CN107744526A - 羊干素及其制备方法和应用 - Google Patents

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胡梓轩
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Abstract

本发明公开了一种羊干素及其制备方法和应用，并公开了其制剂冻干粉的制备方法，该羊干素是通过从人胎盘羊膜组织中分离培养羊膜间充质干细胞，用人血小板裂解液培养扩增，再通过收集人羊膜间充质干细胞的培养上清，浓缩后收集制得，解决了AMSCs细胞倍增时间长和多分化潜能差的问题，可以对羊干素活性成分定性、定量分析，可以提高羊干素中的活性成分如抗氧化剂和多种生长因子等，且使其活性成分避免降解。动物实验和临床试验结果表明，本技术制备的羊干素可用于延缓衰老、防治骨质疏松和皮肤衰老、促进皮肤创伤愈合。

Description

羊干素及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，更具体地，涉及一种羊干素制剂的制备方法及其在抗衰老药物中的应用。
背景技术
新近研究发现：80％以上的人羊膜间充质干细胞(Amniotic MembraneMesenchymal Stem cell,AMSCs)移植治疗作用是通过其旁分泌作用实现的。干细胞释放的所有分子被称为干细胞释放分子组，能够通过旁分泌途径发挥免疫调节，促进血管发生，抗氧化和抗凋亡，促进组织再生修复等作用。人羊膜间充质干细胞释放分子(AmnioticMembrane Mesenchymal Stem cell Release Molecules,ASRM)，简称为羊干素。
目前，国外各研究机构虽然已经明确干细胞释放分子作为干细胞产业领域非细胞治疗新策略的重要地位，但是尚无各种来源干细胞释放因子分泌组的产品上市。羊干素中ASRM成分研究尚不完善，羊干素治疗衰老相关退行性疾病的新药研发尚不成熟。如何提高羊干素中活性成分(抗氧化剂和多种生长因子等)以及如何进行羊干素剂型制备以使其活性成分避免降解是目前需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是针对以上问题，公开了一种羊干素及其制备方法和应用，制备了羊干素及其制剂冻干粉，解决了AMSCs细胞倍增时间长和多分化潜能差的问题，可以对羊干素活性成分定性、定量分析，可以提高羊干素中的活性成分如抗氧化剂和多种生长因子等，且使其活性成分避免降解。动物实验和临床试验结果表明，本技术制备的羊干素可用于延缓衰老、防治骨质疏松和皮肤衰老、促进皮肤创伤愈合。
为了实现上述目的，本发明采用下列技术方案：
一种羊干素，是通过从人胎盘羊膜组织中分离培养羊膜间充质干细胞，用人血小板裂解液培养扩增，再通过收集人羊膜间充质干细胞的培养上清，浓缩后收集制得。
上述羊干素与药学可接受的辅料制成制剂，优选制剂的剂型为冻干粉。
上述羊干素的制备方法，包括以下步骤：
(1)AMSCs培养和扩增
从胎盘剥离羊膜，即刻浸泡于含200U/ml青霉素及200μg/ml链霉素的α-MEM基础培养液中，4℃暂时保存，于12小时内进行原代培养；将羊膜取出，经含200U/ml青霉素及200μg/ml链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，去除血迹，转移至2-4ml EP管中剪碎，再将多管混合至50ml离心管中，按羊膜组织体积加入10倍体积的内含0.02％EDTA的0.5mg/mlTrypsin，于无菌恒温摇床37℃175-200rpm/min震荡30mins，2000rpm离心5-10mins后弃该消化液，反复2次；再加入内含0.05g/L DNAase的0.5mg/ml CollagenaseⅡ，37℃175-200rpm/min震荡90-120mins，2000rpm离心5-10mins后弃该消化液，以PBS洗重悬后离心沉淀，反复清洗2-3次，再次离心后弃上清，以α-MEM+15％胎牛血清(FBS)+Vitamin C(50μg/ml)+L-glutamine(2mM)完全培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3-4天收集未贴壁组织及培养液，以2000rpm离心10mins后，以上述完培重新接种培养，显微镜观察，原代细胞经内含0.02％EDTA的0.05mg/ml Trypsin消化传代至第2代进行质量检测，随后利用含5％人血小板裂解物(HPL)培养人羊膜间充质干细胞进行扩增培养，上述操作均为无菌条件下；
(2)AMSCs质量检测
1)病原微生物及生化检测：取步骤(1)中第3代AMSCs细胞，①通过直接接种法检测需氧菌、厌氧菌；②ELISA法检测HbsAg、HbcAb、HcvAb、抗-HIV(I+II)、CMV-IgM、梅毒抗体、EBV抗体；PCR法检测HTLV-I/II、支原体；③速率法检测ALT；④鲎试剂法检测内毒素。检测确定无感染源和毒素后才用于羊干素制备；
2)AMSCs干性维持的主要技术与性能指标：
利用流式细胞术检测CD29、CD44、CD73、CD105、SSEA4、CD14、HLA-DR、CD79b、CD34、CD45免疫表型相关分子表达，鉴定经培养扩增后的AMSCs维持间充质干细胞的免疫表型。利用实时荧光定量RT-PCR检测Oct4、Nanog、Sox2、CXCR4表达水平，鉴定经培养扩增后的AMSCs的干细胞特性不变。
(3)羊干素制备，具体步骤为：
培养步骤(2)中检测合格的第三代细胞铺满至90％以上，将α-MEM+5％HPL+Vitamin C(50μg/ml)+L-glutamine(2mM)完全培养液倾倒后，依次使用PBS、α-MEM基础培养液清洗2-3次，每次每皿加10ml，然后每皿加6mlα-MEM基础培养液(无酚红)，培养24小时后，收集上清，经0.22μm滤器过滤后，加至Amicon Ultra-15超滤管中，4000rpm离心30min-45min，浓缩至原容积1/2，收集、混匀、分装。
上述羊干素冻干粉，其特征在于是通过将羊干素加入右旋糖酐40和生物活性海藻糖溶解过滤后冻干制得。
上述羊干素冻干粉的制备方法包括以下步骤：
按1:1:15的质量比例分别将右旋糖酐40和生物活性海藻糖溶于羊干素，经0.22μm滤器过滤后，分装密封冻存于-75～-85℃，待完全冻成固体后取出，稍微开启容器塞至液体与外界相通即可，在将冻干箱提前进行空箱降温至-25℃以下后，将安剖瓶放入冻干箱内；抽真空之前要根据冷阱制冷机的降温速度提前使冷阱工作，抽真空时冷阱至少应达到-40℃的温度；待真空度达到13Pa～26Pa，继续抽真空1～2h以上；进行升华干燥24-48h；升华干燥结束后，拧开进气阀进气，打开冻干箱，然后尽快地进行加塞封口，以防重新吸收空气中的水分；至冻干成白色粉状后，塞紧橡胶塞，并按压上铝制瓶盖，保存于-20℃。上冻干机冻干，至冻干成白色粉状。
将羊干素制成冻干粉之前需要进行羊干素质控，方法为：
采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析羊干素的蛋白表达谱。并利用ELISA检测羊干素中的生物活性分子水平。
本发明所述羊干素用于制备抗衰老、抗骨质疏松和促进皮肤创伤愈合的药物，以及延缓皮肤衰老的护肤品。
下面就本发明的实验和临床效果进一步说明本发明的技术优势：
(1)AMSCs培养和扩增优化技术
本发明通过含肝素和5％人血小板裂解物(HPL)(HELIOS BioScience Co.,USA)培养替代15％胎牛血清(FBS)(PAA,GE Healthcare,Austria)培养，人羊膜间充质干细胞(AMSCs)经反复传代后成纤维样形态依然典型，如图1所示；平均倍增时间由4-5天缩短至1天，大大提高了扩增效率，如图2所示，相同培养时间内，针对FBS培养的第8代(F8)和HPL培养到第15代的AMSCs，通过细胞计数试剂盒CCK8检测细胞增殖(P<0.001与FBS组相比)，从图中可见细胞倍增时间明显缩短；免疫表型相关分子表达结果显示间充质干细胞纯度更高，免疫原性降低，而其多分化潜能不变，如图3-4和表1所示。
表1HPL对AMSCs免疫表型的影响
注：上述参考值参见Silvia Diaz-Prado et al.Journal of CellularBiochemistry,2010.
(2)优化羊干素制备技术
相同培养时间内，针对FBS培养的第8代(F8)和HPL培养到第15代的AMSCs分泌的羊干素，通过T-SOD和CAT生化试剂盒进行检测，检测发现后者总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)含量明显增加，如图5所示；采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析羊干素的蛋白表达谱，检测羊干素中干细胞释放的分子(ASRM)种类及含量，结果显示后者增加了羊干素中生物活性成分的种类和含量，如图6所示。
(3)羊干素注射抗衰老及防止骨质疏松作用优于AMSCs移植
为了比较羊干素注射与AMSCs移植在抗衰老和抗骨质疏松中的作用，本发明通过腹腔注射羊干素或100μl到出生后2天的成熟前衰老模型Bmi-1纯合子(Bmi-1-/-)小鼠，每日1次，或通过腹腔注射1×107AMSCs/100μl PBS到Bmi-1-/-小鼠，出生后2天注射1次，然后每5天1次，对照组腹膜腔注射等量PBS。观察了羊干素注射与AMSCs移植对Bmi-1-/-小鼠生存期的影响，并比较分析了4周龄同窝野生型(WT)小鼠、对照组Bmi-1-/-小鼠、AMSCs移植组Bmi-1-/-小鼠(Bmi-1-/-+AMSCs)和羊干素注射组Bmi-1-/-小鼠(Bmi-1-/-+ASRM)骨骼表型变化，如图7所示。结果证明羊干素注射延长寿命及防止衰老相关的骨质疏松作用明显优于AMSCs移植，表现为羊干素注射组小鼠体型纠正、生存期延长、成骨细胞数增加和脂肪细胞数减少更为明显，成骨细胞碱性磷酸酶和I型胶原阳性面积增加更多。
(4)纳米微针导入羊干素发挥延缓皮肤衰老的作用及机制
1)临床试验证实有效
通过分别与两个不同的医院合作，开展纳米微针导入羊干素临床试验，在两个医院分别招募多名志愿者进行为期四周的治疗及评估，通过由VISIA皮肤检测仪分析测定羊干素治疗前后的斑点、紫外线色斑、棕色斑、红色区、皱纹、纹理、毛孔、紫质沉积等改善情况，结果显示纳米微针能有效地导入羊干素中活性成分渗入皮肤深处，减少斑点、紫外线色斑、棕色斑、红色区、皱纹、纹理、毛孔和紫质沉积；通过CK皮肤检测仪分析经皮水分丢失(transepidermalwaterloss,TEWL)及角质层含水量，结果显示纳米微针能有效地导入羊干素中活性成分渗入皮肤深处，维持皮肤的水通透屏障，减少经皮水分丢失，维持角质层含水量，效果如图8-9所示。本研究表明，纳米微针导入羊干素主要通过促进皮肤新陈代谢、减少色斑沉着，增加皮肤弹性及胶原含量、减少纹理和皱纹，维持水通透屏障、减少水分丢失，彻底改善肤质，从内而外滋养肌肤，还原肌肤年轻态。
2)动物实验探究机制
为了进一步研究纳米微针导入羊干素治疗皮肤衰老的作用机制，使用纳米微针导入羊干素，每日0.2ml，至3周龄Bmi-1-/-小鼠背部皮肤连续7天，对照组导入等量PBS。继而分别对4周龄同窝野生型(WT)小鼠、对照组Bmi-1-/-小鼠和羊干素导入组Bmi-1-/-小鼠(Bmi-1-/-+ASRM)进行皮肤表型分析。结果表明羊干素导入通过抑制氧化应激延缓皮肤衰老。与对照组Bmi-1-/-小鼠相比，羊干素导入组小鼠皮肤氧自由基(ROS)水平明显下降，皮肤总厚度、真皮层厚度、角质层厚度都明显增加，如图11所示。因此，纳米微针导入羊干素通过减少氧自由基延缓小鼠皮肤衰老。
(5)羊干素局部使用促进皮肤创伤愈合
为了研究羊干素治疗在皮肤创伤愈合中的作用，使用体重20g的野生型雄鼠进行皮肤创伤造模，设立羊干素治疗组(ASRM)和对照组(Vehicle)，观察1-14天皮肤创伤愈合变化，并在创伤后第14天取材进行病理组织学分析，通过HE染色观察皮肤结构恢复，通过总胶原(T-Col)组织化学染色观察皮肤瘢痕组织胶原沉积；通过PCNA免疫组化染色观察皮肤细胞增殖情况；通过超氧化物歧化酶2(SOD2)免疫组化染色观察抗氧化酶SOD2表达；通过实时荧光定量RT-PCR检测抗氧化酶相关基因：SOD1、SOD2、谷胱甘肽过氧化物酶1(Gpx1)、Gpx4和谷胱甘肽还原酶(GSR)表达。如图12结果显示：与Vehicle组相比，ASRM组皮肤结构恢复明显较优；皮肤瘢痕组织胶原沉积明显减少；皮肤细胞增殖明显较优；抗氧化酶SOD2生成明显增加；抗氧化酶相关基因：SOD1、SOD2、谷胱甘肽过氧化物酶1(Gpx1)、Gpx4和谷胱甘肽还原酶(GSR)表达水平明显增加。通过上述小鼠皮肤创伤治疗实验结果表明：羊干素主要通过促进皮肤细胞增殖、结构恢复，防止瘢痕愈合，升高抗氧化酶表达发挥抗氧化作用来实现促进皮肤伤口愈合的作用。
附图说明
图1为使用FBS培养AMSCs(按1:2传代)到第8代和使用HPL培养(按1:3传代)到第15代的细胞形态对比图。
图2为使用FBS培养AMSCs到第8代和使用HPL培养到第15代的细胞增殖数据对比图，***：P<0.001与FBS组相比。
图3为流式细胞仪分析间充质干细胞标记分子CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，造血干细胞标记分子CD34、CD45，B细胞标记分子CD79b，单核细胞标记分子CD14，免疫原性标记分子HLA-DR和胚胎干细胞标记分子SSEA-4在AMSCs的表达结果图。
图4为向脂肪细胞诱导培养14天后和向成骨细胞诱导培养21天后的显微镜观察图，图中，油红染色显示部分细胞已分化为脂肪细胞，茜素红染色显示部分细胞已分化为成骨细胞并出现钙结节。
图5为相同培养时间内，针对FBS培养的第8代(F8)和HPL培养到第15代的AMSCs分泌的羊干素中总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)含量对比图，***：P<0.001与FBS组相比。
图6为相同培养时间内，针对FBS培养的第8代(F8)和HPL培养到第15代的AMSCs分泌的羊干素，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析羊干素的蛋白表达谱。
图7为羊干素注射与AMSCs移植在抗衰老和抗骨质疏松中的作用对比图，图中，(A)4周龄野生型(WT)小鼠、对照组Bmi-1-/-小鼠、AMSCs移植组Bmi-1-/-小鼠(Bmi-1-/-+AMSCs)和羊干素注射组Bmi-1-/-小鼠(Bmi-1-/-+ASRM)四组小鼠大体照；(B)小鼠的生存曲线。(C-F)四组小鼠胫骨分别进行总胶原染色(T-Col)、HE染色、碱性磷酸酶染色(ALP)和I型胶原(Col-I)免疫组化染色；(G-K)统计图，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001与WT组小鼠相比；#,P<0.05；##,P<0.01；##,P<0.001与Bmi-1-/-小鼠相比；&,P<0.05与Bmi-1-/-+AMSCs小鼠相比。
图8为病人纳米微针导入羊干素治疗效果图，图中，图A-C为VISIA皮肤检测仪分析面部正面、右侧和左侧面图像；图D-F为A-C的相应结果分析图；图G为CK皮肤检测仪分析经皮水分丢失(TEWL)及角质层含水量结果分析图。
图9为病人纳米微针导入羊干素治疗效果图，图中，图A-C为VISIA皮肤检测仪分析面部正面、右侧和左侧面图像；图D-F为A-C的相应结果分析图；图G为CK皮肤检测仪分析经皮水分丢失(TEWL)及角质层含水量结果分析图。
图10为病人经羊干素治疗后斑点、细纹、毛孔、皱纹、紫外线色斑的变化图，图中，左列为VISIA皮肤检测仪分析图像，右列为相应特征计数柱状图；**：p<0.01，***：p<0.001，与治疗前相比。
图11为钠米微针导入羊干素对小鼠皮肤的影响变化图，图中，4周龄野生型(WT)小鼠、对照组Bmi-1-/-小鼠和羊干素注射组Bmi-1-/-小鼠(Bmi-1-/-+ASRM)三组小鼠大体照。(A-B)皮肤的氧自由基(ROS)水平检测值及统计图。(C-D)皮肤分别进行HE染色和总胶原染色(T-Col)染色。(E-G)皮肤总厚度、真皮层厚度和总胶原层所示角质层厚度统计图。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001与WT组小鼠相比；#,P<0.05；##,P<0.001与Bmi-1-/-小鼠相比。
图12为羊干素局部使用促进皮肤创伤愈合效果图，图中，羊干素治疗组(ASRM)和对照组(Vehicle)，(A)皮肤创伤模型第1天和第14天愈合图像；(B)第14天皮肤创伤愈合度显示ASRM组愈合明显优于Vehicle组；皮肤创伤模型第14天(C)HE染色结果显示ASRM组皮肤结构恢复明显优于Vehicle组；(D)总胶原(T-Col)组织化学染色显示ASRM组皮肤瘢痕组织胶原沉积明显少于Vehicle组；(E)PCNA免疫组化染色显示ASRM组皮肤细胞增殖明显优于Vehicle组；(F)超氧化物歧化酶2(SOD2)免疫组化染色及统计结果显示ASRM组SOD2生成明显多于Vehicle组；(G-I)总胶原阳性面积、PCNA阳性细胞数、SOD2阳性面积统计图；(J)实时荧光定量RT-PCR结果显示ASRM组抗氧化酶相关基因：SOD1、SOD2、谷胱甘肽过氧化物酶1(Gpx1)、Gpx4和谷胱甘肽还原酶(GSR)表达水平明显于Vehicle组；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，与对照组小鼠相比。
具体实施方式
为了更清晰的理解本发明，以下结合实例对本发明做进一步描述。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不以任何方式限制本发明。
实施例1
一种羊干素及其冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)AMSCs培养和扩增
在无菌条件下，从手术台分娩的正常足月产健康婴儿胎盘剥离羊膜，即刻浸泡于含200U/ml青霉素及200μg/ml链霉素的α-MEM基础培养液中4℃暂时保存，于12小时内进行原代培养。在细胞操作无菌台内将羊膜取出，经含200U/ml青霉素及200μg/ml链霉素的的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，去除血迹，转移至5ml EP管中使用眼科剪剪碎，再将多管混合至50ml离心管中，按体积比1：10加入0.5mg/ml Trypsin(内含0.02％EDTA)，于无菌恒温摇床37℃200rpm/min震荡30mins，2000rpm离心10mins后弃该消化液，反复2次；再加入0.5mg/mlCollagenaseⅡ(内含0.05g/L DNAase)，于无菌恒温摇床37℃200rpm/min震荡90-120mins，2000rpm离心10mins后弃该消化液，以PBS洗重悬后离心沉淀，反复清洗2-3次，再次离心后弃上清，以α-MEM+15％胎牛血清(FBS)+Vitamin C(50μg/ml)+L-glutamine(2mM)完全培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3-4天收集未贴壁组织及培养液，以2000rpm离心10mins后，以上述完培重新接种于培养皿上培养，显微镜观察，原代细胞经0.05mg/mlTrypsin(内含0.02％EDTA)消化传代至第2代进行质量检测，随后利用含5％人血小板裂解物(HPL)(HELIOS BioScience Co.,USA)替代15％胎牛血清(FBS)(PAA,GE Healthcare,Austria)培养AMSCs进行扩增培养。
上述试剂除HPL和FBS外，均来自于美国Thermo Fisher公司Gibco品牌。
(2)AMSCs质量检测
1)病原微生物及生化检测：取第3代AMSCs细胞，①通过直接接种法检测需氧菌、厌氧菌；②ELISA法检测HbsAg、HbcAb、HcvAb、抗-HIV(I+II)、CMV-IgM、梅毒抗体、EBV抗体；PCR法检测HTLV-I/II、支原体；③速率法检测ALT；④鲎试剂法检测内毒素。检测合格后才用于羊干素制备；
2)AMSCs干性维持的主要技术与性能指标：
利用流式细胞术检测CD29、CD44、CD73、CD105、SSEA4、CD14、HLA-DR、CD79b、CD34、CD45免疫表型相关分子表达，鉴定经培养扩增后的AMSCs维持间充质干细胞的免疫表型。利用实时荧光定量RT-PCR检测Oct4、Nanog、Sox2、CXCR4表达水平，鉴定经培养扩增后的AMSCs的干细胞特性不变。
(3)羊干素制备，具体步骤为：
培养第三代细胞铺满至90％以上，将α-MEM+5％HPL+Vitamin C(50μg/ml)+L-glutamine(2mM)完全培养液倾倒后，先使用PBS清洗3次，每次每皿加10ml，再使用α-MEM基础培养液(无酚红)清洗2次，每次每皿加10ml。然后每皿加6mlα-MEM基础培养液(无酚红)，培养24小时后，收集上清，经0.22μm滤器过滤后，加至Amicon Ultra-15超滤管中，4000rpm离心30min-45min，浓缩至原容积1/2，收集、混匀、分装。
(4)羊干素质控
采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析羊干素的蛋白表达谱，以此作为羊干素的质控指标，具体参见图6。
(5)羊干素冻干粉制备
分别将4g右旋糖酐40和4g生物活性海藻糖溶于60ml浓缩后的羊干素，经0.22μm滤器过滤后，分装于安瓿瓶中，盖上胶塞，冻存于-80℃。待完全冻成固体后，取出稍微开启橡胶塞，至瓶内液体与外界相通即可，上冻干机冻干。至冻干成白色粉状后，塞紧橡胶塞，并按压上铝制瓶盖。保存于-20℃。
应用例1
一种羊干素面霜制备方法，包括以下步骤：
水浴锅调温至85-90℃，等待升温的过程中，配置各项成分；将汉生胶放入烧杯，加相应量甘油玻璃棒搅拌混匀；加水搅拌混匀；称取水相其他成分放入水浴锅加热搅拌混匀；称取油相各成分于另一烧杯中，于水浴锅中搅拌加热至溶解；以上两只烧杯在加热搅拌过程中注意防止蒸发，可用保鲜膜覆盖杯口；待温度升至90℃，且水相油相均混匀溶解，缓慢将水相倒入油相中，注意搅拌速度也不要太快，以防产生气泡；搅拌混匀成均一乳白色液体后，换均质机均质，均质速度以不产生气泡为限，均质2-3min；换搅拌器继续90℃搅拌5min。如若有气泡，还需延长加热搅拌时间，至气泡消除为止；降温，此时可关闭水浴锅，烧杯继续留在水浴锅内缓慢降温，或者将烧杯撤离水浴锅快速降温。降温过程中，乳液逐渐增稠，注意不时调整搅拌桨，以搅拌均匀；待降温至40℃左右，逐步缓慢加入有效成分相的各种成分，含水成分加入过快会导致破乳，若明显导致破乳可适当减少含水有效成分的加入，此步骤也影响最终面霜稀稠；降至室温，分装。
上述步骤中：
水相包含：去离子水600-1200ml，乙二胺四乙酸二钠(EDTA 2Na)1-2g，甘油40-80ml，汉生胶1.5-3.0ml，生物活性海藻糖50-100g，辅酶Q10(CoQ10)120-240mg。
油相包含：甜杏仁油20-40ml，新戊二醇二辛酸/癸酸酯(NPGC-2)30-60ml，十三烷醇偏苯三酸酯(TDTM)10-20ml，棕榈酸异辛酯(2EHP)10-20ml，TDS液20-40ml，美国道康宁挥发性硅油(DC345)20-40ml，天来加TT香精1-2g，优榄乳化剂30-60g，乳木果油15-30ml，合成角鲨烷45-90ml，LUXE乳化剂20-40ml。
有效成分相包含：GPL防腐剂3-6ml，维生素E 5-10ml，小分子玻璃酸50-100ml，羊干素10-20ml，100x维生素C 1-2ml。

Claims (8)

1.一种羊干素，其特征在于是通过从人胎盘羊膜组织中分离培养羊膜间充质干细胞，用人血小板裂解液培养扩增，再通过收集人羊膜间充质干细胞的培养上清，浓缩后收集制得。
2.根据权利要求1所述的羊干素，其特征在于所述羊干素与药学可接受的辅料制成制剂，优选制剂的剂型为冻干粉。
3.一种权利要求1所述的羊干素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)胎盘羊膜组织中分离培养和扩增人羊膜间充质干细胞：从胎盘剥离羊膜，即刻浸泡于含200U/ml青霉素及200μg/ml链霉素的α-MEM基础培养液中，4℃暂时保存，于12小时内进行原代培养；将羊膜取出，经含200U/ml青霉素及200μg/ml链霉素的PBS清洗，去除血迹，转移至2-4mlEP管中剪碎，再将多管混合至50ml离心管中，按羊膜组织体积加入10倍体积的内含0.02％EDTA的0.5mg/ml Trypsin，于无菌恒温摇床37℃175-200rpm/min震荡30mins，2000rpm离心5-10mins后弃该消化液，反复2次；再加入内含0.05g/L DNAase的0.5mg/mlCollagenaseⅡ，37℃175-200rpm/min震荡90-120mins，2000rpm离心5-10mins后弃该消化液，以PBS洗重悬后离心沉淀，反复清洗2-3次，再次离心后弃上清，以α-MEM+15％胎牛血清+50μg/ml Vitamin C+2mM L-glutamine完全培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3-4天收集未贴壁组织及培养液，以2000rpm离心10mins后，以上述完培重新接种培养，显微镜观察，原代细胞经内含0.02％EDTA的0.05mg/ml Trypsin消化传代至第2代进行质量检测，随后利用含5％人血小板裂解物培养人羊膜间充质干细胞进行扩增培养，上述操作均为无菌条件下；
(2)人羊膜间充质干细胞质量检测：
1)病原微生物及生化检测
取步骤(1)中第3代人羊膜间充质干细胞，①通过直接接种法检测需氧菌、厌氧菌；②ELISA法检测HbsAg、HbcAb、HcvAb、抗-HIV(I+II)、CMV-IgM、梅毒抗体、EBV抗体；PCR法检测HTLV-I/II、支原体；③速率法检测ALT；④鲎试剂法检测内毒素；检测确定细胞无病原微生物感染和毒素；
2)人羊膜间充质干细胞干性维持的主要技术与性能指标检测
利用流式细胞术检测CD29、CD44、CD73、CD105、SSEA4、CD14、HLA-DR、CD79b、CD34、CD45免疫表型相关分子表达，鉴定经培养扩增后的人羊膜间充质干细胞维持间充质干细胞的免疫表型，利用实时荧光定量RT-PCR检测Oct4、Nanog、Sox2、CXCR4表达水平，鉴定经培养扩增后的人羊膜间充质干细胞特性不变；
(3)羊干素制备：培养步骤(2)中检测合格的第三代细胞铺满至90％以上，将α-MEM+5％HPL+50μg/ml Vitamin C+2mM L-glutamine完全培养液倾倒后，依次使用PBS、α-MEM基础培养液清洗2-3次，每次每皿加10ml，然后每皿加6ml α-MEM基础培养液，培养24-48小时后，收集上清，经0.22μm滤器过滤后，加至Amicon Ultra-15超滤管中，4000rpm离心30min-45min，浓缩至原容积1/2，收集、混匀、分装。
4.一种权利要求2所述的羊干素冻干粉，其特征在于是通过将羊干素加入右旋糖酐40和生物活性海藻糖溶解过滤后冻干制得。
5.一种权利要求4所述的羊干素冻干粉的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
按1:1:15的质量比例分别将右旋糖酐40和生物活性海藻糖溶于羊干素，经0.22μm滤器过滤后，分装密封冻存于-75～-85℃，待完全冻成固体后取出，稍微开启容器塞至液体与外界相通即可，上冻干机冻干，至冻干成白色粉状。
6.根据权利要求5所述的羊干素冻干粉的制备方法，其特征在于所述冻干包括以下步骤：在将冻干箱进行空箱降温至-25℃以下后，将容器放入冻干箱内；抽真空之前提前使冷阱工作，抽真空时冷阱温度不高于-40℃；待真空度达到13Pa～26Pa，继续抽真空1～2h以上；进行升华干燥24～48h；升华干燥结束后，拧开进气阀进气，打开冻干箱，然后进行加塞封口，以防重新吸收空气中的水分。
7.根据权利要求5所述的羊干素冻干粉的制备方法，其特征在于羊干素制备冻干粉前需进行羊干素质控。
8.权利要求1所述的羊干素在制备抗衰老、抗骨质疏松和促进皮肤创伤愈合的药物，延缓皮肤衰老的护肤品中的应用。
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