CN111226902B - 一种外泌体保存液及外泌体的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种外泌体保存液及外泌体的保存方法，属于生物技术领域。本发明提供的一种外泌体保存液，包括牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液。本发明还提供保存外泌体的保存方法，包括将本发明所述外泌体保存液置于85℃～95℃加热10‑30min，形成胶体溶液，再将外泌体保存于胶体溶液中。本发明中的外泌体保存液能够长期保持外泌体的完整性、生物活性以及内含物稳定性。

Description

一种外泌体保存液及外泌体的保存方法

技术领域

本发明涉及一种外泌体保存液及外泌体的保存方法，属于生物技术领域。

背景技术

外泌体(exosomes)是一种由活细胞分泌，直径在30-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中，内含丰富的蛋白质、脂质以及核酸等生物活性成分。外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用，吸引了很多科研人员的关注，在深入研究外泌体前，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，只有高活性、高稳定性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。

目前外泌体只能在2～8℃稳定保存3天，-20℃稳定保存1个月。长期保存需要-80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。

由此，有效保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性的外泌体保存液仍有待开发。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能长期保持外泌体的完整性、生物活性以及内含物稳定性的外泌体保存液。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种外泌体保存液，所述外泌体保存液包括牛血清白蛋白(BSA)、海藻糖、甘油、二甲基亚砜(DMSO)和磷酸盐缓冲液(PBS)。

目前，外泌体保存液种类极少，并且其保存液保存效果不佳，容易造成外泌体在保存过程中结构被破坏，生物活性丧失，或内含物降解，影响对外泌体的后续检测、标记等下游的研究或应用。鉴于此，本申请的发明人经过大量实验发现，含有牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、二甲基亚砜、磷酸盐缓冲液的外泌体保存液能够很好地保护外泌体，使其在2～8℃或-20℃下仍可以长期保持形态结构和生物活性，且内含物稳定性较好。

本发明所述的外泌体保存液中，牛血清白蛋白的添加，增加了外泌体保存液体系中蛋白质浓度，防止蛋白酶对外泌体膜蛋白的水解；海藻糖的添加，对外泌体具有较好的保护作用，在低温条件下海藻糖能在外泌体表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持外泌体的生物活性；甘油的添加，使保存液具有抗冻性，在-20℃不会结冰，防止外泌体在保存和使用过程中因冻融产生的结构破坏；二甲基亚砜能够快速穿透外泌体膜进入外泌体中，降低冰点、进一步防止保存液结冰，同时提高外泌体膜内离子浓度，减少膜内冰晶的形成，从而保护外泌体结构及其内含物的稳定性；磷酸盐缓冲液与外泌体自然状态下的pH值、渗透压一致，具有维持外泌体渗透压、控制酸碱平衡的作用，同时磷酸盐缓冲溶液易与Ca²⁺离子、Mg²⁺离子以及重金属离子缔合生成沉淀，抑制外泌体内的生物化学反应以及多数酶的活性，进一步保护外泌体结构的完整性以及内含物的稳定性。

因此，本发明所述的外泌体保存液能长期保持外泌体的完整性、生物活性以及内含物稳定性。

作为本发明所述的外泌体保存液的优选实施方式，所述牛血清白蛋白的浓度为1～10g/L，进一步较好地长期保持外泌体的完整性，避免外泌体的结构破坏。

作为本发明所述的外泌体保存液的优选实施方式，所述海藻糖的浓度为10～50g/L，进一步保护外泌体表面蛋白质分子不变性失活，从而维持外泌体的生物活性。

作为本发明所述的外泌体保存液的优选实施方式，所述甘油的浓度为30％～50％(v/v)，使得外泌体保存液进一步具有抗冻性，防止保存液结冰，防止外泌体在保存和使用过程中因冻融产生的结构破坏。

作为本发明所述的外泌体保存液的优选实施方式，所述二甲基亚砜的浓度为5％～10％(v/v)，以便进一步较好地防止保存液结冰，同时进一步较好的提高外泌体膜内离子浓度，减少膜内冰晶的形成，从而保护外泌体结构及其内含物的稳定性。

作为本发明所述的外泌体保存液的优选实施方式，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.02mol/L，以便进一步较好地维持外泌体保存液的酸碱度和渗透压平衡，使其长期保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性。

作为本发明所述的外泌体保存液的优选实施方式，所述外泌体保存液的pH值为7.0～7.5，以便进一步长期保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性。

另外，本发明的另一目的是提供一种外泌体的保存方法，包括如下步骤：

(1)将本发明所述的外泌体保存液加热，制备成胶体溶液；

(2)将外泌体置于步骤(1)所述的胶体溶液中。

作为本发明所述外泌体的保存方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述加热的温度为85℃～95℃。

作为本发明所述外泌体的保存方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述加热的时间为10～30min。

本申请发明人意外地发现，将外泌体保存液置于85℃～95℃加热10～30min后，保存液从均一透明的溶液状态荧变为乳白的胶体状态，外泌体保存在胶体溶液中，胶体均匀地分布在外泌体周围，使外泌体不容易发生聚集沉淀。另外，85℃～95℃加热，能灭活保存液中的蛋白酶、核酸酶、微生物等有害物质，进一步保持外泌体的生物活性。

外泌体在本发明的外泌体保存液内能够长期保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所述的外泌体保存液能长期保持外泌体的完整性、生物活性以及内含物稳定性；

(2)本发明所述的外泌体保存液中，添加牛血清白蛋白，增加了外泌体保存液体系中蛋白质浓度，防止蛋白酶对外泌体膜蛋白的水解；

(3)本发明所述的外泌体保存液中，添加海藻糖，对外泌体具有较好的保护作用，在低温条件下海藻糖能在外泌体表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持外泌体的生物活性；

(4)本发明所述的外泌体保存液中，添加甘油，使保存液具有抗冻性，在-20℃不会结冰，防止外泌体在保存和使用过程中因冻融产生的结构破坏；

(5)本发明所述的外泌体保存液中，添加二甲基亚砜，能够快速穿透外泌体膜进入外泌体中，降低冰点、进一步防止保存液结冰，同时提高外泌体膜内离子浓度，减少膜内冰晶的形成，从而保护外泌体结构及其内含物的稳定性；

(6)本发明所述的外泌体保存液中，添加磷酸盐缓冲液，其与外泌体自然状态下的pH值、渗透压一致，具有维持外泌体渗透压、控制酸碱平衡的作用，同时磷酸盐缓冲溶液易与Ca2+离子、Mg2+离子以及重金属离子缔合生成沉淀，抑制外泌体内的生物化学反应以及多数酶的活性，进一步保护外泌体结构的完整性以及内含物的稳定性。

附图说明

图1为实验例1中使用实施例1的外泌体保存液保存的外泌体的CD63蛋白荧光强度点状图；

图2为实验例2中外泌体GAPDH基因等温扩增结果图；

图3为实验例2中外泌体GAPDH基因等温扩增曲线；

图4为实验例3中使用对比例1的外泌体保存液保存的外泌体的CD63蛋白荧光强度点状图；

图5为实验例4中使用对比例4的外泌体保存液保存的外泌体的CD63蛋白荧光强度点状图。

具体实施方式

在本发明的一个方面，本发明提出了一种外泌体保存液。利用本发明的外泌体保存液保存外泌体能够长期保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性。

根据本发明实施例，该外泌体保存液包括牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、二甲基亚砜、磷酸盐缓冲液。本发明用该外泌体保存液保存外泌体，能够为外泌体提供适宜环境。

本申请的发明人经过大量的实验意外地发现，外泌体保存液中的蛋白浓度对于外泌体的稳定保存发挥着重要的作用，在合适的蛋白浓度下外泌体的稳定性好，在低蛋白浓度下外泌体丧失活性。牛血清白蛋白是牛血清中的一种蛋白质，可防止外泌体表面蛋白的变性、分解和非特异性吸附，能减轻有些不利环境因素如冷冻，表面张力及化学因素引起的变性，从而使得外泌体长期保持生物活性。

外泌体保存液中的海藻糖对生物活性物质具有神奇的保护作用，因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在物质表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生物活性。而蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖等其它糖类，均不具备这一功能。

为了提高外泌体保存液的抗冻性，本申请发明人选择向其中添加抗冻物质。目前，起抗冻作用的物质很多，起到的效果也不尽相同。有些抗冻物质在发挥抗冻作用的同时对蛋白的活性损害巨大，例如乙醇等；也有些抗冻物质会影响外泌体的后续使用，例如乙二醇等。有鉴于此，发明人经过大量实验创造性地发现，将甘油和二甲基亚砜加入到保存液后，可防止保存液结冰，并且对外泌体活性无损伤，对外泌体后续实验也无影响。另外，发明人意外地发现，二甲基亚砜能够使得保存液具备较好的热稳定性，例如短期耐受2～8℃高温，由此适用于冷藏保存，避免低温保存对运输和存储带来的不便。

牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、二甲基亚砜、磷酸盐缓冲液的复配是发明人经过大量实验创造性发现的，在此条件下所得到的外泌体保存液能够长期保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性。可以在2～8℃或-20℃下长期保存，最长可达1年。

根据本发明实施例，牛血清白蛋白的浓度为1～10g/L。由此，能够为外泌体提供适宜的蛋白浓度环境，使其长期保持生物活性。具体地，若牛血清白蛋白浓度过低，外泌体将处于低蛋白浓度的环境中，容易受蛋白酶降解从而导致外泌体失去活性；若牛血清白蛋白浓度过高，会干扰后续的标记、检测。

根据本发明实施例，海藻糖的浓度为10～50g/L。由此，能够在外泌体表面形成保护膜，防止外泌体表面蛋白失活。具体地，若海藻糖的浓度过低，不能有效地保护外泌体表面蛋白质活性；若海藻糖的浓度过高，会造成外泌体保护液渗透压过高，使外泌体水分流失而导致内含物不稳定。

根据本发明实施例，甘油的浓度为30％～50％(v/v)。由此可有效防止保存液结冰。具体地，若甘油浓度过低，则不能很好地防止保存液结冰；若甘油浓度过高，会增加保存液的粘度，不利于外泌体的后续使用。

根据本发明实施例，二甲基亚砜的浓度为5％～10％(v/v)。由此可有效防止外泌体内形成冰晶。具体地，若二甲基亚砜浓度过低，则不能很好地防止外泌体内形成冰晶；若二甲基亚砜浓度过高，会导致外泌体失去生物活性。

根据本发明实施例，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.02mol/L。由此能够调节外泌体保存液的渗透压和离子强度。具体地，若磷酸盐缓冲液的浓度过低，渗透压和离子强度过低，容易出现外泌体吸水而破裂；若磷酸盐缓冲液的浓度过高，则外泌体表面蛋白因盐析作用导致溶解度降低，进而使外泌体出现聚集沉淀。

根据本发明实施例，外泌体保存液的pH值为7.0～7.5。外泌体的最适pH值在7.2左右，发明人经过大量实验发现，利用磷酸盐缓冲液将外泌体保存液的pH维持在7.0～7.5的范围内，为外泌体提供一个酸碱度稳定的环境，能够避免外泌体因过酸或过碱而丧失生物活性。

在本发明的另一个方面，本发明提出了一种保存外泌体的方法，包括：将上述外泌体保存液置于85℃～95℃加热10～30min，制备成胶体溶液；然后将外泌体置于上述的胶体溶液内。外泌体在本发明的外泌体保存液内能够长期保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性。

发明人意外地发现，将外泌体保存液置于85℃～95℃加热10～30min后，保存液从均一透明的溶液状态荧变为乳白的胶体状态，外泌体保存在胶体溶液中，胶体均匀地分布在外泌体周围，使外泌体不容易发生聚集沉淀。另外，85℃～95℃加热，能灭活保存液中的蛋白酶、核酸酶、微生物等有害物质，进一步保持外泌体的生物活性。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对外泌体保存液所描述的特征和优点，同样适用于该保存外泌体的方法，在此不再赘述。

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例为本发明的一种外泌体保存液，所述外泌体保存液包括1g/L牛血清白蛋白、30g/L海藻糖、50％(v/v)甘油、5％(v/v)二甲基亚砜和0.01mol/L磷酸盐缓冲液；本实施例所述的外泌体保存液pH值为7.2。

实施例2

本实施例为本发明的一种外泌体保存液，所述外泌体保存液包括10g/L牛血清白蛋白、10g/L海藻糖、30％(v/v)甘油、10％(v/v)二甲基亚砜和0.02mol/L磷酸盐缓冲液；本实施例所述的外泌体保存液pH值为7.0。

实施例3

本实施例为本发明的一种外泌体保存液，所述外泌体保存液包括5g/L牛血清白蛋白、40g/L海藻糖、40％(v/v)甘油、8％(v/v)二甲基亚砜和0.015mol/L磷酸盐缓冲液；本实施例所述的外泌体保存液pH值为7.5。

实施例4

本实施例为本发明所述外泌体的保存方法，包括如下步骤：

(1)将实施例1所述的外泌体保存液90℃加热20min，形成胶体溶液，冷却；

(2)将分离纯化后的外泌体置于步骤(1)所述的胶体溶液中。

实施例5

本实施例为本发明所述外泌体的保存方法，包括如下步骤：

(1)将实施例1所述的外泌体保存液85℃加热10min，形成胶体溶液，冷却；

(2)将分离纯化后的外泌体置于步骤(1)所述的胶体溶液中。

实施例6

本实施例为本发明所述外泌体的保存方法，包括如下步骤：

(1)将实施例1所述的外泌体保存液95℃加热30min，形成胶体溶液，冷却；

(2)将分离纯化后的外泌体置于步骤(1)所述的胶体溶液中。

对比例1

本对比例为一种外泌体保存液，所述外泌体保存液包括1g/L牛血清白蛋白、30g/L蔗糖、50％(v/v)甘油、5％(v/v)二甲基亚砜和0.01mol/L磷酸盐缓冲液；本对比例所述的外泌体保存液pH值为7.2。

对比例2

本对比例为一种外泌体保存液，所述外泌体保存液包括15g/L牛血清白蛋白、30g/L海藻糖、50％(v/v)甘油、5％(v/v)二甲基亚砜和0.01mol/L磷酸盐缓冲液；本对比例所述的外泌体保存液pH值为7.2。

对比例3

本对比例为一种外泌体保存液，所述外泌体保存液包括1g/L牛血清白蛋白、60g/L海藻糖、50％(v/v)甘油、5％(v/v)二甲基亚砜和0.01mol/L磷酸盐缓冲液；本对比例所述的外泌体保存液pH值为7.2。

对比例4

本对比例为一种外泌体保存液，所述外泌体保存液包括1g/L牛血清白蛋白、30g/L海藻糖、20％(v/v)甘油、5％(v/v)二甲基亚砜和0.01mol/L磷酸盐缓冲液；本对比例所述的外泌体保存液pH值为7.2。

实验例1

(1)外泌体的分离纯化

将人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。此后，将其以2000×g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3000×g离心10分钟。向上清液加入等体积的PBS以10000×g离心30分钟，然后以200000×g进行2小时超速离心。将血清中外泌体之前的颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.22μm注射器过滤器过滤，并以200000×g离心1小时，收集沉淀并重悬于PBS中。

(2)外泌体保存液的制备

按实施例1配方配制外泌体保存液，室温下搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤，备用。

(3)外泌体保存

外泌体保存液置于90℃加热20min，形成胶体溶液，冷却；将制得的胶体溶液将(1)制得的外泌体进行1:1稀释，稀释后的外泌体分装为两份，一份置于2℃～8℃保存，另一份置于-20℃保存。

(4)外泌体CD63蛋白免疫活性检测

将鼠抗人抗CD63单克隆抗体用10mmol/L PBS缓冲液稀释到0.22mg/mL，通过微量蛋白打印仪GeSim Nano-Plotter TM 2.1打印到蛋白芯片基片上，每个点重复4次打印，最终获得直径约400微米的圆形斑点，室温孵育12h即制得CD63抗体芯片。

分别在第0月、第1月、第4月、第7月、第10月、第12月取出保存的外泌体，使用制得的CD63抗体芯片检测外泌体CD63蛋白免疫活性，具体步骤为：将保存的外泌体取出恢复到室温，每孔加入100微升外泌体，摇动40分钟。芯片用PBST洗涤三次，随后加入100微升荧光素标记的羊抗人CD63多克隆抗体(4nmol/L)，摇动40分钟，后依次用PBST洗涤三次、纯水清洗一次，晾干。

用生物芯片阅读仪扫描芯片，扫描后获得16位灰度图像。用MidaScan Software软件分析该图像。每个点的荧光强度通过所选区域总荧光强度除以面积获得。图像上平行的4个点的平均荧光强度被定义为测试的荧光强度。CD63蛋白活性与所获图像上的荧光强度正相关。外泌体CD63蛋白的检测结果如图1、表1所示。

表1不同保存时间外泌体CD63蛋白检测荧光强度

由表1和图1可以看出，外泌体在保存液中保存10天后，仍具有较高的活性。

实验例2

(1)外泌体的分离纯化、外泌体保存液的制备、外泌体保存方法与实施例1相同；

(2)-20℃保存的外泌体内含物稳定性检测。

利用等温扩增法检测外泌体内含物GAPDH基因的稳定性，具体步骤为：将外泌体置于95℃加热10min，使外泌体膜破裂，释放出内含物。向PCR管中加入0.8μL 10×Thermo PolReaction Buffer，0.5μL 1μmol/L B3 primer，0.3μL 20μmol/L FIP和BIP引物，2μL 5mol/L甜菜碱，0.8μL 2.5mmol/L dNTPs，1μL500μmol/L钙黄绿素，0.2μL 10mmol/L氯化锰，4UBst DNA polymerase large fragment和2μL内含物，用纯化水补足到20μL。混匀后立刻放到恒温荧光检测仪中，60℃进行LAMP反应，同时每隔1分钟监测一次实时荧光强度信号。仪器自动生成时间-荧光值曲线，荧光值开始进入指数增长期所对应的时间(起峰时间)与内含物中GAPDH基因浓度呈正相关关系，扩增结果如图2所示，扩增曲线如图3所示，不同保存时间的外泌体GAPDH基因检测起峰时间如表2所示。

表2不同保存时间外泌体GAPDH基因检测起峰时间

由表2和图2-3的结果表明-20℃保存的外泌体，内含物GAPDH基因浓度在0-12个月内基本保持不变，说明本发明的外泌体保存液能长期保持外泌体内含物稳定性。

实验例3

本实验例利用实验例1的方法，使用实施例1和对比例1外泌体保存液进行外泌体进行保存与检测，实施例1与对比例1的区别在于，外泌体保存液的成分不同，其成分如表3所示。荧光检测结果如表4、图4所示。

表3外泌体保存液成分

表4不同保存时间CD63蛋白检测荧光强度

由表4和图4可以看出，相较于实施例1，外泌体在对比例1的保存液中-20℃保存1月后，CD63荧光强度显著下降，外泌体的生物活性显著降低。

实验例4

本实验例利用实验例1的方法，使用实施例1与对比例2的外泌体保存液进行外泌体保存与检测，实施例1与对比例2的区别在于，对比例2的牛血清白蛋白的浓度为15g/L。

结果表明：由于牛血清白蛋白的浓度过高，保存液在90℃加热20min后，保存液完全凝固，无法保存外泌体。

实验例5

本实验例利用实验例1的方法，使用实施例1与对比例3的外泌体保存液进行外泌体保存与检测，实施例1与对比例3的区别在于，对比例3的海藻糖的浓度为60g/L。

结果表明：由于海藻糖浓度过高，直接影响了外泌体的免疫检测，导致初始荧光值极低，为145.35。

实验例6

本实验例利用实验例1的方法，使用实施例1与对比例4的外泌体保存液进行外泌体保存与检测，实施例1与对比例4的区别在于，对比例4甘油的浓度为20％。不同保存时间CD63蛋白荧光强度检测结果如表5、图5所示。

表5不同保存时间CD63蛋白荧光强度

由表5和图5可知，对比例4的甘油浓度过低，导致对比例4的外泌体保存液在-20℃下保存外泌体时，液体结冰，每次检测时需要冻融，极大地破坏了外泌体的活性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种外泌体的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将外泌体保存液加热，制备成胶体溶液；

（2）将外泌体置于步骤（1）所述的胶体溶液中；

所述外泌体保存液包括牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液；所述二甲基亚砜的浓度为5%~10%（v/v）；所述牛血清白蛋白的浓度为1~10g/L；

步骤（1）中，所述加热的温度为85℃~95℃，所述加热的时间为10~30min。

2.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述海藻糖的浓度为10~50g/L。

3.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述甘油的浓度为30%~50%（v/v）。

4.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01~0.02mol/L。

5.如权利要求1-4任一所述的保存方法，其特征在于，所述外泌体保存液的pH值为7.0~7.5。

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