MX2014012260A

MX2014012260A - Metodo y composicion para prevenir la interrupcion y agregacion de celulas madre.

Info

Publication number: MX2014012260A
Application number: MX2014012260A
Authority: MX
Inventors: Jeong Chan Ra; Sung Keun Kang; Ii Seob Shin
Original assignee: Stemcell Co Ltd K
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2013-04-15
Publication date: 2015-07-14
Also published as: EP2837682B1; KR20130116213A; CN104755609A; JP2015513918A; WO2013154404A1; KR101467481B1; EP2837682A4; ZA201407412B; EP2837682A1; CN104755609B; US20150118194A1; AU2013247455A1; HK1208498A1; MX359002B; US9433645B2; JP5931277B2

Abstract

Se proporciona un método para evitar la interrupción y agregación de células madre. Además, se proporciona una composición de células madre para la administración intravascular, en la que, las células madre se suspenden en una solución que contiene aspirina. Además, se proporciona una composición para evitar la interrupción o agregación de células madre, en las que las células madre se suspenden en una solución que contiene aspirina. De acuerdo a la presente invención, se puede evitar la interrupción y agregación de células durante la transportación y almacenamiento, de tal manera que las células madre administradas puedan alcanzar de manera estable el tejido diana y exhibir la actividad de las mismas de una manera más eficiente, de este modo aumenta notablemente el efecto de la terapia celular con células madre.

Description

MÉTODO Y COMPOSICIÓN PARA PREVENIR LA INTERRUPCIÓN Y AGREGACIÓN DE CÉLULAS MADRE Campo Técnico La presente invención se refiere a un método para evitar la interrupción y agregación de células madre, y más particularmente, a un método para evitar la interrupción y agregación de células madre capaz de evitar que las células sean interrumpidas o agregadas durante el transporte o almacenamiento.

Antecedente del arte Las células madre se refiere a células capaces de diferenciarse en dos tipos de células mientras que tienen la capacidad auto-replicante y pueden ser clasificadas en células madre totipotente, células madre pluripotente, y células madre multipotente. Las células madre totipotente son células que tienen propiedades totipotentes capaces de convertirse en un individuo perfecto, y estas propiedades son poseídas por las células hasta la fase de ocho células después de la fertilización de un ovocito y un espermatozoide. Cuando estás células se aíslan y trasplantan en el útero, estas células pueden convertirse en un individuo perfecto. Las células madre pluripotentes, que son células capaces de desarrollarse en diversas células y tejidos derivados de las capas ectodérmicas, mesodérmicas y endodérmicas, se derivan de una masa celular interna localizada dentro de los blastocistos generados 4-5 días después de la fertilización. Estas células son llamadas “células madres embrionarias” y se pueden diferenciar en otras varias células de tejido pero no forman nuevos organismos vivos. Las células madre multipotentes, que son células madre capaces de diferenciarse en solo células especificas a tejidos y órganos que contiene estas células, se involucran no solo en el crecimiento y desarrollo de diversos tejidos y órganos en los períodos fetales, neonatales y de adultos sino también en el mantenimiento de homeostasis de tejido adulto y la función de inducir la regeneración sobre el daño en los tejidos. Las células multipotentes específicas de tejido se denominan colectivamente "células madre adultas”.

Las células madre adultas, que son obtenidas mediante la recolección de células existentes en diversos órganos del cuerpo humano para desarrollar las células en células madre, caracterizadas porque se diferencian solo de tejidos específicos. Sin embargo, recientemente, los experimentos para diferenciar las células madre adultas en varios tejidos incluyendo células hepáticas, y similares son exitosos, los cuales están en la mira. En particular, en la terapia regenerativa, la cual es una terapia realizada para utilizar de manera activa células para la regeneración de tejido biológico y órganos que tienen trastorno funcional o disonancia causada por una enfermedad o accidente y recuperar sus funciones, un método que incluye: recolección de células madre, células mononucleares derivadas de la sangre o células mononucleares derivadas de la médula ósea; induciendo la proliferación y/o diferenciación de las células por cultivo in vitro; e introduciendo las células no diferenciadas y/o diferenciadas (células madre y/o células progenitoras) y/o células diferenciadas en el cuerpo del paciente mediante transplante, ha sido utilizado principalmente. Se espera que los métodos clásicos existentes para el tratamiento de enfermedades mediante métodos de tratamiento de medicina clásica ó métodos quirúrgicos sean reemplazados con terapia de reemplazo de células/tejidos que reemplazan una célula, tejido u órgano dañado, con una célula, tejido, u órgano sano como se describió anteriormente, los usos de las células madre aumentará aún más.

De este modo, actualmente, diversas funciones de las células madre son estudiadas. Entre estas, la terapia celular que utiliza células madre mesenquimales ha estado en la mira, y se ha desarrollado una tecnología de mejoramiento de células madre mesenquimales aisladas del cuerpo humano para que sean adecuadas para el tratamiento (WO 2006/019357, Patente Coreana No. 0795708, y Patente Coreana No. 0818214).

Sin embargo, la investigación de un método de preparación de células madre para administración intracorpórea y que tenga excelente seguridad aun no ha sido conducida de manera suficiente.

Por consiguiente, los presentes inventores confirmaron que en el caso de la suspensión de las células madre en una solución que contenga aspirina, interrupción y agregación de células madre se puede evitar, completando así, la presente invención.

DIVULGACIÓN PROBLEMA TÉCNICO Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para evitar la interrupción y agregación de células madre.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para administración intravascular.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para evitar la interrupción o agregación de células madre.

SOLUCIÓN TÉCNICA De acuerdo a un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para evitar la interrupción y agregación de células madre incluyendo suspensión de células madre en una solución que contiene aspirina.

De acuerdo a otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de células madre para administración intravascular, en la que las células madre se suspenden en una solución que contiene aspirina.

De acuerdo a otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición para evitar la interrupción o agregación de células madre, en la que las células madre se suspenden en una solución que contiene aspirina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 es una fotografía obtenida mediante la observación de grados de agregación de células madre expuestas a aspirina en diversas concentraciones durante 24 horas.

La Fig. 2 es una fotografía obtenida mediante la observación de grados de agregación de células madre expuestas a aspirina en diversas concentraciones durante 72 horas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN A menos que se defina lo contrario en la presente, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente especificación tienen los mismos significados a los entendidos por los especialistas expertos en la técnica a la que la presente invención pertenece. De manera general, la nomenclatura utilizada en la presente especificación y los métodos experimentales descritos más adelante son bien conocidos y comúnmente utilizados en el arte.

Como se utiliza en la presente, el término “células madre” significa una célula capaz de diferenciarse de al menos dos tipos de células, mientras que tienen capacidad de auto-replicación, y el término “células adultas” significa una célula madre generada en una etapa en la que el proceso de desarrollo procede de este modo a formar cada órgano de un embrión o en una etapa adulta.

Como se utiliza, el término “célula madre mesenquimal” significa una célula madre aislada de un tejido de un humano o mamífero y se pude derivar de diversos tejidos. Particularmente, la célula madre mesenquimal puede ser una célula madre mesenquimal derivada del cordón umbilical, una célula madre mesenquimal derivada de la sangre del cordón umbilical, una célula madre mesenquimal derivada de médula ósea, una célula madre mesenquimal derivada de tejido adiposo, una célula madre mesenquimal derivada de músculo, una célula madre mesenquimal derivada de nervio, una célula madre mesenquimal derivada de piel, una célula madre mesenquimal derivada de amnios, y una célula madre mesenquimal derivada de placenta, y se ha conocido en el arte una tecnología de aislamiento de las células madre de cada tejido.

Cómo se utiliza en la presente, el termino “célula madre mesenquimal derivado de tejido adiposo”, el cual es una célula adulta indiferenciada aislada de un tejido adiposo, se hace referencia brevemente como “célula madre adultas derivada de tejido adiposo”, “célula madre de tejido adiposo”, o “célula madre derivada de tejido adiposo” en la presente especificación. La célula madre mesenquimal derivada de tejido adiposo se puede obtener mediante un método general conocido en el arte. Un ejemplo de un método de aislamiento de la misma es la siguiente. Esto es, las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo pueden ser aisladas mediante el método de tratamiento de una capa de célula madre unida a un recipiente de cultivo tales como un matraz, o similares, con tripsina después de cultivar una suspensión que contiene tejido adiposo suspendido en solución salina normal obtenida mediante liposucción, y posteriormente recuperación las células madre tratadas, un método de recuperación de manera directa de células madre suspendidas en una pequeña cantidad de solución salina normal por raspado con un raspador, o similares.

Como se utiliza en la presente, el termino “transportar” significa que las propias células madre, una vasija llenada con una solución que contiene células madre, o similares, son transportadas por medio de transportación tales como vehículo, o similares, y el término “almacenamiento”, incluye temperatura de almacenamiento en frío así como también almacenamiento a temperatura ambiente.

Como se utiliza en la presente, el término “prevención de interrupción y agregación de células madre” significa que las células madre se mantienen en una sola forma de célula sin que se rompa o se agregue. Como un ejemplo, significa que las células madre que se han transportado o almacenado se mantienen en forma de una sola célula y sin rotura de una membrana celulosa o agregación entre las células.

Las células madre se pueden administrar en un cuerpo mediante diversos métodos, por ejemplo, un método de administración intravenosa, intra-arterial o intra-peritoneal, o similares. Entre ellos, ya que el método de administración intravenosa puede tratar de manera simple y segura una enfermedad sin operación quirúrgica, el método de administración intravenosa es útil. Sin embargo, con la finalidad de permitir que las células madre administradas de manera intravenosa y de forma estable a alcanzar el sitio diana para obtener el efecto de tratamiento deseado, diversos factores deben ser satisfechos. Primero, las células madre necesitan ser administradas de manera intra-vascular en forma de células individuales. Las células madre se puede preparar en forma de células individuales al ser tratados con tripsina, o similar, para la administración intrcorpórea, pero incluso en el caso de las células madre preparadas en forma de células indivuiduales, una membrana celular se puede romper o se puede formar agregación entre células durante el transporte o almacenamiento. En el caso en que las células madre agregadas en lugar de células madre en una sola forma o células rotas se administren al cuerpo mediante administración intravenosa, o similares, las células administradas se pueden unir a células endoteliales vasculares, plaquetas sanguíneas, o similares, para disminuir una velocidad de flujo de la sangre u obstaculizar la circulación sanguínea, e incluso causar la oclusión de un micro-vaso, un vaso sanguíneo, o similar (D.Furlani et al., Microvasular Investigación 77 (2009) 370 -376). Por lo tanto, antes de que las células madre se administren de manera intravascular, es esencial que no se genere la interrupción o agregación de células, y después de que las células madre son administradas de manera intravascular, las células madre también deben alcanzar de forma estable un sitio diana en una forma de una célula individual, sin interrupción o agregación de las células. Además las células madre deben tener un tamaño adecuado para la administración intravascular de modo que las células madre administradas por vía intravascular no disminuya la velocidad del flujo sanguíneo o forme coagulación de la sangre. Además, las células madre deben de ser administradas en una concentración predeterminada o más con la finalidad de que las células madre alcancen el sitio diana y exhiban el efecto del tratamiento deseado. Entre diversos factores, como se describió anteriormente, la presente invención es para proporcionar células madre adecuadas para administración intracorpórea y que tengan excelente seguridad mediante la prevención de interrupción y agregación de las células madre antes de la administración intravascular.

La presente invención proporciona un método para evitar la interrupción y agregación de células madre que incluyen la suspensión de células madre en una solución que contenga un compuesto de aspirina.

Tal como se utiliza aquí, el término “solución que contiene aspirina” significa una solución que contiene un compuesto de la aspirina, y como un solvente, puede ser preferible solución salina normal. Además, cualquier solvente, por ejemplo, solución de Hartman-D, solución salina tamponada con fosfato (PBS), o similares, se puede utilizar sin limitaciones, siempre y cuando sea utilizada de manera general en el arte. Como la aspirina, un compuesto semejante a aspirina se puede utilizar así como productos de aspirina generalmente disponibles. En un ejemplo de la presente invención, la solución que contiene aspirina se prepara agregando ácido acetilsalicílico (Sigma; A5376), Inyección Arthalgyl, o lisina aspirina (Shin poong) a la solución salina normal. En este caso, es preferible que un contenido de la aspirina se agregue de 0.0001 a 0.01mg/ml. En el caso en el que el contenido de la aspirina agregada sea mayor que la del intervalo mencionado anteriormente, puede disminuir el intervalo de supervivencia de las células, y en el caso en el que el contenido sea menor que el intervalo mencionado anteriormente, un efecto de prevención de interrupción o agregación de células puede ser insignificante.

Ya que en el caso de suspensión de células madre en la solución que contiene aspirina, la interrupción y agregación de células madre no se genera durante el transporte o almacenamiento, estás células madre pueden ser directamente aplicadas para administración intracorpórea, de tal manera que estas células madre son útiles. Por lo tanto, preferentemente, las células madre utilizadas al momento de la administración intravascular se puede utilizar después de que son suspendidas en solución salina normal que contenga aspirina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de células madre para administración intravascular, en la que las células madre se suspenden en una solución que contiene aspirina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición para evitar la interrupción o agregación de las células madre, en las que las células madre se suspenden en una solución que contiene aspirina.

Como las células madre utilizadas en la presente invención, preferentemente, se pueden utilizar las células madre. Entre estas, las células madre obtenidas del tejido adiposo o tejido epitelial tales como folículo piloso, amnios, o similar, se puede utilizar. Más preferiblemente, se pueden utilizar las células madre adultas derivadas de tejido adiposo. Se pueden utilizar las células madre mesenquimales (MSCs), y particularmente, se pueden utilizar las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AdMSCs).

Preferentemente, el tejido adiposo o epitelial se deriva de un mamífero, y más preferentemente, el tejido adiposo o epitelial se deriva de un humano. En el ejemplo de la presente invención, se utilizaron las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (hAdMSCs).

Como un medio utilizado para obtener las células madre, se puede utilizar un medio general conocido en el arte como un medio adecuado para cultivar células madre. Por ejemplo, hay medio esencial mínimo (MEM), Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) y medio libre de suero de queratinocitos (K-SFM). Además, se puede utilizar un medio utilizado en el arte. Preferiblemente, se puede utilizar un medio seleccionado de un grupo que consiste en M199/F12 (mezcla) (GIBCO), medio MEM-alfa (GIBCO), medio DMEM con bajo nivel de glucosa (Welgene), medio MCDB 131 (Welgene), medio IMEM (GIBCO), y K-SFM puede ser utilizado. En particular, entre ellos, se puede utilizar preferentemente el medio K-SFM.

El medio utilizado para obtener las células madre puede completarse con aditivos conocidos en el arte, el aditivo de diferenciación de supresión de las células madre mientras promueve la proliferación de un fenotipo indiferenciado de las células madre. Además, el medio puede contener un búfer neutral (por ejemplo, fosfatos y/o alta concentración de bicarbonato de sodio) en una solución isotónica y nutrientes de proteínas (por ejemplo, suero tal como suero fetal bovino (FBS), reemplazos de suero, albúmina, o aminoácidos esenciales o no esenciales tal como glutamina). Además el medio puede contener lípidos (ácidos grasos, cholesterol, un extracto de suero de HDL o LDL) y otros componente encontrados en la mayoría de los medios de conservación de este tipo (tales como insulina o transferrina, nucleósidos o nucleótidos, piruvato, una fuente de azúcar tal como glucosa, selenio en cualquier forma ionizada o sal, un glucocorticoíde, tales como la hidrocortisona y/o un agente reductor tal como b-mercaptoetanol).

Además, es beneficioso que el medio contiene agentes anti-formación de grumos, por ejemplo, los vendidos por Invitrogen ( Cat # 0010057AE) con la finalidad de evitar que las células se adhieran entre si, se adhieran a las paredes del recipiente, formando excesivamente grandes conglomerados.

Entre estos, es ventajoso utilizar uno o más de los siguientes aditivos adicionales: • Factor de célula madre (SCF, Factor de acero), otros ligandos o anticuerpos que dimerizan c-kit, y otros activadores de la misma ruta de transducción de señal • Los ligandos para otros tipos de receptores relacionados a la tirosina quinasa, tales como los receptores para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor estimulante de colonias macrófagas, ligando Flt-3, y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); • Factores que aumentan los niveles de AMP cíclico, tales como forskolin; • Factores que inducen gp130, tales como LIF o la oncostatina-M; • Factores de crecimiento hematopoyético, tales como trombopoyetina (TPO); • Transformación de los factores de crecimiento tales como TGF&1 ; y • Neurotrofinas, tales como CNTF.

Particularmente, un medio utilizado para cultivar células madre de tejido adiposo en una forma de realización ejemplar de la presente invención preferentemente contiene NAC, calcio, insulina, hidrocortisona, y un antioxidante. Mas preferentemente, un medio que contiene dos o mas componentes de FBS, NAC, calcio, rEGF, insulina, hidrocortisona, y se puede utilizar el antioxidante. Como el antioxidante, se puede utilizar un antioxidante puede ser utilizado. Como el antioxidante, un antioxidante seleccionado de selenio, ácido ascórbico, vitamina E, catequina, licopeno, beta-caroteno, la coenzima Q-10, ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexanoico (DHA), y similares pueden ser utilizados. Entre estos, puede ser más preferentemente utilizado el selenio. En el ejemplo de la presente invención, el selenio se utilizó como el antioxidante, y una cantidad preferible del selenio utilizado fue de 0.5 a 10ng/ml.

En un ejemplo de la presente invención, las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo se cultivaron en un medio que tiene la composición anteriormente mencionada. Las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo se pueden obtener mediante el siguiente método. Primero, el tejido adiposo humano obtenido del abdomen mediante liposucción, o similar, se aisló y se lavó con PBS. Posteriormente, el tejido aislado se cortó finamente, digerido utilizando un medio DMEM complementado con colagenasa, lavada con PBS, y posteriormente centrifugada a 1000 rpm durante 5 minutos. Un sobrenadante se removió y los sedimentos que permanecieron en una parte inferior se lavaron con PBS, seguido por centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos. Los materiales flotantes se removieron utilizando una malla 100, y las células resultantes se lavaron nuevamente con PBS. Las células resultante se cultivaron en un medio DMEM (10% FBS, 2mM NAC, 0.2Mm de ácido ascórbico), y después de toda la noche, las células que no se adhirieron a una parte inferior de un recipiente de cultivo se lavaron con PBS. Posteriormente, las células restantes se cultivaron mientras el medio se remplazo con el medio K-SFM que contiene NAC, ácido ascórbico, calcio, rEGF, insulina, e hidrocortisona cada día, de tal manera que las células madre mesenquimales se aislaron y sub-cultivaron, de este modo, se hace posible obtener las células madre mesenquimales. Sin embargo, las células madre mesenquimales se pueden obtener mediante un método conocido en el arte así como también como el método anteriormente mencionado.

En el caso de tratamiento de células madre cultivadas en el medio que tiene la composición anteriormente mencionada con tripsina, se puede obtener células madre en forma de células individuales. En este caso, la tripsina se trata con la finalidad de suprimir la agregación de las células para permitir de este modo que las células tengan una forma de células individuales, y cualquier material puede ser utilizado en lugar de la tripsina, siempre y cuando el material pueda suprimir la agregación de las células.

En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle a través de los ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no solo ilustran la presente invención, y los expertos en el arte apreciaran que estos ejemplos no son construidos para limitar el ámbito de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1. Aislamiento de Células Madre Mesenquimales Derivadas de Tejido Adiposo.

Se aisló el tejido adiposo de la grasa abdominal mediante liposucción y se lavo con PBS. El tejido adiposo aislado se cortó finamente y posteriormente digerido en un medio DMEM complementado con colagenasa tipo 1 (1mg/ml) a 37°C durante 2 horas. Después de lavar la colagenasa de tejido tratado con PBS, el tejido digerido se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante, y los sedimentos se lavaron con PBS y posteriormente se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. Después de eliminar los materiales flotantes mediante filtración que utiliza una malla-100, las células resultantes se lavaron con PBS y se cultivaron en un DMEM complementado con 10% FBS, 2Mm N-acetilo-L-cisteína (NAC) y 0.2 mM de ácido ascórbico.

Después de una noche, las células no adherentes se lavaron PBS. Posteriormente, las células restantes se sub-cultivaron mientras el medio se remplazo con el medio de Queratinocitos-SFM (K-SFM) que contiene 5% de FBS, NAC 2mM, ácido ascórbico 0.2Mm, calcio 0.09mM, rEGF 5ng/ml, insulina 5ng/ml, 10ng de bFGF, hidrocortisona 74ng/ml y selenio 1ng/ml cada día, aislando de este modo las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo.

Ejemplo 2. Aislamiento de Célula Madre Mesenquimal derivada de Tejido Adiposo 2-1: Capacidad de Mantenimiento de una sola célula de las Células Madre (1) Tratamiento con solución salina normal que contiene Ácido Acetilsalicílico en cada concentración Después de que las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo en el Ejemplo 1 se trato con tripsina, las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo tratadas con tripsina (1.0 X 10 7 células) se suspendieron en solución salina normal que contiene ácido acetilsalicílico (Sigma; A5376) en cada concentración, y se observo el intervalo de supervivencia a las 12 a 24 horas. La solución salina normal que contiene ácido acetilsalicílico se preparo agregando ácido acetilsalicílico a la solución salina normal en cada concentración y se realizó sonicación a 37°C durante 30 minutos.

(Tabla 1) Como un resultado experimental, se puede confirmar que en el caso en el que la cantidad de aspirina agregada a 10ml de solución salina normal fue de 1.0mg o más, se exhibió un efecto citotóxico. (2) Tratamiento con Solución Salina Normal que contiene Inyección de Arthalgyl en cada concentración Después de que las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo aisladas en el Ejemplo 1 se trataron con tripsina, las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo tratado con tripsina (1.0 X1077 células) se suspendieron en solución salina normal que contiene inyección de Arthalgyl en cada concentración, y se observaron los intervalos de supervivencia a las 12, 24, 48 y 72 horas.

(Tabla 2) Como un resultado experimental, se puede confirmar que en el caso en el que una cantidad de aspirina agregada a 10ml de solución salina normal 0.001 a 0.1 mg, la aspirina no afecto la supervivencia de las células madre de tejido adiposo. Al momento de suspender las células madre en la solución que contiene aspirina, las células madre de tejido adiposo suspendidas se pueden almacenar hasta 72 horas, pero es preferible que las células madre de tejido adiposo suspendidas sean tratados dentro de 24 horas. (3) Capacidad de Proliferación de Células Madre Tratadas con Solución Salina que contiene Inyección de Arthalgyl en Cada Concentración Después de que las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo aisladas en el Ejemplo 1 se trataron con tripsina, las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo tratado con tripsina (1.0 X1077 células) se suspendieron en solución salina normal que contiene inyección de Arthalgyl en cada concentración, y se observaron los intervalos de supervivencia después de 24 horas.

(Tabla 3) Intervalo de Supervivencia Concentración de Aspirina (mg/10ml) Como un resultado experimental, se puede confirmar que en el caso en el que una cantidad de aspirina se agregó a 10ml de solución salina normal 0.001 a 0.1 mg, la aspirina no afecta la capacidad de proliferación de las células madre de tejido adiposo.

Además, como resultado obtenido observando el numero de células y un intervalo de supervivencia después de cultivar las células suspendidas (1.0 X 106 células) durante 7 días, como se muestra en la Tabla 4, el intervalo de supervivencia fue de 86 a 90% y como se muestra en la Tabla 5, el número de células no fue casi cambiado por la adición de aspirina (0.001 ~0.1 mg/10ml).

(Tabla 4) < Intervalo de supervivencia después de 24 horas en cada concentración de Aspirina (n=3)> (Tabla 5) < Al momento de suspender las células durante 24 Horas en cada Concentración de Aspirina y Cultivo, Influencia de capacidad de Proliferación (n=3)> (4) Agregación de Células Madre Tratadas con Solución Salina Normal que Contiene Inyección de Arthalgyl en cada concentración.

Después de tratar las células madre mesenquimales aisladas en el Ejemplo 1 con tripsina y se suspenden las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo tratados con tripsina en solución salina normal que contiene inyección de Arthalgyl en cada concentración, se observaron los grados de agregación después de 24 y 72 horas.

Como resultado, se confirmo que después de 24 horas, en un grupo de control, se observo agregación más frecuentemente, y se puede apreciar que en el caso en el que la cantidad de la inyección de Arthalgyl es de 0.001 a 0.1 mg, la agregación de las células madre de tejido adiposo se disminuyó (Fig. 1). En un grupo experimental de células madre de alta concentración (1 X 105 células), así como también un grupo experimental de células madre de baja concentración (5 X 104 células), se confirmó un efecto de prevención de la agregación de aspirina.

Como un resultado obtenido mediante la confirmación de grados de agregación después de 72 horas, en un grupo de control y un grupo tratado con Vg/ml de aspirina, se observo apoptosis de las células junto con un fenómeno de agregación, pero en grupos tratados con al menos 10pg/ml de aspirina, este fenómeno no se observó cómo se muestra en la Fig. 2. (5) Características de las Células Madre Tratadas con Solución Salina Normal que Contiene lisina aspirina (Shin poong) Después de que las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposa aisladas en el Ejemplo 1 se trataron con tripcina, las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo tratadas con tripsina (1.0 X 106 células) se suspendieron en solución salina normal que contiene lisina aspirina (Shin poong) en cada concentración y cultivada durante 5 días, y se midió el numero de células. Posteriormente, después de almacenar a temperatura fría durante 24 horas, el FACS se midió, de este modo se confirmaron las características de las células.

(Tabla 6) Como un resultado experimental, un intervalo de supervivencia celular que depende de la concentración de lisina aspirina disminuyo ligeramente, pero la disminución no fue significativa. Además, hubo una diferencia individual, pero tampoco hubo cambio en el número de células después de cultivar durante 5 días. En el caso de las características de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo almacenadas a temperatura fría durante 24 horas, después de ser suspendida en solución salina normal que contiene aspirina durante 24 horas, se observó que no hay influencia de la concentración de la aspirina.

Como un resultado experimental, no se mostró el efecto citotóxico de lisina aspirina al intervalo de supervivencia, y se observo que en el caso de almacenamiento de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo en solución salina normal que contiene aspirina, se puede evitar la agregación sin causar cambios en las características de las células.

Aplicabilidad Industrial De acuerdo a la presente invención, se puede evitar la interrupción y agregación de células madre durante el transporte y almacenamiento y puede obtenerse una excelente seguridad, de tal manera que las células madre adecuadas para la administración intracorpórea, y que tienen excelente seguridad se pueden obtener, de este modo aumenta notablemente un efecto de terapia celular mediante la administración de células madre. Aunque la presente invención ha sido descrita en detalle basada en características particulares de la misma, es obvio para los expertos en la técnica que estas tecnologías específicas son meramente formas de realización preferentes y de este modo el ámbito de la presente invención no se limita a las formas de realización. Por lo que, el ámbito sustancial de la presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas y equivalentes de la misma.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para evitar la interrupción y agregación de células madre, el método comprende: suspensión de células madre en una solución que contiene aspirina.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha aspirina es aspirina a base de isosorbida o aspirina a base de ácido nicotínico.

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha solución que contiene aspirina además comprende solución salina normal, solución Hartman-D ó solución salina tamponada con fosfato (PBS).

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido de la aspirina es de 0.0001 a 0.001 mg/ml.

5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células madre son células madre adultas.

6. El método de la reivindicación 5, caracterizado porque dichas células madre son células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AdMSCs).

7. Una composición para administración intravascular de células madre, la composición que comprende células madre; y una solución que contiene aspirina, caracterizada porque dichas células madre se suspenden en dicha solución que contiene aspirina.

8. La composición de la reivindicación 7, caracterizada porque dicha solución que contiene aspirina además de que comprende solución salina normal, solución de Hartman-D ó solución tamponada de fosfato (PBS).

9. La composición de la reivindicación 7, caracterizada porque dichas células madre son células madre adultas.

10. La composición de la reivindicación 9, caracterizada porque las células madre son célula madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AdMSCs).

11. Una composición para evitar la interrupción y agregación de células madre, la composición que comprende células madre; y una solución que contiene aspirina, caracterizada porque dichas células madre se suspenden en dicha solución que contiene aspirina.

12. La composición de la reivindicación 11, caracterizada porque dicha solución que contiene aspirina además comprende solución salina normal, solución de Hartman-D o solución salina tamponada de Fosfato (PBS).

13. La composición de la reivindicación 11, caracterizada porque dichas células madre son células madre adultas.

14. La composición de la reivindicación 13, caracterizada porque dichas células madre son células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AdMSCs).