CN104488850B - 一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞领域，公开了一种制备干细胞外泌体冻干粉的方法，尤其是一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法。本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，以海藻糖作冷冻保护剂与人羊膜间充质干细胞外泌体混合，滤膜过滤除菌，先经超低温预冻后再在一定真空度下低温冷冻。本发明所述制备方法操作简单、安全有效。实验表明，与常规冻干粉制备方法相比，本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法能很好保持人羊膜间充质干细胞外泌体的形态和活性，适用于冻存人羊膜间充质干细胞外泌体的长期保存及应用。

Description

一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种制备干细胞外泌体冻干粉的方法，尤其是一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法。

背景技术

外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的大小均一，直径为40～100nm，密度1.10～1.18g/ml的囊泡样小体。外泌体的应用主要集中在临床诊断及抗肿瘤方面。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我更新和多向分化能力的细胞，产生并释放营养性物质，通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生医学领域有重要作用。Lai等通过质谱技术分析发现:MSCs的外泌体中含有丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)人乳脂肪球EGF因子蛋白(milkfat globule-EGFfactor8protein，MFGE8)及跨膜四蛋白等857种蛋白质，它们参与细胞结构的维持运动信息交流以及组织的修复与再生。许多的研究表明MSCs外泌体在治疗组织损伤性疾病中具有重要的作用。人胎盘羊膜组织中含有丰富的间充质干细胞，所获得的人羊膜间充质干细胞(humanamnioticmesenchymal stem cells,hAMSCs)可以在体外条件下稳定培养，细胞活性强，分泌旺盛，其细胞培养上清液中含有大量的外泌体。同时，所分泌的外泌体来源单一稳定。

目前，常用的提取外泌体的方法有：离心法，免疫磁珠法，过滤离心法，密地梯度离心法等。但想保持外泌体的活性，提取过程不添加其他来源物质以及操作简便方面考虑，离心法仍然是最常用的方式。所提纯的外泌体目前主要的储存方式为把悬液冰冻保存(-20℃到-80℃)

现有的技术中，外泌体的来源不稳定，多来源于血液等体液或各种来源的细胞，不能使产品质量稳定可控。另外，由于外泌体需要冷冻保存，这使其在储存，运输及应用方面带来了许多不便。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种操作简单、安全有效，同时又能很好保持外泌体活性的制备外泌体冻干粉方法，用于冻存人羊膜间充质干细胞外泌体。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，取人羊膜间充质干细胞外泌体，加入海藻糖混匀后，滤膜过滤，分装后超低温冷冻12h，然后在10Pa的真空度、-50℃的条件下冷冻12h～48h。

在一些实施方案中，所述海藻糖的加入量为至海藻糖终浓度为10wt％。

在一些实施方案中，所述滤膜孔径为0.22μm。

在一些实施方案中，所述超低温为-80℃。

在一些实施方案中，所述人羊膜间充质干细胞外泌体的提取方法为在4℃下，人羊膜间充质干细胞培养上清在300g～10000g的离心力下离心去除培养上清中的细胞及细胞碎片，收集上清，在100000g的离心力下离心去除培养基中蛋白质收集沉淀获得人羊膜间充质干细胞的外泌体。

进一步，在一些优选实施方案中，所述人羊膜间充质干细胞外泌体的提取方法具体包括以下步骤：

(1)、培养上清300g离心10min，收集上清液，弃沉淀；

(2)、上清液2000g～3000g离心20min～30min，收集上清液，弃沉淀；

(3)、上清液10000g离心60min～100min，收集上清液，弃沉淀；

(4)、上清液100000g离心60min～120min，弃上清，收集沉淀；

(5)、沉淀加入PBS重悬后，100000g离心60min～120min弃上清，收集沉淀。

在一个具体实施例中，本发明采用原子力显微镜对本发明所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体进行形态学观察，结果显示采用本发明所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体的形态大小相似，没有显著性差异。

在一个具体实施例中，本发明采用CCK-8法检测本发明所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体增殖能力，结果显示，本发明所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体对细胞的增殖均有促进作用，且效果没有显著性差异。

进一步的，在一个具体实施例中，本发明采用免疫印迹法分析本发明所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体CD63及CD9的表达，结果显示本发明所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体仍然为外泌体，有CD63及CD9的表达。

由此可见，采用本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉能够很好保持外泌体的形态及活性。

本发明还提供了所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉。

在一个具体实施例中，本发明比较本发明所述制备方法与常规的冻干方法对制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的影响，形态鉴定结果显示添加10wt％海藻糖制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体，大小均匀，外泌体的尺寸也没有明显的改变。而添加10wt％葡萄糖及不添加其他物质制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体体积变大，大小不均匀。活性检测结果显示添加10wt％海藻糖制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体活性明显优于添加10wt％葡萄糖及不添加其他物质制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体活性。表明本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法明显优于现有的冻干方法。

本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，以海藻糖作冷冻保护剂与人羊膜间充质干细胞外泌体混合，滤膜过滤除菌，先经超低温预冻后再在一定真空度下低温冷冻。本发明所述制备方法操作简单、安全有效。实验表明，与常规冻干粉制备方法相比，本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法能很好保持人羊膜间充质干细胞外泌体的形态和活性，适用于冻存人羊膜间充质干细胞外泌体的长期保存及应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1用于收集培养上清的细胞状态图，其中a放大倍数为40倍，b放大倍数为100倍；

图2示实施例3用原子力显微镜对人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体和一直超低温保存后融化的外泌体的形态的检测图，其中a为第一组即人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的形态图，b为第二组即一直超低温保存后融化的外泌体的形态图；

图3示实施例4外泌体的活性检测结果图，其中为第一组即人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的结果图，为第二组即一直超低温保存后融化的外泌体的结果图，为对照组即不添加外泌体的培养基培养的结果图；

图4示实施例5外泌体CD63及CD9的表达结果图；

图5示实施例6不同冻干方式制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的形态的检测图，其中a为第一组即添加10wt％海藻糖制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的形态图；b为第二组即添加10wt％葡萄糖制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的形态图；不添加其他物质制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的形态图；

图6示实施例6不同冻干方式制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的活性检测结果图，其中为第一组即添加10wt％海藻糖制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的结果图，为第二组即添加10wt％葡萄糖制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的结果图，第三组即不添加其他物质制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的结果图，为对照组即不添加外泌体的培养基培养的结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、人羊膜间充质干细胞的培养及培养上清的收集

1、人羊膜间充质干细胞的培养：

取生长良好的人羊膜间充质干细胞，用无血清培养基培养，0.25％胰酶消化传代，传至P2代，待其生长至融合度80％，去除培养液，用PBS洗三遍，加入1640基础培养基，每天收集培养上清，并更换新鲜的1640培养基，连续收集培养3到5天后收集培养上清用于外泌体的提取。其中，用于收集培养上清的细胞状态如图1所示。

2、外泌体的提取(提取全过程除特别说明外，均在4℃下进行)：

(1)、将收集的所有培养上清300g离心10min，保留上清液，弃沉淀，去除培养液中的细胞；

(2)、上清液2000g～3000g离心20min～30min，保留上清液，弃沉淀，去除细胞碎片；

(3)、上清液10000g离心60min～100min，保留上清液，弃沉淀，再次去除细胞碎片；

(4)、上清液100000g离心60min～120min，弃上清，保留沉淀；

(5)、沉淀加入PBS重悬后，100000g离心60min～120min弃上清，保留沉淀，去除培养基中蛋白质，所获即为纯化后的人羊膜间充质干细胞的外泌体，用PBS缓冲液重悬，用BCA试剂盒测蛋白浓度。然后分成两组，第一组-80℃一直保存，第二组用于制备冻干粉。

实施例2、人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的制备：

取实施例1纯化后的外泌体，加入海藻糖至终浓度为10％，混匀后，过0.22μm滤膜，分装后置于超低温冰箱(-80℃)12h，然后将样品转移至真空冻干仓冻干，冻干的真空度保持在10Pa，温度在-50℃冷冻12到48h得到人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉。

实施例3、外泌体的形态检测：

第一组超低温冰箱(-80℃)保存；第二组(实施例2制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉)室温保存。一月后，第一组融化作检测，第二组用PBS缓冲溶液复溶作检测。

采用原子力显微镜对外泌体进行形态学观察。待检测的外泌体经纯水按一定比例稀释后，取10μL稀释液滴加到新解离的云母表面。静置约30min后，用纯水小心冲洗并用氮气吹干。原子力显微镜成像采用振幅调制轻敲模式(共振频率为56kHz，弹性系数为0.24N/m)。结果见图2。

由图2结果可见，实施例2制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体的形态大小相似，没有显著性差异。

实施例4、外泌体的活性检测：

用BCA试剂盒分别检测其浓度，分别将两组的外泌体配置成15μg/ml浓度，加入培养基中，用CCK-8法检测其增殖能力：消化第8代的人羊膜间充质干细胞(此代细胞的增殖能力减弱，活性降低)，以每孔2000个细胞接种于96孔板中，取第1d、3d、5d、7d的细胞作检测，添加10μl染色剂，培养2h。用酶标仪在450nm处检测OD值，以不添加外泌体的培养基培养作对照，每组6个重复，取平均值。结果如表1和图3所示。

表1活性检测结果

	1d	3d	5d	7d
					第一组	0.22	0.373	0.72	0.82
第二组	0.218	0.381	0.698	0.83
					对照组	0.218	0.315	0.451	0.51

从表1和图3结果可以看出，实施例2制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体对细胞的增殖均有促进作用，且效果没有显著性差异。

实施例5、外泌体CD63及CD9的表达

取实施例2制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体用免疫印迹法分析CD63及CD9表达。

以间充质干细胞作为对照，调整细胞浓度为1×10⁶/ml，-20℃快速冻融4次后，400g离心30min，取上清液，即为细胞裂解物，经BCA试剂盒测定浓度。外泌体经超声波冲击破膜后，经BCA试剂盒测定浓度。取外泌体40μg及间充质干细胞裂解物40μg(间充质干细胞裂解物作对照)，分别加入适量电泳上样缓冲液，沸水中加热10min，在12％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后用半干转移仪转膜1.5h至醋酸纤维膜上；醋酸纤维膜用5％的脱脂奶粉包被2h后，加入抗CD63抗体或抗CD9类分子抗体，4℃过夜，PBS洗涤3次，10min/次；然后加入HRP标记的二抗(1：5000)，37℃孵育30min，PBST洗涤3次，15min/次；最后加入ECL发光剂，暗室中曝光、显影与定影，结果图4所示。

由图4结果可见，实施例2制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体仍然为外泌体，有CD63及CD9的表达。

实施例6、外泌体的不同冻干方式：

目前未有外泌体冻干粉的制备的文献及专利报道，根据参考传统蛋白质的冻干方式，作冻干效果对比。

取实施例1纯化后的人羊膜间充质干细胞外泌体，分为三组，第一组：加入海藻糖至终浓度为10wt％；第二组：加入葡萄糖至终浓度为10wt％；第三组：不添加其他物质。三组各自混匀后，过0.22μm滤膜，分装后置于超低温冰箱(-80℃)12h，然后将样品转移至真空冻干仓冻干，冻干的真空度保持在10Pa，温度在-50℃冷冻12～48h得到人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉。

取所获得的冻干粉按实施例3与4的方法进行形态鉴定及活性检测。形态鉴定结果见图5，活性鉴定结果如表2和图6。

表2不同冻干方式对外泌体活力的影响

	1d	3d	5d	7d
					第一组	0.22	0.373	0.72	0.82
第二组	0.218	0.35	0.61	0.721
					第三组	0.22	0.322	0.602	0.66
对照组	0.218	0.315	0.451	0.51

由图5结果可见，添加10wt％海藻糖制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体，大小均匀，外泌体的尺寸也没有明显的改变。而添加10wt％葡萄糖及不添加其他物质制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体体积变大，大小不均匀。

由表2及图6结果可见，添加10wt％海藻糖制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体活性明显优于添加10wt％葡萄糖及不添加其他物质制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体活性。

Claims (7)

1.一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，取人羊膜间充质干细胞外泌体，加入海藻糖混匀后，滤膜过滤，分装后超低温冷冻12h，然后在10Pa的真空度、-50℃的条件下冷冻12h～48h。

2.根据权利要求1所述的方法，所述海藻糖的加入量为至海藻糖终浓度为10wt％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述滤膜孔径为0.22μm。

4.根据权利要求1或2所述的方法，所述超低温为-80℃。

5.根据权利要求1或2所述的方法，所述人羊膜间充质干细胞外泌体的提取方法为在4℃下，人羊膜间充质干细胞培养上清在300g～10000g的离心力下离心去除培养上清中的细胞及细胞碎片，收集上清，在100000g的离心力下离心去除培养基中蛋白质收集沉淀获得人羊膜间充质干细胞的外泌体。

6.根据权利要求5所述的方法，所述人羊膜间充质干细胞外泌体的提取方法具体包括以下步骤：

(1)、培养上清300g离心10min，收集上清液，弃沉淀；

(2)、上清液2000g～3000g离心20min～30min，收集上清液，弃沉淀；

(3)、上清液10000g离心60min～100min，收集上清液，弃沉淀；

(4)、上清液100000g离心60min～120min，弃上清，收集沉淀；

(5)、沉淀加入PBS重悬后，100000g离心60min～120min弃上清，收集沉淀。

7.权利要求1-6任意一项所述方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉。