KR20240096758A - 성장 인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유체 표유류 혈소판 농축물로부터 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법과 관련되고, 혈소판 농축물을 비-외막형 바이러스들을 파괴하기 위한 제1 병원체 농도 저감 단계에 종속시키는 단계; 혈소판들이 성장 인자들을 방출하도록 활성화 단계에 혈소판 농축물을 활성화 단계에 종속시키는 단계; 피브리노겐 결핍 유체 혈소판 방출물을 회수하는 단계; 피브리노겐 결핍 유체 혈소판 방출물을 외막형 바이러스들을 파괴하기 위한 제2 병원체 농도 저감 단계에 종속시키는 단계; 혈소판 방출물을 살균 필터링에 종속시키고 성장 인자들을 함유하는 여과액을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법으로 획득된 혈소판 방출물은 재생 의료에 있어서의 다계통 세포들의 증식을 향상시키기 위한 치료제로서 사용될 수 있고, 미치료성 상처(non healing wound)들 및 저항성 궤양들의 관리에 있어서 사용될 수 있다. 두 번째의 인디케이션은 세포 배양 배지에서 소 태아 혈청(fetal bovine serum)에 대한 대체제이다.
본 발명의 방법으로 획득된 혈소판 방출물은 재생 의료에 있어서의 다계통 세포들의 증식을 향상시키기 위한 치료제로서 사용될 수 있고, 미치료성 상처(non healing wound)들 및 저항성 궤양들의 관리에 있어서 사용될 수 있다. 두 번째의 인디케이션은 세포 배양 배지에서 소 태아 혈청(fetal bovine serum)에 대한 대체제이다.
Description
본 발명은 첫 번째 청구항의 전제부에 따른, 유체 표유류 혈소판 농축물(fluid mammalian platelet concentrate)으로부터 성장-인자들 함유 혈소판 방출물(platelet releasate)을 제조하는 방법과 관련된다.
포유류 혈소판은 중요한 생리학적 기능들을 갖는 무수한 생리활성제들을 함유한다. 그 중에서도, 성장 인자들은 상이한 세포주 증식 및 조직 재생 - 이들은 둘 다 재생 의료, 상처 및 궤양 치료에 있어서 중요함 -의 향상에 있어서의 그 역할 때문에 특히 관심이 있는 것이다.
치의학, 성형외과 및 재생 의료에 있어서 환자 자가 혈소판 풍부 혈장(Platelet Rich Plasmal; PRP)을 사용하는 개념은 1990년대 초부터 이미 개발되었다. 혈소판들은 환자 자신의 항응고된 전혈(anticoagulated whole blood)의 원심 분리에 의해 또는 메드트로닉(Medtronic)의 마젤란(Magellan) 또는 하베스트(Harvest)의 스마트프리프(SmartPrep.)와 같은 특수한 디바이스를 사용하여 획득되었다. 이러한 자가 혈소판들의 사용은, 그러나, 빈혈 환자나 장기간에 걸쳐 다량의 사용을 요구하는 경우에 있어서 위험하게 될 수 있다. 자가 PRP의 가장 중요한 한계 중 하나는 혈소판 농축물들을 제조하기 위한 전용 기계 또는 실험실에 대한 필요성이다. 이들을 사용하기에 적합하게 하기 위해, 혈소판은, 즉, 혈소판이 자신의 알파 과립들의 함량을 방출하도록 활성화된다. 그러나, PRP를 환자와 분리한 후 몇 시간 내에 PRP를 사용하는 것이 필수적이게 되고, 그렇지 않으면, 그 안에 함유된 성장 인자들은 그 생리활성의 상당한 부분을 잃게 될 위험이 있다.
몇몇의 기법들이 혈소판들을 보존하기 위해 설명되었다. DMSO의 첨가 및 트레할로스(trehalose)는 혈소판들의 보존을 연장시키기 위한 적절한 방법들의 두 가지 예시들이고, 동결 건조(lyophilization)(동결-건조)에 종속되었거나 그렇지 않은 혈소판들에 대해 둘 다 적용된다. 동결 건조 공정들과 함께 사용되는 동결 방지제(Cryoprotectant) 조성물들은 보존과 관련하여 유사한 결과를 가져왔다. 손상되지 않은 혈소판들에 방부제(preservative)들 및/또는 동결 건조를 단지 사용하는 이러한 접근법들의 단점들은 단백질들, 수용체들 및 이와 유사한 것들이 혈소판 표면 또는 혈소판들 내에서 유지된다는 사실과 관련된다. 예컨대, 몇몇의 혈소판 막 수용체들은 예컨대, 혈소판 접착, 응집 등에 대한, 혈소판 활성화에 따라 세포외 인자들과의 결합(binding)을 위해 온전한 상태로 남아 있다.
따라서, 혈액 혈소판들을, 상처 치료, 피부 치료, 폐 조직과 같은 (신체 장기들을 포함하는) 신체 조직의 장애들의 치료 및 이와 유사한 것들을 포함하는 넓고 다양한 어플리케이션들에 있어서의 효율적인 사용을 위해 적합한 제제(preparation)로 전환하도록 허용하는 보다 범용적인 방법의 전개는 유익할 것이다. 따라서, 이러한 제제의 세포외 인자들과의 원치 않는 상호 작용에 대한 위험은 최소화되어야 한다
WO2013113024는, 혈소판들이 농축되고 혈소판의 막을 파괴하기 위한 용해(lysing)에 종속되는, 치료용 또는 배양 배지로서의 사용을 위해 적합한 조성물의 제조 방법을 개시한다. 혈소판들의 적어도 30 %는 용해될 수 있다. 동결 건조된 혈소판 용해물(lysate)들은 가용한 성장 인자들, 사이토카인들 및 케모카인들의 방출된 농도들을 또한 함유하는 조성물로 형성된다. WO2013113024는 또한 표유류 조직을 치료하는 방법을 개시하고, 이러한 방법은 치료를 위한 포유류 조직 부위(site)에 동결 건조된 혈소판 용해물들을 포함하는 앞서 설명한 조성물을 적용하는 단계들을 포함한다. 일 예에서, 동결 건조된 혈소판 용해물들은 소스 혈소판들로부터 제조되며, 소스 혈소판들의 적어도 30 %가 동결 건조된 혈소판 용해물들을 형성하도록 용해된다. 그러나, 용해물은 피브리노겐을 결핍하지 않으며 WO2013113024는 바이러스 또는 병원체 감염의 문제점을 인식하고 있지 않고 이러한 문제를 해결하지도 못한다.
EP2389942는 혈소판 유도성 성장 인자(PDGF)들 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)들이 결핍된 바이러스-비활성 성장 인자들-함유 혈소판 용해물의 제조 방법을 개시하고, 이러한 방법은 인 비트로(in vitro) 또는 익스 비보(ex vivo) 세포 배치에 적합하며, 줄기 세포들의 증식 및 조골 세포 계통 및/또는 연골 세포들로의 분화를 촉진시키기 위해 적합하다. 상기 방법은 혈소판 농축물을 0.2 내지 5 vol.% 용매 및/또는 계면활성제를 사용하여 5 분 내지 6 시간 동안, 약 6.0 내지 약 9.0의 pH 및 2 ℃ 내지 50 ℃ 사이의 온도에서 배양하여 접촉시키는 단계와, 수성 단백질 상(phase)을 획득하도록 오일 추출법에 의해 용매 및/또는 계면활성제를 제거하는 단계와, 용매/계면활성제를 제거하도록 차콜(charcoal)으로 수성 단백질 상을 배양하는 단계를 포함한다. 예비적인 단계는, 신선하고, 만료되어 저장된 액체 또는 만료되고 저장되어 동결된 것일 수 있는, 전혈로부터 분반법(apheresis) 또는 버피-코트 분리법에 의해, 시작 혈소판 농축물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 혈소판 용해물은 성장 인자들 TGF-β, IGF, EGF 및/또는 bFGF를 포함한다. EP2389942에 개시된 방법은 그러나 몇몇의 단점들을 나타낸다. 혈소판 용해물은 인 비트로 또는 익스 비보 세포 배양에 대해 적합하게 될 수 있으나, 모든 혈소판 유도성 인자들, 특히, PDGF 및 VEGF의 완전한 칵테일이, 상처 치료와 같은, 재생 의학에 있어서의 혈소판 용해물들의 임상적인 사용을 위해 요구되므로, 뼈 골절 치료를 포함하는 재생 의료에 있어서의 임상적 어플리케이션에 대해서는 불충분하게 효과적일 것으로 기대된다. 용매 추출은 종종 원래의 부피에 대해 단지 10-15 vol. %의 낮은 혈소판 수율을 제공한다. EP2389942는 피브리노겐 결핍 단계를 포함하지 않고, 동결 건조 단계를 포함하지 않는다. 용매/계면활성제 바이러스 비활성화는 외막형 바이러스들에만 적용되지만, A형 간염(Hepatits A) 바이러스 및 파르보바이러스(Parovirus) B19와 같은 비-외막형 바이러스들을 비활성화시킬 수 없고, 용매/계면활성제 처리는 박테리아 또는 다른 미생물들과 같은 잠재적인 오염 물질들을 제거하지도 않는다.
US8734854는 비-파괴성 배지 내에서 환자의 전혈 또는 혈장으로부터 성장 인자들을 방출시키는 방법을 개시한다. 이러한 방법으로부터 획득된 성장 인자들은 상처 치료를 촉진하기 위한 표면 상처 영역에 대한 국소적인(topical) 도포, 조직 성장 및 치료를 촉진하는 찢어진 힘줄과 같은 연조직으로의 주사에 적합하다. 다른 방법에 있어서, 성장 인자들은 전혈 소스로부터 방출되고 통상적 인 동결 건조(lyophilization)에 의해 동결 건조된다. 동결 건조된 생성물은 환자의 상처의 치료 또는 수술적 처치에 있어서의 사용을 위해 생리식염수에 의해 재구성될 수 있다. US8734854는 최종 생성물이 동결 건조될 수 있음을 개시하고 있지만, 동결 건조만으로는 병원체들의 신뢰성 있는 제거를 제공하기에는 불충분하다는 것이 입증되었다. 또한, US8734854의 방법으로부터 획득된 성장 인자들은 피브리노겐이 결핍되어 있지 않다.
다른 알려진 혈소판 방출 성장 인자들은 캠비움 메디컬 테크놀로지지즈 알로제닉 풀드 휴먼 플레이트렛 라이세이트(Cambium Medical Technologies Allogeneic Pooled Human Platelet Lysate)에 의해 개발된 것들을 포함한다. 이러한 제품은 아직 상용 제품으로 출시되지 않았고, 피브리노겐이 결핍되어 있으나, 병원체/바이러스 저감 처치에 종속되었다는 인디케이션은 없다.
많은 문헌들이 소 태아 혈청의 대체제로서 혈소판 방출 성장 인자들의 역할에 대해 논의하고 있다. 중간엽 간질 세포 배양(Mesenchymal Stromal Cell Cultures)에 있어서 소 태아 혈청에 대한 대체로서 혈소판 용해물에 대한 검토가 이루어지고 있다(Transfus Med Hemother 2013;40:326-335).
EP2757879는 줄기 세포들, 섬유 아세포들 또는 수지상 세포들의 고립 및/또는 성장 및/또는 확장을 위한 공통-보조제(co-adjuvant)로서 작용할 수 있는, 혈소판 용해물의 제조 방법을 개시한다. 상기 방법은 (a) 적어도 2개의 주체들로부터 획득된 전혈 샘플들의 혼합물로부터 버피 코트 프랙션(buffy coat fraction)을 고립시키는 단계; (b) 여하한 존재하는 오염제들을 제거하기 위해 고립된 버피 코트 프랙션을 광화학제 및 UV 조사에 노출시키는 단계; (c) 버피 코트 프랙션을 거기에 함유된 혈소판들의 용해를 얻기 위해 적어도 하나의 동결/해동(freezing/thawing) 사이클에 종속시키는 단계; (d) 프랙션을 원심 분리하고 액체상을 수집하는 단계의 단계들을 포함한다. 따라서 획득된 혈소판 용해물은 줄기 세포들, 특히, 지방 조직, 섬유 아세포들 및 수지상 세포들로부터 유래된 중간엽 줄기 세포들의 중간엽의 배양, 성장 및/또는 팽창을 위한 공통-보조제로서 사용될 수 있다. EP2757879에서 개시된 방법으로 획득된 혈소판 용해물은, 그러나, 피브리노겐이 결핍되어 있지 않고, 이는 동결/해동 사이클들이 성장 인자들의 효율적인 방출을 일으킬 수 있는지 여부 및 성장 인자들의 활성이 반복된 동결/해동 사이클들에 의해 영향을 받는 지 여부가 의심스럽고, 이러한 방법은 단지 한 번의 병원체 제거 단계만을 사용한다.
시판되는 혈소판 용해물들은, 예컨대, 마코파마(Macopharma)로부터의 것들이 있다. 불행하게도, 이러한 용해물들은, 해동 후 더 작은 크기의 앨리컷(aliquot)들로 축소되어야 하는, 큰 동결 부피들로 가용하게 제조되며, 미생물학적 오염의 잠재적인 위험을 갖는다. 휴먼 밀리포어(Millipore)에 의한 인간 플레이트렛 라이세이트(Platelet Lysate), PLTMax 및 젠바이오(Zenbio)에 의해 제공되는 것들은 또한 단지 큰 동결 부피들로만 가용하고; 이들은 연구 목적으로만 사용되고, 익스 비보 치료용으로 의도되지는 않는다.
T.Burnouf 등(Biomaterials 76 (2016), 371-387)에 따르면, 혈소판 과립들에 저장된 성장 인자들과 사이토카인들은 염화칼슘염 용액의 첨가를 사용하는 직접적인 활성화, 피브린 형성 및 혈소판 탈과립화(degranulation), 또는 트롬빈을 사용하는 것에 의해 방출될 수 있다. 혈소판들로부터 성장 인자들 및 다른 생체 분자들의 방출을 유도하기 위한 다른 기법들은 반복된 동결/해동 사이클들, 음파처리(sonication) 단독 또는 동결/해동 사이클들과의 조합 또는 지질-외막형 바이러스들을 또한 비활성화시키는 용매/계면활성제 처리를 포함한다. 그러나, 반복된 동결/해동 사이클들에 혈소판들을 종속시키는 것은 성장 인자들에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 감염원들의 전염 위험은 각 개별적인 공여(donation)의 의무적인 검사에 의해 관리되고 확정적인 공여들을 사용하지 않는다. 의무적인 검사는 HIV-1/HIV-2, 항체들, B 형 간염 표면 항원, C 형 간염 바이러스 항체들의 검출을 위해 권고된다.
따라서, 성장 인자들의 최적의 수율을 제공하고, 지질 외막형 뿐만아니라 비-외막형 바이러스들 및 박테리아를 포함하는, 병원체들의 존재에 대한 최소한의 위험을 나타내는 혈소판 유도성 성장 인자들의 제조 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
따라서, 본 발명의 목적은 성장 인자들의 최적의 수율을 달성하도록 하고, 외막형 및 비-외막형 바이러스들, 박테리아, 균류(fungi) 및 기타 혈액 매개(blood borne) 미생물의 존재에 대한 최소한의 위험을 나타내는, 포유류 혈소판 농축물로부터 혈소판 유도성 성장 인자들을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
바람직한 일 실시예에 있어서, 본 발명의 목적은 가장 일반적인 병원체들 뿐만아니라 또한 기존의 기법들에 의해서는 비활성화될 수 없거나 거의 비활성화되지 않는 병원체들의 개선된 병원체 비활성화를 갖는 혈소판 유도성 성장 인자들의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 일 실시예는 재생 의료 및 상처 관리에 있어서의 사용에 적합한 혈소판 방출물을 제공하는 것을 목표로 한다. 더 바람직한 일 실시예는 세포 배양 배지에 있어서 소 태아 혈청에 대한 대체제로서 사용될 수 있는 혈소판 방출물을 제공하는 것을 목표로 한다.
성장 인자들의 최적의 수율을 제공하는 포유류 혈소판 농축물로부터의 혈소판 유도성 성장 인자들의 제조 방법의 문제점 - 혈소판 유도성 성장 인자들이 전술한 지질 외막형 및 비외막형 바이러스들, 박테리아 및 다른 혈액 매개 병원체들을 포함하는 병원체들의 존재에 대한 최소한의 위험을 나타내는 것 -은 첫 번째 청구항의 특징적인 부분의 기술적 특징을 나타내는 방법을 포함하는 본 발명에 따라 해결될 수 있다.
이에 대해, 본 발명의 성장-인자들 함유 혈소판 용해물을 제조하는 방법은
a. 혈소판 농축물을 상기 혈소판 농축물에 존재하는 미생물들의 DNA 및 RNA 둘 다를 파괴하는 목적으로 제1 병원체 농도 저감 단계에 종속시키는 단계 - 미생물들은 외막형, 비외막형 바이러스, 또는 박테리아, 균류 등을 포함함 -;
b. 상기 혈소판 농축물을 활성화제(activating agent)에 접촉시킴으로써, 혈소판들이 거기에 존재하는 적어도 일부의 알파 과립(alpha granule)들 및 성장 인자들을 방출하도록 하고, 이로 인해 유체 혈소판 방출물을 제공하도록, 상기 혈소판 농축물을 활성화 단계에 종속시키는 단계;
c. 상기 유체 혈소판 방출물을 피브리노겐 농도 저감 단계에 종속시키고, 피브리노겐 결핍 유체 혈소판 방출물을 회수하는(recovering) 단계; 본 단계는 유체 혈소판 방출물 내에서 피브리노겐의 농도를 저감하는 것을 목표로 함;
d. 상기 피브리노겐 결핍 유체 혈소판 방출물을 외막형(enveloped) 바이러스들을 파괴하는 목적으로 제2 확정적 병원체 농도 저감 단계에 종속시키는 단계;
e. 상기 혈소판 방출물을 살균 필터링(sterile filtering)에 종속시키고, 상기 성장 인자들을 함유하는 여과액(filtrate liquid)을 회수하는 단계
의 순차적인 단계들을 포함한다.
본 발명의 성장-인자들 함유 혈소판 용해물을 제조하는 방법은 다음의 순차적인 단계들을 포함한다.
(a) 상기 혈소판 농축물을 제1 병원체 농도 저감 단계에 종속 시키는 단계. 바람직한 일 실시예에서, 상기 제1 병원체 농도 저감 단계는 상기 혈소판 농축물을 광화학성 활성화제로 배양하는(incubating) 단계 및 상기 혈소판 농축물을 UV 조사에 노출시키는 단계를 포함한다. 이러한 단계는, 혈소판 농축물 내에 존재하는 미생물들의 RNA 및/또는 DNA의 비활성화 또는 파괴에 의해, 감소된 병원체 함량을 갖는 혈소판 농축물을 획득할 수 있도록 한다. 특히, 혈소판 농축물은 외막형 및 비-외막형 바이러스들의 농도가 감소되는 것을 결과로서 낳는다. 이러한 첫 번째 단계는 또한 혈소판 농축물 내에 함유된 다른 혈액 매개 미생물들의 비활성화를 가능하게 할 수 있다;
(b) 따라서 처리된 혈소판 농축물을, 상기 혈소판 농축물을 활성화제에 접촉시킴으로써, 혈소판들이 적어도 일부의 자신의 함유물, 특히, 혈소판들 내에 존재하는 적어도 일부의 알파 과립(alpha granule)들 및 성장 인자들을 포함하는 이러한 알파 과립들의 함유물을 방출하도록 하고, 혈소판 방출물을 제공하도록, 활성화 단계에 종속시키는 단계. 혈소판 방출물은 일반적으로 활성화 된 혈소판들의 잔류물들 및 활성화 단계에서 방출된 혈소판들의 함유물을 함유하는, 유체 조성물의 형태를 취할 것이다. 이러한 활성화 단계의 결과로서, 과생리학적 투여량(supra physiological dose)의 성장 인자들 및 사이토카인들이 혈소판들으로부터 혈소판 농축물을 포함하고, 추가적으로, 피브리노겐을 포함하는, 조성물 또는 용액으로 방출될 것이다. 알파 과립들은 일반적으로 대부분의 성장 인자들을 포함하기 때문에 중요하다. 포유류 혈소판들 및 이들의 농축물들의 활성화는 이들을 혈소판 파열(rupture)을 유도할 수 있고 성장 인자들, 사이토카인들 및 케모카인들의 과생리학적 투여량을 포함하는 함유물의 적어도 일부를 방출시키도록 할 수 있는 혈소판 활성화제(activator)와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 적합한 활성화제들은 칼슘염들, 예컨대, 칼슘 클로라이드, 트롬빈, 콜라겐, 트롬복산 A2 및 아데노신이인산(ADP)의 수용액을 포함한다. 트롬빈의 첨가는, 혈소판 농축물의 거의 모든 함유물을 함유하는, 거대한 응고(clot)가 형성되도록 한다. 체온과 유사한 온도, 약 37 °C에서, 충분히 긴 시간 동안의, 종종 3 시간 이상의, 배양은 응고가 포획된 혈소판들 내의 모든 성장 인자들의 발현과 함께 무시할 수 있는 크기(negligible size)로 수축하도록 한다. 본 발명은, 따라서, 혈소판 농축물의 초기 부피와 거의 동일하게 혈장 내에 현탁된(suspended) 성장 인자들의 부피가 방출되는 것을 달성할 수 있다.
(c) 상기 유체 혈소판 방출물을 피브리노겐 농도 저감 단계에 종속시키고, 피브리노겐 결핍 유체 혈소판 방출물을 회수하는(recovering) 단계. 이러한 단계는, 실제로, 혈소판들의 함유물이 방출되도록, 혈소판들로부터 방출된 피브리노겐과 이전 단계에서 첨가된 활성화제의 상호 작용에 따라 형성된 피브린 응고를 고립시키는 단계들을 포함한다. 혈소판들의 활성화 시에 방출되는 피브리노겐을 방출물로부터 가능한 한 많이 제거하는 것이 바람직하고, 이는 혈소판들이 풍부한 혈장(PRP)이 예컨대, 힘줄들, 인대들 및 관절들을 포함하는 근골격계의 상해들 또는 안면 회춘(rejuvenation) 또는 여하한 다른 치료에 있어서의 병변 내 주사로서 더 사용될 때 성가심(nuisance)을 야기할 수 있는 반고체 겔의 형성을 수 발생시킬 수 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 혈액 혈소판들의 피브리노겐 농도는 혈장보다 더 낮다. 본 발명의 방법은 혈소판 방출물로부터 피브리노겐을 격리시키고, 추가적인 사용을 위해 피브리노겐 결핍 혈소판 방출물을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다;
(d) 상기 피브리노겐 결핍 유체 혈소판 방출물을 외막형 바이러스들을 파괴 또는 비활성화하기 위한 제2 병원체 농도 저감 단계에 종속시키고, 성장 인자들을 함유하는 수성 단백질 상을 회수하는 단계. 이러한 단계의 주요한 목표는 지질 외막형 HBC, HCV 및 HIV 외막형 바이러스들과 같은 외막형 바이러스의 제거를 확정하는 것이다. 2 개의 직교성(orthogonal) 병원체 비활성화 단계들(단계 a 및 단계 d)의 사용은, 비-외막형 및 외막형 바이러스들 모두의 비활성화와, 박테리아와 같은 더 큰 미생물들 및 원생동물(protozoae)과 같은 기생충들의 비활성화를 달성하게 하므로, 특히 본 발명에 있어서 중요하게 이루어진다. 본 발명의 방법은 이와 함께 생물 약제 산업의 혈액 유도성 제품들의 현대적인 규제들의 필수적인 요건에 대응한다. 이러한 단계는 원치 않는 세포외 인자들과의 상호 작용에 대한 위험이 최소화될 수 있도록 하는 것을 보장한다.
(e) 여하한 잔류하는 고형 물질을 제거하는 목적으로 상기 피브리노겐 결핍 혈소판 방출물을 살균 필터링에 종속시키고, 성장 인자들 함유 액체 또는 유체 여과물을 회수하는 단계. 혈소판들은 포유류 혈액으로부터 유래되기 때문에, 액체 또는 유체 여과물은 주로 물 기반이거나 단백질 상을 함유하는 수용액일 것이다.
상기 설명된 방법에 있어서, 단계들은 바람직하게는 설명된 순서로 순차적으로 수행된다.
혈소판 농축 물에 존재하는 비-외막형 바이러스들의 비활성화를 달성할 수 있도록 하는 첫 번째 단계 a에 더하여, 본 발명의 방법은, 혈소판 농축물 또는 혈소판들 내에서 그 자체로 함유될 수 있는, 외막형 바이러스들, 일반적으로, 지질 외막형 바이러스들을 비활성화시키기 위한 단계를 또한 포함한다. 이를 달성하기 위한 바람직한 방법은 혈소판 방출물을, 방출물에 함유된 지질막들을 용해시키고 거기에 함유된 핵산들을 파괴시키는 목적으로, 용매 및/또는 계면활성제에 종속시키거나 용매 및/또는 계면활성제와 접촉시키는 것이고, 바람직하게는, 오일로의 용해된 지질막들을 함유하는 용매 및/또는 계면활성제를 제거하기 위한 추출 단계와, 여하한 잔여하는 고체들을 제거하기 위한 여과 단계가 이어진다.
추출 및 여과 단계의 존재에 의해, 지질 외막형 바이러스들과 박테리아와 같은 다른 병원체들 원생동물과 같은 기생충들이 비활성화될 수 있고, 혈장 및 최초 혈소판 농축물 내에 함유될 수 있는 혈소판 지질들이 제거될 수 있다. 오일 추출 및 여과의 공정 단계들은 바이러스 및 박테리아 비활성의 성장 인자들 함유 혈소판 방출물의 쉽고, 빠르고, 효율적인 제조를 가능하게 하고, 용매 및 계면활성제 농도들은 비경구성(parenteral) 혈액-유도 치료 제품들에 대한 규제 당국들에 의해 승인된 제한들을 충족하고 있다.
본 발명은, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법을 제공하고, 이를 통해 무수한(incalculable) 인자에 의한 잔류 혈액 매개 질병들의 전염에 대한 위험, 특히, 백혈구 제거에 체계적으로 종속된 혈액 생성물로부터 유래한 혈소판 생성물들에 있어서의, 위험이 최소화될 수 있다. 백혈구 제거는 다시 말해 혈액의 자체 살균 능력이 상당 부분 손실되고, 종종 완전히 손실되는 효과를 갖는다. 이는 혈장이 다양한 병원체들의 생존 또는 성장을 위한 최적의 배지를 구성하기 때문에 중요하다. 또한, 병원체 비활성화 처리들의 선택된 조합으로 인해, 본 발명으로 획득된 혈소판 유도성 성장 인자들의 완전한 안정성이 보장될 수 있다. 따라서, 치료적 처치들, 세포 치료 또는 세포 배양에 있어서의 사용을 위해 효율적으로 표준화될 수 있는, 바이러스-비활성화된 혈소판-유도성 성장 인자들의 혼합물들이 제공될 수 있다. 바이러스/병원체 비활성화의 이중적인 단계는 본 발명의 공정에 의해 획득된 생성물이 인 비보 어플리케이션을 위한 임상 연구 및 중간엽 줄기 세포 확장에 있어서 안전하게 사용되도록 하는 자격을 갖도록 한다. 결과적으로, 환자와 함께 자가 혈소판들의 사용의 필요성이 제거되고 연관된 제한이 배제된다. 또한, 자가 혈소판들의 사용을 강요하는 대신에, 본 발명은, 혈소판 농축물이 유래되는 하나 이상의 주체들로부터 유래할 수 있는 혈액 매개 질병들의 전염에 대한 최소한의 위험으로, 몇몇 피험자들로부터 유래하는, 포유류 혈액 생성물들의 풀로부터 획득된 혈소판 방출물을 사용하는 가능성을 열어준다.
본 발명의 방법은 인간 혈소판 유래 성장 인자들을 제조하기에 적합할 뿐만 아니라, 유사한 의학적 어플리케이션들을 갖는 말 혈소판들과 같은 동물 혈소판들로부터 말(equine) 유도성 성장 인자들을 제조하기 위해 최소한의 조정으로 또한 사용될 수 있다. 재구성된(reconstituted) 동결 건조된 혈소판 유도성 성장 인자들은 세포 배양 배지 및 중간엽 줄기 세포 확장에 있어서 소 태아 혈청의 대안으로서 더 사용될 수 있다.
부분적으로 박테리아 오염의 위험 및 지혈(hemostasis)을 위한 기능적 활성의 상실로 인해, 혈소판들이 일반적으로 5 또는 7일의 제한된 유통 기한을 가진다는 사실을 고려하여, 정량적 또는 기능적인 혈소판 감소증(thrombocytopenia)의 교정을 위해 정맥 내로 임상적으로 사용될 때, 5 일 또는 7 일보다 더 오래된 많은 수의 혈소판 유닛들이 일반적으로 매년 폐기된다. 만료된 혈소판 재고들이 본 발명의 혈소판 방출물과 같은 혈소판 유도성 생성물들의 제조를 위해 사용되도록 허용함에 있어서, 본 발명의 방법은 유망한 경제적 이익을 나타낸다.
본 발명은 또한 전술한 순서로 공정 단계들을 수행함으로써 획득된 방출물 부피의 양을 최대화할 수 있도록 한다. MirasolTM 시스템과 같은 현대 기법들은, 혈소판 페레시스(pheresis)에 의해 수집된 다량의 혈소판들 농축물들을, 수집된 혈소판 부피를 감소시키는 것에 대한 최소한의 위험으로, 병원체 비활성화에 대해 종속시킬 수 있다. 먼저 바이러스 비활성화가 수행된 후에만 오일 추출 단계를 수행함으로써, 병원체 제거 처리들의 결과로서 가용한 방출물의 손실 또는 감소량을 최소한으로 줄일 수 있다.
동결/해동 사이클들의 사용이 회피될 수 있기 때문에, 본 발명은, 알부민 및 면역 글로불린들과 같은 성장 인자들과 함께 획득되는 주요한 단백질들 내의 함유물과, TGF-β1, EGF 및 IGF와 같은 혈소판 유도성 성장 인자들(PDGF) 및 혈관 내피 성장 인자들(VEGF) 외의 방출물 내의 성장 인자들의 농도에 악영향을 미치게 되는 최소한의 위험이 존재하게 되는 추가적인 이점을 나타낸다.
바람직한 일 실시예에서, 본 발명의 방법으로 획득된 성장-인자들 함유 혈소판 방출물은, 실제의 필요들에 따라, 물 또는 생리식염수의 첨가에 의해 단일한 단계로 쉽게 재구성될 수 있는 작은 부피의 바이알(vial)들로 동결 건조될 수 있다. 이로 인해, 부피가 일 치료를 위해 충분한 다수의 성장 인자들을 함유하도록 부피가 바람직하게 선택된다. 바이알 당 성장 인자들의 인트라(intra) 및 인터(inter) 배치 농도는 최초 혈소판 수, 즉, 전술된 순차적인 단계들 (a) 내지 (d)에 종속되는 혈소판들의 양에 따른 각 바이알에 배분된 방출된 성장 인자들의 부피를 조정함으로써 표준화될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 단계 (e)에서 획득된 액체 여과물은 개별적인 부피들로 분할되고, 각 개별적인 부피는 그것이 cm³당 약 2 x 105에서 2 x 107개 사이의, 바람직하게는, cm³당 약 2 x 106개의 혈소판들로부터 유래하도록 조절된다. 원한다면, 혈소판 방출물은 의도된 사용에 따라, 특정한 세트의 성장 인자들에 대해 농축 될 수 있다. 각 바이알에 대한 성장 인자들의 수를 표준화함으로써, 스톡(stock)이 소기의 작은 앨리컷의 추출을 허용하도록 종속되어야 하는 반복된 해동 및 동결 사이클들에 의한 오염 및 활성 손실의 잠재적인 위험들을 갖는 더 큰 스톡 부피로부터 더 작은 앨리컷들을 제조해야 할 필요가 제거될 수 있다.
상기에 있어서, "혈소판 농축물"은 혈소판을 함유하는, 생물학적 또는 인공적인 여하한 유체를 참조한다. 이러한 유체들의 비-제한적인 예시들은, 인간 또는 동물일 수 있는 포유류 소스들로부터 유래된, 전혈, 혈장, 혈소판 풍부 혈장, 여하한 배지 내에 농축된 혈소판들 또는 이와 유사한 것들로 구성된다. 유체는 일반적으로 물 기반일 것이다. 이로 인해, 유체는 자가일 수 있고 또는, 예컨대, 혈액 은행들로부터 일상적으로 제조되는, 특정한 최소한의 혈소판 함량을 갖는 분반법 또는 버피 코트 유도성 혈소판 농축물들로부터와 같은, 몇몇의 상이한 주체들로부터 유래하는 타생의(allogenic) 유체들의 풀(pool)일 수 있다. 일반적으로 제조는 타생의 기성품(off-the-shelve product)들로 표준화될 것이다. 혈소판 농축물들은 일반적으로 전혈, PRP법 또는 분반법 혈소판들을 적용하는 버피 코트법을 사용하여 제조될 것이고, 이는 저장된 개별적으로 공여된 혈액 부분들로부터 유래한다. 후자의 사용은, 특히, 사전 저장 백혈구 결핍에 추가적으로 종속될 때 바람직하게 된다. 또한, 그것이 5일에서 7일의 저장 한계에 도달하여 수혈될 수 없는 혈소판 농축물들이 성장 배지(medium) 보충물로서 동결, 저장 및 사용될 수 있다.
혈소판 농축물은 혈장 또는 혈장 및 첨가제 용액의 혼합물 내에서 유지될 수 있다. 유통 기한(shelf life)을 증가시키기 위해, 혈소판 농축물은 동결 혈소판 농축물들의 큰 풀들로 구성될 수 있다.
용어 "농축물(concentrate)" 또는 "농축(concentrating)"은 혈소판이 존재하는 혈장, 전혈 또는 다른 유체의 벌크로부터의 혈소판들의 분리를 참조하며, 이는 또한 예컨대, 전혈 또는 혈장에 대한 원래의 생성물을 참조할 수 있다.
원심 분리, 분광법, 여과법, 경사 분리법, 중력 침강법 또는 혈소판-함유 유체들로부터 혈소판들을 농축시키는 다른 방법들이 농축물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 혈소판들을 농축시킬 때, 혈액, 혈장 또는 다른 액체의 다른 성분들로부터 혈소판들을 분리하는 동안 응고를 방지하기 위해 혈소판들의 소스와 함께 (특히, 원심 분리법 또는 중력 침강법을 위한) 항응고제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 용어 "항응고제(anticoagulant)"는 본 개시의 예시들에 따른 사용을 위해 혈소판들을 농축 또는 수집할 때 응고를 억제하는 조성물들을 참조한다. 항응고제들은 일반적으로 응고 인자 합성 저해제들, 트롬빈 저해제들 또는 항혈소판 약물들로서 가용하다. 간에서 특정한 응고 인자들의 생성을 억제하는 응고 인자 합성 억제제들은 와파린(쿠마딘(Coumadin))과 같은 조성물들을 포함한다. 트롬빈 억제제들은 트롬빈의 활성을 차단하여 혈액 응고를 방해하고, 헤파린 및 레피루딘(레플루단(Refludan))과 같은 조성물들을 포함한다. 항혈소판 약물들은 혈소판들 자체와 상호 작용하며, 아스피린, 티클로피딘(티클리드(Ticlid)), 클로피도그렐(플라빅스(Plavix)), 티로피반(아그라스타트(Aggrastat)), 엡티피바타이드(인테그릴린(Integrilin)) 등과 같은 약물들을 포함한다.
상기에서, 용어 "혈소판 방출물(platelet releasate)"은 혈소판 농축물이 전술된 것처럼, 특히, 전술된 단계 b에서, 활성화 단계에 노출되고 혈소판들에 의해 방출된 함유물이 회수될 때 획득된 조성물을 참조한다.
상기에서, "혈소판 농축물을 활성화 단계 또는 활성화 처리에 종속시키는 것"은, 혈소판들이 자신들의 과립 함유물, 특히, 혈소판에 함유된 알파 과립들을 방출하는 것을 달성하기 위해 이들의 세포막(cell membrane)을 파괴시킴으로써 혈소판을 파괴하는 것을 의미한다. 활성화된 혈소판들은 거기에 함유된 많은 다양한 화합물들, 단백질(a.o. protein)들, 예컨대, 혈장막 유도성 마이크로 파티클들과 같은 세포질 미소 소포체들, 엑소좀들, VEGF, bFGF, PDGF, TGF-β 및 다른 사이토가인들과 같은 성장 인자들을 방출할 수 있다. 이는 화학적으로, 기계적으로, 유체 균질화 또는 음파 처리에 의해 또는 용해(lyses)에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 활성화는 바람직하게는 혈소판 농축물을 활성화제와 접촉시킴으로써 수행되고, 이는 유체 혈소판 방출물로의 혈소판 함유물의 방출의 최대화를 가능하게 한다. 적합한 용해제는 트롬빈, 콜라겐, 트롬복산 A2 또는 ADP 및 칼슘염 용액들 또는 이들의 둘 이상의 혼합물을 포함한다. 적합한 칼슘염의 예시는 염화칼슘이다. 그러나, 당업자에 의해 적합한 것으로 고려되는 여하한 다른 용해제도 또한 사용될 수 있다.
기계적인 용해는 예컨대, 동결-해동 사이클을 사용하여, 혈소판 현탁액을 동결시키고 그 다음으로 예컨대, 30 °C 내지 45 °C의 실온을 넘는 온도에서 물질을 해동시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 방법은 세포가 얼음 결정들을 형성하고, 해동 시에 수축이 일어나 세포들이 부풀어 오르고 깨지게 한다. 주기적인 팽창 및 수축은 혈소판들이 분열되도록(break open) 한다. 동결 해동 사이클들의 수에 따라, 혈소판 세포 용해(cytolysis)의 정도를 변화시키는 것이, 예컨대, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 90% 또는 최대 100%의 세포 용해가 달성될 수 있다. 본 발명 내에서, 기계적인 용해가 고려될 수 있지만 바람직하게는, 방출물의 의심되는 품질 손실에 때문에 생략된다(dispensed with).
본 발명의 범위 내에서, "동결 건조된 혈소판 방출물들"은 "동결 건조된 혈소판 풍부 혈장 방출물들" 또는 "LPRRL"을 동결 건조된 혈소판 방출물들의 특정한 유형으로서 포함하며, 다만, 여기에 제한되지는 않는다.
본 발명의 범위 내에서, "항응고제"는 본 발명에 따른 사용을 위해 혈소판들을 농축 또는 수집할 때 응고를 억제하는 조성물을 참조한다. 항응고제들은 일반적으로 칼?? 이온들 착화/봉쇄제(complexing/chelating agent)들, 응고 인자 합성 저해제들, 트롬빈 저해제들 또는 항혈소판 약물들로서 가용하다. 간에서 특정한 응고 인자들의 생성을 억제하는 응고 인자 합성 억제제들은 와파린(쿠마딘(Coumadin))과 같은 조성물들을 포함한다. 트롬빈 억제제들은 헤파린 및 레피루딘(레플루단(Refludan))과 같은 조성물들을 포함한다. 항혈소판 약물들은 혈소판들 자체와 상호 작용하며, 아스피린, 티클로피딘(티클리드(Ticlid)), 클로피도그렐(플라빅스(Plavix)), 티로피반(아그라스타트(Aggrastat)), 엡티피바타이드(인테그릴린(Integrilin)) 등과 같은 약물들을 포함한다.
본 발명의 방법의 단계 a에서 수행된 UV 조사는 바람직하게는, 혈소판 방출물을 UVA 조사에 노출시키는 것과 관련되고, 바람직하게는, 1에서 10J/cm² 사이의, 더 바람직하게는 약 3J/cm²의 에너지 밀도의 UVA 조사에 노출하는 것과 관련된다. UV 조사들에 대한 노출은 바람직하게는 혈소판 방출물이 광화학제, 특히, 소랄렌(psoralen)이고, 특별하게는, 아모토살렌(amotosalen) 또는 리보플라빈을 사용하여 배양된 후에 수행된다.
혈소판 방출물이 외막형 바이러스들 또는 다른 병원체들의 막을 용해시키기 위해 용매 및/또는 계면활성제와 접촉되는 본 발명의 방법의 단계 d에서, 바람직하게는, 디알킬포스페이트(dialkylphosphate)들 또는 트리알킬포스페이트들의 군으로부터 선택되고, 바람직하게는, 트리-n-부틸포스페이트인 혈소판 농축물을 배양하기 위한 용매의 사용이 이루어진다. 본 발명의 방법의 단계 d에 있어서의 사용을 위한 적합한 계면활성제는 지방산들의 폴리옥시에틸렌 유도체들, 소르피톨 무수물들의 부분적인 에스테르들, 비-이온성 계면활성제들, 나트륨 디옥시콜레이트 및 술포베타인들 중 하나 이상을 포함하는 군으로부터 선택된 계면활성제들을 포함하고, 바람직하게는, 트리톤(Triton) X-45, 트리톤 X-100 또는 트윈(Tween) 80가 된다.
용매 및/또는 계면활성제를 제거하고 거기에 용해된 성분들을 제거하기 위한 후속하는 추출 단계에서 사용되는 오일의 양은 넓은 범위 내에서 변화될 수 있지만, 바람직하게는, 오일량은, 혈소판 농축물 및 용매 및/또는 계면활성제의 혼합물의 총 부피에 기반하여, 2-20중량%의 범위, 바람직하게는, 5-15중량% 범위, 더 바람직하게는, 5-10중량%의 범위일 수 있다. 이로 인해, 바람직하게는, 의약품 등급 오일, 예컨대, 피마자유의 사용이 이루어진다. 추출 공정에 있어서, 통상적으로, 일정 부피의 오일이 혈소판 방출물에 대해 첨가되고, 일정 시간, 통상적으로, 30, 20 또는 15분 이하 동안 혈액 믹서 상에서의 쉐이킹(shaking)에 종속된다. 그 후에, 추출이 수행되는 컨테이너는 일정 시간 동안, 예컨대, 10분 이상 또는 이하 동안, 상부의 상으로부터 중력에 의해 분리되는 상부의 오일 상 및 하부의 혈소판 방출물 상을 획득하기 위해, 반전된(inverted) 위치로 매달려질 수 있다. 이러한 단계는, 추출 효율성에 따라, 한 번 또는 두 번 이상 반복될 수 있다.
본 발명의 방법은 추출 단계 e 이후에 오일 및 수성 단백질 상으로부터 혈소판들을 분리하도록 원심 분리하는 적어도 하나의 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 혈소판 방출물은 저온, 통상적으로 10°C 미만, 바람직하게는 5°C 미만, 통상적으로는 약 4°C에서, 바람직하게는, 상부의 상에서의 여하한 오일의 잔여물들(remanants) 및 중력에 의해 획득되는 하부의 상에서의 혈소판 방출물을 분리하도록 반전된 위치에서, 원심분리에 종속될 수 있다.
본 발명의 방법은 여과 단계 e 이후에 혈소판 방출물의 유통 기한을 늘리기 위한 동결 건조 단계를 포함할 수 있다. 동결 건조에 종속시키기 전에, 단계 e에서 획득된 액체 또는 유체 여과물은 몇 개의 부피들로 분할될 수 있고, 해당 부피는 각 부피가 cm³당 소정의 혈소판량의 방출물을 함유하도록, 예컨대, 2 x 105 내지 2 x 107개의 혈소판들의 방출물을, 더 바람직하게는, cm³당 2 x 106개의 혈소판들의 방출물을 함유하도록 조정되지만, 혈소판들의 여하한 다른 농도가 당업자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명의 방법으로 획득된 생성물은 적합한 앨리컷들로의 추가적인 분할을 요구하지 않는 즉각적인 사용을 위해 적합한 합리적인 부피로 동결 건조되는 특성들을, 저장 및 재구성의 용이성과 결합하며, 피브리노겐은 결핍된다.
바람직한 일 실시예에서, 성장 인자들의 저온-보호(cryo-protection)를 달성하기 위해, 동결 건조 전에, 인간 알부민이 단계 e에서 획득된 액체 여과물로 공급된다.
본 발명의 범위 내에서, "동결 건조(lyophilization)"는 종종 혈소판들을 보존하기 위해 사용되는 동결-건조(freeze-drying) 또는 탈수 공정을 참조한다. 동결 건조는 그러나 또한 단지 보존 공정으로서만 사용될 수 있는 것이 아니며, 또한 혈소판들을 용해시키기 위한 처리로서 최초의 동결-해동 또는 다른 용해(lysis) 기법이 수행된 후에 사용될 수 있다. 다시 말해, 본 개시의 예시들에 따라, 방출물들이 여기에서 설명된 것처럼 형성된 후에, 동결 건조는 최초로 혈소판들의 내에 포함되거나 표면에 결합되어(bound) 있으나, 혈소판들이 여기에서 설명된 것처럼 용해, 예컨대, 동결-해동 용해될 때, 방출되는 성장 인자들, 사이토카인들, 케모카인들 및 다를 함유물들을 보존하는 추가된 이점을 제공한다. 공정은 통상적으로 물질을 동결시키고 물질 내에 동결된 물이 고체 상으로부터 직접적으로 기체 상으로 승화되도록 주위 압력(surrounding pressure)을 저감함으로써 수행된다.
원한다면, 혈소판 농축물은 그 함유물이 방출되도록 하기 위해 혈소판들을 활성화 단계에 종속시키기 전에 백혈구 제거 단계에 종속될 수 있다. 백혈구 제거는 주로 적혈구 세포들 및 혈소판들의 유닛들 내의 수혈된 백혈구 세포들과 연관된 원치 않는 합병증들의 발생에 대한 위험을 저감하는 것을 목표로 한다.
본 발명의 방법은 인간 또는 동물 혈소판들, 예컨대, 말 혈소판들 일 수 있는 포유류 혈소판 농축물로부터의 성장 인자들이 풍부한 피브리노겐 결핍 혈액 혈소판 방출물의 제조를 위해 의도된다. 상기 방출물은 동결 건조되거나 또는 동결 건조되지 않을 수 있다.
본 발명의 방법으로 획득된 혈소판 방출물들은 상처들, 궤양들 또는 화상들을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 혈소판 방출물들은 적용(application) 전에 건조된 형태 또는 탈수된 형태로 또는 겔로 적용될 수 있다. 대안적으로, 피부가 상처, 궤양 또는 화상에 의해 손상되지 않은 경우에도, 이는 노화, 광손상, 병리학적 또는 퇴행성의 질병, 또는 이와 유사한 것의 결과로서 발생하는 다른 유형들의 손상을 복원하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법으로 획득된 혈소판 농축물들 내에서 혈소판들의 농도는 넓은 범위 내에서 변화할 수 있으나, 바람직하게는, 농도는 최대의 효과를 달성할 수 있도록 가능한 한 높게 된다.
상기에서, 용어 "상처(wound)"는 더 깊은 조직에 대한 손상뿐만 아니라 피부에 대한 손상을 포함하는, 주체의 여하한 조직에 대한 여하한 손상을 참조한다. 이로 인해, 상처는 사고로 또는 의도적으로 야기될 수 있고, 또는 병리학적으로, 질병으로, 또는 퇴행적인 조건의 일반적인 진행에 의해 야기된 것일 수 있다. 예컨대, 손상은 부상 또는 수술의 결과일 수 있다. 부상들의 비-제한적인 예시들은 궤양들, 화상들, 골절들, 천공들, 베임들(cuts) 및 긁힘들(scrapes), 찢어짐들(lacerations), 수술적 절개들, 염증, 감염 및 이와 유사한 것들을 포함한다.
혈소판 방출물은 당업자에게 알려진 투여 방법을 사용하여 투여될 수 있고, 이는 유체들, 에어로졸들, 스프레이들, 미스트들, 로션들, 크림들, 연고들, 겔들, 검(gum)들, 분무된 액적(nebulized droplet)들 또는 파우더들, 병들로의 배분, 사전-침지된 패브릭, 주사기들, 붕대들, 피부 패치들 또는 플라스터들 등을 포함한다. 바람직한 일 실시예에서, 본 발명의 방법으로 획득된 혈소판 방출물은 상처들을 치료하기 위한 긴급 상황들에서의 사용을 위한 키트 내에서 안정적인 형태로 저장될 수 있다. 혈소판 방출물은 필요할 때 즉각적인 사용을 위해 재구성될 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명은 에어로졸, 치료 유체, 스프레이, 미스트, 로션, 크림, 연고, 겔, 검, 붕대, 피부 패치, 본 발명의 방법으로 획득된 성장 인자들 함유 혈소판 방출물을 함유하는 플라스터와 관련된다.
본 발명의 방법으로 획득된 혈소판 방출물은 증가된 양의 성장 인자들, 사이토카인들, 케모카인들 등을 함유할 수 있다. 방출물 내에 존재할 수 있는 성장 인자들 및 다른 물질들의 예시들은, 제한되지 않으며, PDGF, PDAF, VEGF, PDEGF, PF-4, TGF-B, FGF-A, FGF-B, TGF-A, IGF-1 , IGF-2, BTG, TSP, vWF, PAI-1 , IgG, IgM, IgA, KGF, EGF, FGF, TNF, IL-1 , KGF-2, 피브로펩타이드 A, 피브리노겐, 알부민, 오스테오넥틴, 그로-알파, 비트로넥틴, 피브린 D-다이머, 팩터 V(favtor V), 안티트롬빈 III, a2 매크로글로불린, 안지오제닌, Fg-D 및 엘라스테이스(elastase)를 포함한다. 더 상세하게는, 존재할 수 있는 성장 인자들, 사이토카인들, 또는 이와 유사한 것들은, 제한되지 않고, LIF, IGFBP3과 같은 항암성 성장 인자들, PG들(PGs)와 같은 에이코사노이드들, 또는 류코트리엔들(orleukotrienes), IL-1 TNF 알파, INF들(INFs), TNF-a, IL-6, IL-1 (a/b), 포스타노이드 대사물질들, 보충 성분(complement component)들, 활성 산소 중간체들, 아라키돈산 대사물질들, 응고 인자(coagulation factor)들, 질산염들, 및 케모카인들을 포함한다. 인간 유도성 성장 인자들, 케모카인들, 사이토카인들 및 호르몬들은 알파 디펜신, 알파 시누클레인, 페타 시누클레인, 4-1 BBL, 6Ckine, 액시딕(acidic) FGF, 액티빈(activin) A, 액티빈 R1b, 앙기오포이에틴 2, B-DNF, BAFF, BCA-1 , BCA-1 , BD-1 , BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPRA1 , BDNF, CNTF, CTGF, CTI_A-4Fc, CXCL1 , CXCL2, 카디오트로핀 -1 , 크립토(Cripto), 시스타틴 (Cystatin) C, Dkk-1 , EGF AOF, EGF, EMAP II, ENA-78, EPO, 에오탁신(Eotaxin), FGF 베이직 AOF, FGF-10, FGF-16, FGF 17, FGF 18, FGF19, FGF4, FGF6, FGF7, FGF8, FGF8b, FGF9, Flt3, G-CSF, GDNF, GMCSF, HGF, HGH, IFN 알파 A, IFN 알파 A/D, IFN 알파 D, IFN 알파 a2b, IFN, 베타 1A, IFN-감마, IGF1 , IGFil, IGFBP-4, IGFBP6, ILI 알파, IL-1 베타, IL10, IL11 , IL12, IL13, IL15, IL17, IL17A. IL17F, IL18, IL19, IL2, IL20, IL21 , IL23, IL28A, IL28B, IL29, IL3, IL31 , IL33, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, ITAC, KGF2, 칼리크레인(Kallikrein)1 1 , 칼리크레인4, 칼리크레인7, LEFTY-A, LIF, 렙틴(Leptin), MCSF AOF, MCSF, MCP-1, MCP2, MCP3, MCP4, MDC, MIG, MIP1 알파, MIP1 베타, MIP3 알파, MIP3 베타, MIP4, MIP5, 미드카인, NAP2, NT3, NT4, 뉴로탁틴(Neurotactin), 뉴로튜린, 온코스타틴(Oncostatin), 오스테오프로테그레린(osteoprotegrerin), PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PTN, 랭크 리간드(Rank ligand), 랭크 리셉터(Rank receptor), RANTES< SCF, SCFAOF, SDF-1 알파, SDF-1 베타, CD4, CD40L, TNF-RI, TNFRII, TARC, TECK, TGF 알파, TGF1 베타1(Betal), TGF 베타2, TGF 베타3, TNF 베타/임포톡신, TNF-알파, TPO, TRAIL, TWEAK, 및 VEGF를 포함한다.
본 발명의 방법으로 획득된 혈소판 방출물은 비록 다른 인디케이션(indication)들에도 또한 사용될 수 있지만, 상당한 가치가 있는 것으로 밝혀진 2 가지의 주요 인디케이션들을 갖는다. 첫 번째 인디케이션은 재생 의료에 있어서의 다계통 세포의 증식을 향상시키고 미치료성 상처(non healing wound)들 및 저항성 궤양(resistant ulcer)들의 관리에 있어서의 치료제로서의 사용이다. 이러한 어플리케이션들에 있어서, 사용된 성장 인자들을 함유하는 혈소판 방출물은 사람 또는 말 혈소판들로부터 제조되었다. 본 발명의 방법으로 획득된 혈소판 방출물은 또한 세포 배양 배지 내에서, 특히, 줄기 세포들, 섬유 아세포들 또는 수지상 세포들에 대해 또한 사용될 수 있다. 두 번째 인디케이션은 세포 배양 배지에 있어서 소 태아 혈청에 대한 대체제이다. 피브리노겐 결핍 혈소판 방출물들은 겔 형성의 원치 않는 효과를 회피하고, 방출물을 병원체/바이러스 저감의 두 단계들에 종속시키는 것은 제품 안정성을 보장한다. 결과적으로, 자가 혈소판 농축물들은 더 이상 필수가 아니며, 본 발명의 방법에 있어서 사용되는 표유류 혈소판 농축물은 상이한 표유류 주체들로부터 유래하는 혈소판들의 풀을 포함할 수 있다.
본 발명은 아래의 예시에서 더 설명된다.
예시 1
최초 혈소판 수의 3-5 배의 혈소판 수를 갖는, 혈소판 풍부 농축물을 얻기 위해 인간이 페레시스 머신( Haemonetics MCS +9000a)에 연결되었다. 혈소판 풍부 농축물은, 리보플라빈으로 배양되었고 병원균 저감의 첫 번째 단계로서 MIRASOLTM 시스템에 의한 UV 선들로 조사되었다. 그 후에, 살균 트롬빈b가 상기 농축물 내의 혈소판들을 활성화시키도록 적합한 500 units/cmm의 농도에서 첨가되었다. 이는 성장 인자들 및 사이토카인들의 과생리학적 투여량(supra physiological dose)의 혈소판 과립들로부터의 후속적인 방출을 발생시켰다. 추가적으로, 활성화된 혈소판들은 트롬빈에 의해 활성화되고 불용성 응고를 형성하는 피브리노겐의 알파 과립들 함유물을 방출시켰다. 원심 분리될 때, 트롬빈 처리된 혈소판 농축물은 용해된 혈소판들로 필수적으로 구성되는 맑고 밝은 적색 액체 또는 유체를 포함하는 상청액(supernatant), 혈소판 과립들로부터 방출된 성장 인자들의 과생리학적 투여량의 함유물들, 및 불용성 피브린 응고의 침전물(deposit)로 분리된다. 상청액을 추가적인 제조 단계들을 위해 새로운 컨테이너로 옮겼다. 혈소판 방출물은 용매 및 계면활성제 계(0.3 % TNBPc 및 1 % 트윈(tween) 20d)으로 31 ℃에서 1 시간 동안 처리되었다. 이 단계는 외막형 바이러스들(주로, HBC, HCV 및 HIV)를 파괴할 수 있다. 용매와 계면활성제는 이후에 식물성 오일 추출의 3개의 순차적인 단계들에 의해 제거된다. 살균된 피마자유(총 부피의 7.5 %)가 혈소판 방출물에 첨가되고 혼합물은 15 분 동안 혈액 혼합기에서 쉐이킹에 종속되고 그 다음으로 용기를 반전된 위치에서 10 분 동안 매달아 두어(suspended), 상부의 상으로부터 중력에 의해 분리되는, 상부의 오일 상 및 하부의 혈소판 용해물 상을 획득한다. 이러한 단계를 두 번 반복하고, 그 다음으로, 반전된 위치에서, 혈소판 방출물을 4oC에서 1500g로 20 분 동안 원심 분리하여, 상부의 상 내의 오일의 여하한 잔여물들(remanants)과 중력에 의해 획득되는 하부의 상 내에서의 혈소판 방출물을 분리한다.
그 다음으로, 혈소판 방출물은 여하한 박테리아 오염물들의 제거를 보장하기 위해 살균 필터링의 단계에 종속되고, 그 다음으로, 액체 또는 유체 여과물이 소정의 부피들로 분배되고, (cm3당 약 1백만 혈소판들의 동등성을 보장하는 농도의 최초의 혈소판 수에 따라 조정되어) 글라스 바이알들로 분배되고, 주로 혈소판 유도성 성장 인자들로 구성되는 이러한 여과물을 동결 건조한다.
예시 2
예시 1에서 획득된 혈소판 방출물이 안면 회춘을 달성하기 위해 사용되었다. 2 x 106 개의 혈소판들로부터 유래된 하나의 바이알이 턱, 뺨 및 코입술 주름을 갖는 여성의 얼굴의 각 측에서 주입되었다. 발적(redness), 통증 및 붓기(swelling)은 크게 감소될 수 있었다. 재생 효과는 적어도 6 개월 동안 지속한다.
비교 실험
2 x 106 개의 자가 혈소판들을 함유한 부피가, 예시 2와 동일한 문제를 겪고 있는, 여성의 얼굴의 각 측에서 주입되었다. 다 홍채, 통증 및 붓기는 제한된 범위로만 감소 될 수 있었다. 발적, 통증 및 붓기는 제한된 정도로만 감소될 수 있었다.
예시 3
허리 통증 관리에 있어서의 통증 완화를 달성하기 위해 예시 1에서 획득된 혈소판 방출물이 사용되었다. 2 x 106 개의 혈소판들로부터 유래된 2개의 바이알들이 등의 아래 부분에서 주입되었다. 통증은 상당히 감소될 수 있었다. 치료는 1 주일 후에 하나의 바이알이 주입하는 것에 의해 반복되었다. 재생 효과는 몇 개월 동안 지속되었다.
예시 4
예시 1에서 획득된 혈소판 방출물이 콜라겐 나트륨 알지네이트 하이드로겔 상처 드레싱에 통합되었고, 6 개월이 넘는 동안 치료될 수 없었던 당뇨성 궤양들에 대해 적용하였다. 수일 내에 상당한 상처 치유가 달성될 수 있었다.
예시 5.
이번에는 말 혈액을 사용하여, 혈소판 방출물이 예시 1의 방법에 따라 제조되었다. 2 x 106 개의 혈소판들로부터 각각 유래된 2 개의 바이알들이 말의 부상 입은 근육으로 주입되었다. 치료는 일주일 후에 반복되었다. 근육은 부상을 남기지 않고 치유되었다.
Claims (27)
- 최초 혈소판 수를 갖는 유체 표유류 혈소판 농축물(fluid mammalian platelet concentrate)으로부터 성장-인자들 함유 혈소판 방출물(platelet releasate)을 제조하는 방법에 있어서,
a. 상기 혈소판 농축물을 상기 혈소판 농축물에 존재하는 미생물들의 DNA 및 RNA 둘 다를 파괴하는 목적으로 제1 병원체 농도 저감 단계에 종속시키는 단계;
b. 상기 혈소판 농축물을 활성화제(activating agent)에 접촉시킴으로써, 혈소판들이 거기에 존재하는 적어도 일부의 알파 과립(alpha granule)들 및 성장 인자들을 방출하도록 하고, 이로 인해 유체 혈소판 방출물을 제공하는 목적으로, 상기 혈소판 농축물을 활성화 단계에 종속시키는 단계;
c. 상기 유체 혈소판 방출물을 피브리노겐 농도 저감 단계에 종속시키고, 피브리노겐 결핍 유체 혈소판 방출물을 회수하는(recovering) 단계;
d. 상기 피브리노겐 결핍 유체 혈소판 방출물을 외막형(enveloped) 바이러스들을 파괴하는 목적으로 제2 병원체 농도 저감 단계에 종속시키는 단계;
e. 상기 혈소판 방출물을 살균 필터링(sterile filtering)에 종속시키고, 필터링 단계로부터 상기 성장 인자들을 함유하는 여과액(filtrate liquid)을 회수하는 단계;
f. 상기 혈소판 방출물의 상기 최초 혈소판 수에 기반하여, 상기 여과액을 cm³당 약 2 x 105 - 2 x 107개의 혈소판들의 방출물을 함유하는 개별적인 부분들로 분할하는 단계 - 상기 개별적인 부분들의 부피는 각 부분이 동일한 수의 혈소판들을 함유하도록 조정됨 -; 및
g. 따라서 획득된 상기 여과액의 개별적인 부분들을 동결 건조시키는 단계
의 순차적인 단계들을 포함하고,
이로 인해 획득되는 성장 인자들을 함유하는 혈소판 방출물은 적합한 앨리컷들로의 추가적인 분할을 요구하지 않는 즉각적인 사용을 위해 적합한 부피로 동결 건조되는 특성들을, 저장 및 재구성의 용이성과 결합하며, 피브리노겐이 결핍된 것인, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 활성화제는 칼슘염, 트롬빈, 콜라겐, 트롬복산 A2 및 아데노신이인산(ADP)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물들을 함유하는 용액인, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 병원체 농도 저감 단계는 상기 혈소판 농축물을 광화학성 활성화제로 배양하는(incubating) 단계 및 상기 혈소판 농축물을 UV 조사에 노출시키는 단계를 포함하는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제3항에 있어서,
상기 UV 조사는 UVA 조사인, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제3항에 있어서,
상기 광화학성 활성화제는 소랄렌(psoralen)인, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제2 병원체 농도 저감 단계는 상기 혈소판 방출물을 용매, 계면활성제(detergent) 또는 이들의 조합으로 배양하고, 그 다음으로 상기 용매, 상기 계면활성제 또는 상기 이들의 조합을 제거하는 단계 및 상기 용매, 상기 계면활성제 또는 상기 이들의 조합이 결핍된 상기 혈소판 농축물을 회수하는 단계를 포함하는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제6항에 있어서,
상기 혈소판 방출물을 배양하기 위한 상기 용매는 디알킬포스페이트(dialkylphosphate)들 또는 트리알킬포스페이트들의 군으로부터 선택되는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제6항에 있어서,
상기 계면활성제는 지방산들의 폴리옥시에틸렌 유도체들, 소르피톨 무수물들의 부분적인 에스테르들, 비-이온성 계면활성제들, 나트륨 디옥시콜레이트 및 술포베타인들로 구성된 군으로부터 하나 이상이 선택되는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제6항에 있어서,
상기 용매, 상기 계면활성제 또는 상기 이들의 조합은 오일 추출법에 의해 상기 혈소판 방출물로부터 제거되는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 오일 추출법은, 상기 혈소판 농축물 및 상기 용매, 상기 계면활성제 또는 상기 이들의 조합의 혼합물의 총 중량에 기반하여, 2-20중량%의 범위의 오일량의 존재 하에서 수행되는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제2 병원체 농도 저감 단계에서의 상기 용매, 상기 계면활성제 또는 상기 이들의 조합의 제거 후, 상기 혈소판 방출물의 원심 분리(centrifugation)의 적어도 하나의 단계를 더 포함하는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 여과액을 동결 건조에 종속시키기 전에, 인간 알부민이 단계 e에서 획득된 상기 여과액으로 공급되는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 활성화 단계 b에 대해 상기 혈소판 농축물을 종속시키기 전에, 상기 혈소판 농축물은 백혈구 비활성화 단계에 종속되는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표유류 혈소판 농축물은 인간 혈소판들 또는 말 혈소판들로부터의 성장 인자들이 풍부한, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표유류 혈소판 농축물은 상이한 주체(subject)들로부터 비롯하는 혈소판 농축물들의 풀(pool)을 포함하는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제2항에 있어서,
상기 활성화제는 트롬빈 함유 용액인, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 UVA 조사는 1에서 10 J/cm² 사이의 에너지 밀도를 갖는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제17항에 있어서,
상기 UVA 조사는 3 J/cm²의 에너지 밀도를 갖는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 광화학성 활성화제는 아모토살렌(amotosalen) 또는 리보플라빈인, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 혈소판 방출물을 배양하기 위한 상기 용매는 트리-n-부틸포스페이트인, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 계면활성제는 트리톤(Triton) X-45, 트리톤 X-100 또는 트윈(Tween) 80인, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 오일 추출법은, 상기 혈소판 농축물 및 상기 용매, 상기 계면활성제 또는 상기 이들의 조합의 혼합물의 총 중량에 기반하여, 5-15중량% 범위의 오일량의 존재 하에서 수행되는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제22항에 있어서,
상기 오일 추출법은, 상기 혈소판 농축물 및 상기 용매, 상기 계면활성제 또는 상기 이들의 조합의 혼합물의 총 중량에 기반하여, 5-10중량% 범위의 오일량의 존재 하에서 수행되는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 액체 여과물은 cm³당 2 x 106개의 혈소판들의 방출물을 함유하는 개별적인 부분들로 분할되는, 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 제조하는 방법. - 적어도 다계통 세포(multi lineage cell)들의 증식 향상, 상처 치료 촉진 또는 궤양 치료를 위한 제1항의 방법으로 획득된 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 포함하는 약학적 조성물에 있어서,
상기 성장-인자들 함유 혈소판 방출물의 유효량으로 필요로 하는 대상을 치료하는 것을 포함하는, 약학적 조성물. - 적어도 줄기 세포들, 섬유 아세포(fibroblast)들 또는 수지상 세포(dendritic cell)들의 성장을 위한 세포 배양 배지(cell culture media)에 있어서,
제1항의 방법으로 획득된 성장-인자들 함유 혈소판 방출물을 포함하는, 세포 배양 배지. - 에어로졸, 치료용 유체(treatment fluid), 스프레이, 미스트, 로션, 크림, 연고, 겔, 검(gum), 붕대(bandage), 피부 패치 및 플라스터(plaster)로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택된, 제1항에 따른 방법으로 획득된 성장 인자들 함유 혈소판 방출물을 함유하는 제제.
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