KR101648915B1

KR101648915B1 - 줄기세포의 응집방지 방법 및 그 조성물

Info

Publication number: KR101648915B1
Application number: KR1020160059519A
Authority: KR
Inventors: 조유인; 최고미
Original assignee: 주식회사 디지레이
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2016-08-17

Abstract

본 발명은 줄기세포의 응집방지 방법 및 그 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 동물의 줄기세포를 이송 또는 보관할 때 비타민 C 함유용액에 부유시킴으로서, 하나의 세포가 다른 세포와 응집(aggregation)하는 것을 방지하는 줄기세포의 응집방지 방법과 이에 관련된 줄기세포 응집방지용 조성물에 관한 것이다.

Description

줄기세포의 응집방지 방법 및 그 조성물{Method for preventing aggregation of stem cells and composition thereof}

줄기세포는 미분화 상태에서 자신과 동일한 세포로 지속적으로 분열 할 수 있는 세포적 성질과 특정한 조건에서 환경 또는 그 기능에 해당하는 세포로 분화하는 특징을 가지고 있는 세포를 말한다. 즉, 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에 존재하는 미분화 세포로서 끊임없이 스스로 증식하는 자가 재생능력(self renewal)과 신체내의 다양한 조직으로 분화기능을 가진 만능세포이다.

이러한 줄기세포는 분화능과 생성시기에 따라 크게 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 구분할 수 있다. 인간의 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 만들어지기 때문에 많은 윤리적인 문제점을 가지고 있으나, 성체 줄기세포에 비하여 세포증식 및 분화능력이 우수한 것으로 알려져 있다. 반면, 성체 줄기세포는 지방, 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 수득할 수 있어서 배아 줄기세포에 반해 수득 범위와 수득률이 높으며, 윤리적인 문제에서 자유로울 수 있다.

대표적인 성체 줄기세포에는 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSCs)와 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)가 있다. 조혈모세포에는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 주로 혈액내의 혈구세포로 분화하는 반면, 중간엽 줄기세포는 연골세포(chondroblast), 골세포(osteoblast), 지방세포(adipocyte), 근육세포 (myocyte), 신경세포 등 중배엽성 조직의 세포로 분화하는 것으로 알려져 있다.

근래 성체 줄기세포의 효과적인 분리 및 배양방법이 알려지면서 세포 치료제로서의 임상적 적용에도 관심이 고조되고 있으며, 특히 파킨슨병이나 알츠하이머병과 같은 신경 퇴행성 질환, 척추손상에 의한 사지마비, 간경화, 소아 당뇨병, 백혈병, 기타 만성질환에 외부로부터 부족한 세포를 공급해 주는 재생의학 분야의 세포 대체요법(cell replacement therapy)이 효과적인 치료법으로 제시되고 있다.

이러한 추세에 따라 줄기세포의 기능 및 활용에 대하여 다양한 연구가 진행되고 있는데, 그 중에서도 중간엽 줄기세포를 이용한 세포치료 기술이 각광을 받기 시작하면서, 인체로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 세포치료에 적합하도록 개선하기 위한 기술이 개발되고 있다.

그런데 중간엽 줄기세포는 부착 의존성 세포로서 부유배양 과정에서 세포응집(aggregation) 현상이 일어난다. 이러한 응집현상은 세포의 인 비보(in vivo) 활성도를 증가시킬 수 있으나, 산업적으로 체외에서 부유배양을 하거나 필요에 따라 단세포의 형태로 인 비보(in vivo)에 적용하고자 할 때는 이러한 세포응집을 방지할 필요가 있다.

이와 관련하여 한국 특허 제10-1293637호(2013년 07월 31일)에는, 혐기적(anoxia) 조건을 조성함으로써 줄기세포의 응집현상(aggregation)이 억제된 조건 하에서 ROCK 억제제(Rho-associated kinase inhibitor)의 존재 하에서 인간 중배엽 줄기세포를 부유 배양하는 단계를 포함하는 인간 중배엽 줄기세포의 세포사 억제방법이 소개되어 있고, 또한 한국 특허 제10-1467481호(2014년 11월 25일)에는 줄기세포를 아스피린(aspirin) 함유 용액에 부유시켜서 줄기세포의 응집을 방지하는 방법이 소개되어 있다.

그런데 잘 알려진 바와 같이, 인간을 제외한 포유류에게는 아스피린이나 아세트아미노펜, 이브프로펜, 기타 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)에 대한 대사능력이 없다. 그래서 개나 고양이 등과 같은 동물에게 아스피린을 장기투여하게 되면, 위 점막 복구 능력의 손상으로 인해 위궤양, 십이지장궤양 같은 위 점막 장해가 발생될 수 있고, 신장 내 혈류량의 감소로 인한 만성신부전, 혈소판 응집 억제작용의 과잉으로 인한 출혈 등이 발생할 수 있다. 그래서 당뇨, 간부전 또는 신부전 등 질환을 지닌 동물을 치료할 목적으로 아스피린이 함유된 줄기세포 치료제를 투여할 경우, 치료 효과에 비해 병환이 더 악화될 가능성도 배제할 수 없다.

한국 특허 제10-1293637호(2013년 07월 31일) 한국 특허 제10-1467481호(2014년 11월 25일)

본 발명의 목적은 동물의 줄기세포를 이송 또는 보관할 때 세포 간 응집현상을 효과적으로 방지할 수 있는 줄기세포의 응집방지 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 필요에 따라 줄기세포와 함께 그대로 동물 체내에 투여할 수 있는 줄기세포 응집방지용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생체에 대한 부작용이 전혀 없어서 세포 치료가 필요한 동물에게 아스피린을 대신하여 안전하게 사용할 수 있는 혈관 투여용 줄기세포 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 줄기세포의 응집방지 방법은, 줄기세포를 비타민 C 함유용액에 부유시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 따른 줄기세포 응집방지용 조성물은, 비타민 C를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

마지막으로 본 발명에 따른 혈관 투여용 줄기세포 조성물은, 줄기세포가 비타민 C 함유용액에 부유되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 줄기세포를 이송하거나 보관할 때, 줄기세포의 특성 중 하나인 세포 응집현상을 방지할 수 있어서 동물 체내투여에 적합한 우수한 줄기세포를 확보할 수 있고, 나아가 체내에 투여된 줄기세포가 각각 하나의 단세포로서 안정적으로 표적 부위에 도달하여 활성을 나타내기 때문에 세포치료의 효능을 획기적으로 증진시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 사용되는 지방 유래 중간엽 줄기세포에 대하여 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 특이적 마커의 발현 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 다양한 농도의 비타민 C 함유용액과 아스피린 함유용액에 각각 24시간 동안 노출시킨 줄기세포의 응집 정도를 비교하여 촬영한 현미경 사진이다.
도 3은 다양한 농도의 비타민 C 함유용액에 24시간 동안 노출시킨 줄기세포에 대하여 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 특이적 마커의 발현 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 설명하는데 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 발명에서‘중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)’라 함은, 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 특히, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.

상기 ‘지방 유래 중간엽 줄기세포’란 지방 조직에서 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포로서, 본 발명에서는 이를 축약하여 ‘지방 줄기세포’ 또는 ‘지방 유래 줄기세포’라고 지칭하기도 한다. 상기 지방 유래 중간엽 줄기세포는 공지된 통상의 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들면, 포유류의 복부 또는 둔부를 절개하여 지방을 채취하고 분리, 배양한 후, 플라스크 등 배양 용기에 부착된 줄기세포 층을 트립신으로 처리한 다음 회수하거나, 스크래퍼로 긁어서 소량의 생리 식염수에 부유되는 것을 직접 회수하거나 하는 방법 등을 통해 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포의 응집방지 방법은 줄기세포를 비타민 C 함유용액에 부유시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 줄기세포 응집방지용 조성물은 비타민 C를 유효성분으로 포함한다.

상기 ‘비타민 C 함유용액’은 비타민 C 화합물, 즉 아스코르브산(ascorbic acid)을 함유하는 용액을 의미한다. 이때 용매로는 생리식염수를 사용하는 것이 바람직하고, 그 외에도 하트만-D 용액, PBS(Phosphate Buffered Saline), HBSS(Hank's Balanced Salt Sol'n.), GBSS(Gey's Balanced Salt Sol'n) 등을 사용할 수 있다. 상기 비타민 C는 아스코르브산 화합물은 물론, 시판 중인 비타민 C 제제를 사용할 수도 있다.

상기 비타민 C 함유용액에 포함되어 있는 비타민 C의 함량은 0.1 내지 0.5 mM(이하, ‘mM’은 'mmol'을 나타낸다.)인 것이 바람직하다. 상기 비타민 C의 함량이 0.1 mM 미만이면 줄기세포의 응집을 억제하는 효과가 미미하고, 반대로 0.5 mM을 초과하면 줄기세포의 생존률이 감소할 수 있다.

상기 비타민 C 함유용액에서 비타민 C의 함량이 0.5 mM을 초과하면 세포의 생존률이 감소하는 것은 비타민 C의 산성도와 관련이 있는 것으로 짐작된다. 따라서, 비타민 C의 함량이 0.5 mM을 초과하더라도 상기 비타민 C 함유용액의 산도를 조절해 주는 수단을 강구하면, 줄기세포의 생존률이 감소하는 현상을 해결할 수 있을 것으로 추측된다.

이와 같이, 줄기세포를 비타민 C 함유용액에 부유시키면, 줄기세포를 배송하거나 보관하는 도중에 세포간의 응집(aggregation)이 나타나지 않으며, 상기 줄기세포는 비타민 C 함유용액과 함께 그대로 동물 체내에 바로 투여할 수 있다. 또한, 상기 줄기세포를 혈관으로 투여할 경우, 비타민 C 함유 생리식염수에 부유시킨 상태로 바로 혈관에 투여할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용되는 줄기세포는 성체 줄기세포, 바람직하게는 지방 유래 중간엽 줄기세포 (Adipose tissue-derived mesencymal stem cell, AdMSCs) 일 수 있다. 상기 지방 조직은 포유류 유래인 것이 바람직하고, 그 중에서도 개 또는 고양이 유래인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 상기 줄기세포의 획득에 사용되는 기본배지로서는 당 업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 공지되어 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 예를 들어 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지이면 족하다.

바람직하게는, MEM-alpha 배지(GIBCO), 저농도 글루코오스 함유 DMEM 배지(GIBCO), 및 K-SFM(GIBCO)로 구성된 군에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 저농도 글루코오스 함유 DMEM 배지와 항생제를 혼합한 것을 사용할 수 있다. 상기 항생제로는 페니실린과 스트렙토마이신(GIBCO)을 사용할 수 있지만 이에 제한되지 않으며 통상 대체 가능한 항생제라면 제한 없이 사용 가능하다.

상기 줄기세포의 획득에 사용되는 배지에는 줄기세포의 미분화된 표현형의 증식을 촉진하면서 분화는 억제하는 첨가제가 보충될 수 있다. 또한, 상기 배지에는 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다.

이외에도, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 대부분의 유사한 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-멜캅토에탄올)을 함유할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 보호 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에서는 개의 지방 유래 성체 줄기세포를 사용하였으나, 다른 유래 즉, 고양이 또는 인간 성체 줄기세포를 사용하여도 동일한 효과가 있음은 자명하다.

[ 실시예 1 ] 지방 유래 중간엽 줄기세포의 분리

개의 복부 또는 둔부 절개술에 의해 분리된 지방조직을 PBS로 세척하고, 상기 지방조직을 잘게 자른 후 콜라게네이즈 타입 1/4 (0.5mg/ml)을 첨가한 PBS를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 조직을 분해하였다.

콜라게네이즈 처리된 상기 지방조직을 700 X g의 속도로 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 펠렛을 콜라게네이즈 활성 억제제로 세척한 후 500 X g의 속도로 다시 5분간 원심분리 하였다. 이어 100㎛ mesh에서 필터링하여 잔여 부유물을 제거한 후 PBS로 두번 세척하고, 10% FBS, 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다.

하룻밤 지난 후 배양용기 바닥에 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 10% FBS, 1% P/S 가 첨가된 DMEM 배지를 2일 또는 3일마다 교체하면서 계대 배양하여 지방 유래 중간엽 줄기세포를 분리하였다.

[ 실시예 2 ] 중간엽 줄기세포의 특성 분석

상기 실시예 1에서 분리한 중간엽 줄기세포를 부착배양법으로 배양한 다음, 각각의 특이적 항체를 사용하여 지방 유래 줄기세포의 특성을 분석하였다. 구체적으로, 상기 중간엽 줄기세포를 PBS 로 1회 세척한 후 트립신(GIBCO)을 처리하여 단세포로 해리시키고, 원심분리를 실시하여 세포를 획득한 후 BSA를 2% 함유하는 FACS buffer에 현탁 시킨 다음, CD29-PE, CD34-PE, CD44-APC, CD45-FITC 항체를 조합하여 처리하였다.

다시 FACS buffer로 2회 세척한 후 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 세포특성을 분석하고(Beckman FACSCalibur), 그 결과를 도 1에 수록하였다. 첨부 도 1에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 1에서 분리한 중간엽 줄기세포는 줄기세포의 특이적 마커 단백질로 알려진 CD29 및 CD44가 99.9%±2.7 발현되었고, 다른 줄기세포의 비특이적 마커인 CD34 및 CD45는 0~1%±1 정도로 발현됨을 확인하였다.

[ 실시예 3 ] 비타민 C 함유용액의 세포독성 시험

상기 실시예 1에서 분리한 중간엽 줄기세포를 PBS로 1회 세척하고, 트립신(GIBCO)을 처리하여 단세포로 해리시킨 후 원심분리를 실시하여 줄기세포를 획득하였다. 생리식염수에다 비타민 C, 즉 아스코르브산(Sigma; A5960)을 다음 표 1의 농도별로 첨가한 비타민 C 함유용액을 제조하고, 여기에 각각 상기 줄기세포를 1.0 X 10⁶ cells/ml 농도로 부유시킨 후, 12시간, 24시간 경과 시의 생존률을 측정하고, 그 결과를 다음 < 표 1 >에 수록하였다.

측정 시간	비타민 C의 농도별 세포 생존률
측정 시간	0 mM	0.01 mM	0.1 mM	0.5 mM	1 mM	2 mM
12시간 경과	96.51%	96.07%	98.06%	96.97%	71.43%	15.87%
24시간 경과	96.15%	97.95%	98.34%	96.67%	56.25%	0.00%

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 비타민 C 함유용액은 비타민 C의 농도가 0.5 mM 이하인 경우, 줄기세포에 대한 독성이 거의 없었으나, 비타민 C의 농도가 1 mM 이상인 경우에는 상당한 세포독성이 나타내는데, 이는 비타민 C의 농도가 증가하면 용액의 산도가 증가하기 때문인 것으로 짐작된다. 그리고, 상기 표 1에서 비타민 C의 농도가 0.01 mM 및 0.1 mM 일 때, 24시간 경과시의 세포 생존률이 오히려 증가한 것은 실험 오차인 것으로 짐작된다.

[ 실시예 4 ] 비타민 C 함유용액의 세포응집 억제효과에 대한 비교

상기 실시예 1에서 분리한 중간엽 줄기세포를 PBS 로 1회 세척하고, 트립신(GIBCO)을 처리하여 단세포로 해리시킨 후, 원심분리를 실시하여 줄기세포를 획득하였다. 생리식염수에다 아스코르브산을 각 농도별로 첨가하여 비타민 C 함유용액을 제조하고, 여기에 상기 줄기세포를 5.0 X 10⁵ cells/ml 또는 1.0 X 10⁶ cells/ml 농도로 부유시킨 후, 24시간 경과 시점에서 세포의 응집정도를 관찰하였다.

한편, 대조군으로서, 생리식염수에다 아스피린, 즉 아세틸살리실산을 각 농도별로 첨가하여 아스피린 함유용액을 제조하고, 여기에 상기 줄기세포를 5.0 X 10⁵ cells/ml 또는 1.0 X 10⁶ cells/ml의 농도로 부유시킨 후, 24시간 경과 시점에서 세포의 응집정도를 관찰하였다.

첨부 도 2의 (A)는 0.01 내지 0.5 mM 농도의 비타민 C 용액에 각각 24시간 동안 노출시킨 저농도(5.0 X 10⁵ cells/ml) 줄기세포를 배양 접시로 옮긴 다음, 현미경을 이용하아여 세포의 응집 정도를 관찰한 사진이고, (B)는 0.05 내지 1 mM 농도의 아스피린 용액에 24시간 동안 노출시킨 저농도 줄기세포의 응집정도를 관찰한 사진이다.

또한, 도 2의 (C)는 0.01 내지 0.5 mM 농도의 비타민 C 용액에 24시간 동안 노출시킨 고농도(1.0 X 10⁶ cells/ml) 줄기세포의 응집 정도를 관찰한 사진이고, (D)는 0.05 내지 1 mM 농도의 아스피린 용액에 24시간 동안 노출시킨 고농도 줄기세포의 응집 정도를 관찰한 사진이다. 상기 도 2의 사진을 촬영하는데 사용한 현미경 모델은 ‘samwon NSI-100’이고, 사진 배율은 ‘40X’이며, 카메라 기종은 ‘삼성 SBC-5000D’을 사용하였다.

첨부 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 비타민 C 함유용액은 비타민 C 의 농도가 증가 할수록 세포 간 응집이 감소되는 것을 확인할 수 있으며, 대조군인 아스피린 함유용액과 거의 동등 이상의 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

[ 실시예 5 ] 비타민 C 함유용액으로 처리한 줄기세포의 특성 분석

실시예 1에서 분리한 중간엽 줄기세포에 트립신을 처리하고, 상기 줄기세포를 비타민 C 함유용액에 1.0 X 10⁶ cells 농도로 부유시킨 후, 7일간 배양하여 세포수를 측정하였다. 이어 상기 줄기세포를 24시간 냉장 보관 후 FACS 분석을 통해 특이적 마커의 발현을 검증하고, 그 결과를 도 3에 수록하였다.

첨부 도 3에서 보는 바와 같이, 줄기세포의 특이적 마커 단백질로 알려진 CD29 및 CD44가 99.9%±2.7 발현되었고, 다른 줄기세포의 비특이적 마커인 CD45는 0~1%±1 정도로 발현 되었다. 이와 같이, 본 발명에 따른 줄기세포 응집방지용 조성물은 상기 지방 유래 중간엽 줄기세포를 부유시킨 상태로 24시간 동안 냉장 보관하여도 상기 줄기세포의 특성에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.

Claims

줄기세포를 비타민 C 함유용액에 부유시키는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 응집방지 방법.
제1항에 있어서, 상기 비타민 C 함유용액은 생리식염수, 하트만-D 용액, PBS(Phosphate Buffered Saline), HBSS(Hank's Balanced Salt Sol'n), GBSS(Gey's Balanced Salt Sol'n) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 응집방지 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비타민 C 함유용액에 포함되어 있는 비타민 C의 농도는 0.1 내지 0.5 mM 인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 응집방지 방법.
비타민 C를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 응집방지용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 비타민 C는 생리식염수, 하트만-D 용액, PBS(Phosphate Buffered Saline), HBSS(Hank's Balanced Salt Sol'n), GBSS(Gey's Balanced Salt Sol'n) 중에서 선택된 어느 하나의 용매 중에 0.1 내지 0.5 mM의 농도로 용해되어 있는 것을 특징으로 하는 줄기세포 응집방지용 조성물.
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