的因素和酶促反应，会将原有的多种营养成分的均一态打破，造成脂溶性物质和大分子蛋白的聚集、析出，这种析出也会裹挟着其他可溶性成分，造成sPL营养成分的流失和应用效果的降低。
本发明中的保护剂组成包括脂溶性成分A液和水溶性成分B液。A液中含有可以促进脂溶性成分分散、乳化的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、聚乙烯吡咯烷酮和蔗糖脂肪酸酯。A液中四种成分对sPL中的极微小的脂溶性物质例如血小板颗粒中的膜性结构起到溶解和分散作用。B液中含有黄原胶、帕洛沙姆-188、海藻酸钠、肝素钠等水溶性成分，B液可以降低促凝血类物质的活性和增加液体粘度等作用，防止大分子相互碰撞发生的水溶性降低、成分析出、聚团、沉淀等连锁反应。
因此，本发明的保护剂对多种复杂组分的sPL具有保护作用，加入保护剂的sPL液体呈现均匀状态，无明显片状、块状析出物析出，其稳定性不受温度变化、运输震动、时间长短的影响。同时发现，sPL中添加本发明的保护剂后，还能防止水溶性因子例如PDGF、TGF-B等被裹挟入沉淀中，保护了有效成分能长时间发挥作用。另外，本发明保护剂中各种成分并未对sPL应用造成影响，从细胞学实验可以看出，细胞贴壁效率高，形态良好，相同的细胞接种后经过72小时进行细胞拍照，可以看到加了保护剂的细胞与新鲜配置的sPL细胞长满度均为90％，而没有加保护剂的经过48小时放置的sPL其因为营养因子的聚团无法被细胞充分利用，细胞增殖数量降低，长满度仅为80％。
附图说明
图1为加入保护剂与未加保护剂的sPL在温度变化和震动条件下的状态对比图；
图2为加入保护剂与未加保护剂的sPL在长时间保存后状态对比图；
图3为不同保护剂添加比例的sPL使用效果对比图；
图4为稳定性测试结果；
图5为关键组分PDGF析出情况测试结果；
图6为关键组分TGF-B析出情况测试结果；
图7为添加保护剂的sPL进行细胞培养后的细胞形态图；
图8为添加保护剂的sPL进行细胞培养后的细胞长满度统计。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式超活性多细胞生长因子sPL的保护剂包括A液和B液；其中A液按重量份数包括0.1份的磷脂酰乙醇胺、0.025份的磷脂酰肌醇、0.05份的聚乙烯吡咯烷酮、0.11份的蔗糖脂肪酸酯和15～16份乙醇溶液；
B液包括0.5-1.1mg/mL的黄原胶、0.2-0.4mg/mL的帕洛沙姆-188、0.6-1.2mg/mL的海藻酸钠、180-220U/mL的肝素钠和纯净水；
其中A液和B液的体积比为1:(45-55)。
本实施方式中的保护剂包括脂溶性成分A液和水溶性成分B液。A液中含有可以促进脂溶性成分分散、乳化的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、聚乙烯吡咯烷酮和蔗糖脂肪酸酯。其中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇是卵磷脂的主要组成成分，具有结合sPL中的蛋白形成脂蛋白，起到乳化和抗氧化作用；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可以增加sPL的黏度，蔗糖脂肪酸酯是乳化剂，对油和水有良好的乳化作用，因此A液中四种成分对sPL中的极微小的脂溶性物质例如血小板颗粒中的膜性结构起到溶解和分散作用。
B液中含有黄原胶、帕洛沙姆-188、海藻酸钠、肝素钠等水溶性成分，黄原胶是具有增稠、悬浮作用的长链高分子，少量的添加具有锁水功能，让sPL中水溶性成分处于稳定状态，让脂溶性成分进一步悬浮稳定在液体中；帕洛沙姆-188是一种水包油乳化剂，海藻酸钠亲水性强，两者可以将A液与sPL形成的磷脂蛋白包裹成起来，形成处于水相中的微分散体并形成非常均匀的溶液；肝素钠起到抑制sPL中的凝血酶活性，防止凝血酶引发的纤维蛋白原聚合成不溶性的纤维蛋白，破坏sPL的稳定性。因此，B液总体上可以降低促凝血类物质的活性和增加液体粘度等作用，防止大分子相互碰撞发生的水溶性降低、成分析出、聚团、沉淀等连锁反应。
因此，本实施方式的保护剂对多种复杂组分的sPL具有保护作用，加入保护剂的sPL液体呈现均匀状态，无明显片状、块状析出物析出，其稳定性不受温度变化、运输震动、时间长短的影响。同时发现，sPL中添加本发明的保护剂后，还能防止水溶性因子例如PDGF、TGF-B等被裹挟入沉淀中，保护了有效成分能长时间发挥作用。另外，本发明保护剂中各种成分并未对sPL应用造成影响，从细胞学实验可以看出，细胞贴壁效率高，形态良好。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述乙醇溶液的体积浓度为95％。其它与具体实施方式一相同。
本实施方式选择此浓度的乙醇是为了促进A液中的脂溶性物质溶解。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述B液包括1mg/mL的黄原胶、0.3mg/mL的帕洛沙姆-188、1mg/mL的海藻酸钠、200U/mL的肝素钠和纯净水。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式超活性多细胞生长因子sPL的保护剂的制备方法，包括以下步骤：
一、A液配置方法：按重量份数称取0.1份的磷脂酰乙醇胺、0.025份的磷脂酰肌醇、0.05份的聚乙烯吡咯烷酮和0.11份的蔗糖脂肪酸酯，加入到15～16份的乙醇溶液中，高速搅拌至溶解；
二、B液配制方法：将黄原胶、帕洛沙姆-188、海藻酸钠和肝素钠加入到纯净水中，搅拌至溶解；B液中黄原胶的浓度为0.5-1.1mg/mL，帕洛沙姆-188的浓度为0.2-0.4mg/mL，海藻酸钠的浓度为0.6-1.2mg/mL，肝素钠的浓度为180-220U/mL；
三、将A液加入B液中，边加入边搅拌，直至呈均一状态，即得到保护剂；其中A液和B液的体积比为1:(45-55)。
因为sPL中以水溶性大分子为主，含有少量的脂溶性成分，A液和B液的体积比为1:(45-55)是出于要稳定的sPL组分情况来进行选择的。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤一中所述乙醇溶液的体积浓度为95％。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤一中所述高速搅拌的速度为200-300rpm。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式七：本实施方式的保护剂在保护超活性多细胞生长因子sPL中的应用。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：所述保护为防止sPL中的析出物析出。其它与具体实施方式七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式七不同的是：保护剂在保护超活性多细胞生长因子sPL的具体方法为：将所述保护剂在无菌条件下逐滴加入到sPL中，混匀。其它与具体实施方式七相同。。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是：sPL液体与保护剂的体积比为100：(0.5-2)。其它与具体实施方式九相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
一、超活性多细胞生长因子sPL的制备方法：
A、采集自体血液，加入抗凝剂，得到抗凝血，于20℃、200g-250g条件下离心10min，去除下层红细胞；然后将离心管内剩余血液混合均匀，再在22℃、3000g条件下离心15min，然后去掉上层4/5的血浆，将底层剩余的1/5血浆颠倒混匀，为血小板浓缩5倍的血浆；
B、将步骤A获得的浓缩血小板血浆冰浴超声10-15min，之后液氮浴1-2小时，获得血小板血浆裂解液；
C、将步骤B获得的血小板裂解液从液氮取出复苏后，置于18-25℃静止4-6小时，
D、然后加入肝素钠，4℃下混合均匀，使得肝素钠终浓度为1-3U/ml，然后在37℃水浴静止1小时，再在4℃水浴静置16-24小时，最后37℃水浴静置0.5-2小时；
E、然后在4℃下以200次/min进行往复式剧烈摇动，最后于4℃下1000-1500g离心10-15min，取上清用0.22μm滤器过滤，即得到白细胞去除率超过90％的超活性多因子制剂sPL；
二、超活性多细胞生长因子sPL的保护剂的制备方法，包括以下步骤：
保护剂共100ml，其组成为A液和B液。
A液配置方法：将磷脂酰乙醇胺0.100g、磷脂酰肌醇0.025g、聚乙烯吡咯烷酮0.050g和蔗糖脂肪酸酯0.110g，加入到体积浓度为95％的20ml乙醇溶液中，200rpm高速搅拌，溶解。
B液配制方法：将黄原胶0.100g、帕洛沙姆-188 0.030g、海藻酸钠0.100g和20000U的肝素钠，加纯净水至100ml，搅拌溶解。
取上述2ml A液加入98ml B液中，边加入边搅拌，直至呈现均一状态，即得到sPL的保护剂。
三、将保护剂加入sPL中：
按照sPL液体与保护剂的体积比为100：(0.5-2)的比例，将保护剂在无菌条件下逐滴加入到新鲜制备的sPL中，混匀。
为了验证本实施例保护剂的效果，进行以下试验：
(一)将加入保护剂的sPL和未加保护剂的sPL经过温度4℃冰箱中放置2小时后取出，在15℃运输箱中，再经过20rpm震摇动4小时处理。结果如图1所示，由图可以看出，未加保护剂的sPL可见明显的块状凝聚物出现，而加入保护剂的sPL则仍然呈现出非常均一的状态。
(二)将同一份sPL分成两部分，一部分直接放入4℃冰箱中24小时；另一部分加入保护剂后放入4℃冰箱中24小时。取出后，将sPL液体涂抹在载玻片上，并用结晶紫染色。结果如图2所示。可见加入保护剂的sPL基本上没有絮状沉淀物，而未加保护剂的sPL则有大量团聚的析出物出现。
(三)将sPL、sPL：保护剂＝100:0.2、sPL：保护剂＝100:0.8均按照7％(体积百分比)的比例加入间充质干细胞培养基中，并在37℃、5％CO2培养箱中培养细胞3天，模拟sPL在体内遇到细胞后的状态，3天后，将细胞消化，显微镜下观看，结果如图3所示。可见未加保护剂的sPL中出现大量不规则析出物，加入保护剂的sPL(sPL：保护剂＝100:0.2)中有少许析出物，而sPL：保护剂＝100:0.8为最佳的保护剂加入比例，效果非常稳定，培养基中未出现析出物，细胞呈现非常干净的状态。
(四)稳定性测试
将sPL中加入保护剂，sPL液体与保护剂的体积比为100：0.5，分成5等份，放入15℃恒温运输箱中，在0、12、24、36、48小时分别取出1管，在200g离心1min，弃上清液，将管底残余物称重，同一样本中不加保护剂的作为对照。结果如图4所示，其中●表示sPL，△表示sPL+保护剂。结果表明，加入保护剂的sPL液体稳定性好，即使放置48小时，管底部也很少有sPL聚集沉淀产生，而不加保护剂的情况下，随着时间的延长，管底部的沉淀越来越多。说明，随着时间的延长，sPL稳定性逐渐变差，由于不稳定而析出的物质越来越多。因此保护剂起到了很好的对sPL稳定性作用。
(五)关键组分析出情况PDGF测试
将sPL中加入保护剂，sPL液体与保护剂的体积比为100：1.5，分成5等份，放入15℃恒温运输箱中，在0、12、24、36、48小时分别取出1管，在200g离心1min，取上清液，用ELISA检测试剂盒进行PDGF测试，同一样本中不加保护剂的作为对照。结果如图5所示，其中●表示sPL，■表示sPL+保护剂。结果表明，时间的延长，不加保护剂的sPL样本上清中的PDGF含量出现降低现象，而加了保护剂的sPL液体上清液中PDGF的含量非常稳定。说明，PDGF会随着不稳定的沉淀物析出的沉淀。因此加入保护剂，防止了PDGF等sPL中的生长因子成分的析出，确保了sPL在使用过程中的效果。
(六)关键组分析出情况TGF-B测试
将sPL中加入保护剂，sPL液体与保护剂的体积比为100：1，分成5等份分，放入15℃恒温运输箱中，在0、12、24、36、48小时分别取出1管，在200g离心1min，取上清液，用ELISA检测试剂盒进行TGF-B测试，同一样本中不加保护剂的作为对照。结果如图6所示，其中●表示sPL，■表示sPL+保护剂。结果表明，随着时间的延长，不加保护剂的sPL样本上清中的TGF-B含量出现降低现象，而加了保护剂的sPL液体上清液中TGF-B的含量非常稳定。说明TGF-B会随着不稳定的沉淀物析出的沉淀。因此加入保护剂，防止了TGF-B等sPL中的生长因子成分的析出，确保了sPL在使用过程中的效果。
(七)保护剂加入对细胞培养效果测试
保护剂加入对细胞培养效果测试结果如图7和图8所示。
将sPL中加入保护剂，sPL液体与保护剂的体积比为100：2，放入15℃恒温运输箱中48小时后，再200g离心1min，取上清液，按照体积比a-MEM:sPL＝95:5的比例，配置细胞培养基，37℃培养箱中培养P5代脐带间充质干细胞，记录培养72小时后的细胞生长形态和长满程度。将新鲜的sPL、sPL放置48小时、sPL+保护剂放置48小时进行对比，细胞生长状态图如图7所示，72小时培养后细胞长满度结果如图8所示。可见虽然三种情况下细胞培养后的细胞形态一致，但细胞长满度对比来看，从新鲜的sPL组和sPL+保护剂放置48小时组的长满度均为90％，而sPL放置48小时组长满度为80％。由此可见，未加保护剂促进细胞培养的营养因子流失，而加入保护剂的sPL样本不仅营养成分没有丧失，同时保护剂内的成分没有造成细胞的生理状态的影响，因此细胞的长满度和新鲜配置的sPL一致。

Claims (10)

1.超活性多细胞生长因子sPL的保护剂，其特征在于该保护剂包括A液和B液；其中A液按重量份数包括0.1份的磷脂酰乙醇胺、0.025份的磷脂酰肌醇、0.05份的聚乙烯吡咯烷酮、0.11份的蔗糖脂肪酸酯和15～16份乙醇溶液；
B液包括0.5-1.1mg/mL的黄原胶、0.2-0.4mg/mL的帕洛沙姆-188、0.6-1.2mg/mL的海藻酸钠、180-220U/mL的肝素钠和纯净水；
其中A液和B液的体积比为1:(45-55)。
2.根据权利要求1所述的超活性多细胞生长因子sPL的保护剂，其特征在于所述乙醇溶液的体积浓度为95％。
3.根据权利要求1所述的超活性多细胞生长因子sPL的保护剂，其特征在于所述B液包括1mg/mL的黄原胶、0.3mg/mL的帕洛沙姆-188、1mg/mL的海藻酸钠、200U/mL的肝素钠和纯净水。
4.根据权利要求1所述的超活性多细胞生长因子sPL的保护剂，其特征在于A液和B液的体积比为1:49。
5.如权利要求1所述的超活性多细胞生长因子sPL的保护剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、A液配置方法：按重量份数称取0.1份的磷脂酰乙醇胺、0.025份的磷脂酰肌醇、0.05份的聚乙烯吡咯烷酮和0.11份的蔗糖脂肪酸酯，加入到15～16份的乙醇溶液中，高速搅拌至溶解；
二、B液配制方法：将黄原胶、帕洛沙姆-188、海藻酸钠和肝素钠加入到纯净水中，搅拌至溶解；B液中黄原胶的浓度为0.5-1.1mg/mL，帕洛沙姆-188的浓度为0.2-0.4mg/mL，海藻酸钠的浓度为0.6-1.2mg/mL，肝素钠的浓度为180-220U/mL；
三、将A液加入B液中，边加入边搅拌，直至呈均一状态，即得到保护剂；其中A液和B液的体积比为1:(45-55)。
6.根据权利要求5所述的超活性多细胞生长因子sPL的保护剂的制备方法，其特征在于步骤一中所述高速搅拌的速度为200-300rpm。
7.如权利要求1所述的保护剂在保护超活性多细胞生长因子sPL中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述保护是指防止sPL中的析出物析出。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于保护剂在保护超活性多细胞生长因子sPL的具体方法为：将所述保护剂在无菌条件下逐滴加入到sPL中，混匀。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述sPL与保护剂的体积比为100：(0.5-2)。
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