CN106215171A - 一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该间充质干细胞注射液包括间充质干细胞、羟乙基淀粉、人血白蛋白、维生素C、人参皂苷和溶媒。本发明提供的间充质干细胞注射液能有效的维持干细胞的活力，能够提高纹状体多巴胺含量，可有效治疗帕金森病。

Description

一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，也称帕金森氏病，是一种常见的以纹状体多巴胺能神经元功能进行性丧失为特征的神经系统变性疾病。1817年英国医生JamesParkinson首先对此病进行了详细的描述，其临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍，同时患者可伴有抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动症状。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7％。大部分帕金森病患者为散发病例，仅有不到10％的患者有家族史。帕金森病确切的病因至今未明确，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。其突出的病理改变是中脑黑质多巴胺(DA)神经元变性、缺失导致纹状体内多巴胺水平下降以及黑质残存神经元胞质内出现嗜酸性包涵体，即路易小体(Lewy body)。出现临床症状时，黑质多巴胺能神经元死亡至少在50％以上，纹状体DA含量减少在80％以上。除多巴胺能系统外，帕金森病患者的非多巴胺能系统也有明显的受损，如Meynert基底核的胆碱能神经元，蓝斑的去甲肾上腺素能神经元，脑干中缝核的5-羟色胺能神经元，以及大脑皮质、脑干、脊髓以及外周自主神经系统的神经元。大量临床及动物实验研究发现，基底神经节中出现的异常β波还与PD的肌张力密切相关。
目前治疗PD主要是采用药物治疗，但化学药物具有一定的副作用，随着生物技术的发展，干细胞在治疗各种疾病模型中的研究愈来愈多，由于它具有自我更新并可分化成多种类型的细胞，有着广泛的应用前景，因此也被作为治疗神经退行性疾病的主要研究对象。观察帕金森病动物模型的行为成为帕金森病动物模型和药物验证的重要手段。目前主要是采用骨髓间充质干细胞进行治疗的研究，但骨髓采集会给患者带来身体上的痛苦。脐带间充质干细胞等干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、残留低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备且成本低等特征，以上生物学特性使其有可能成为用于组织修复、抑制免疫排斥反应的发生和代谢性疾病细胞治疗最具临床应用前景的多能干细胞。因此，提供一种能够有效治疗帕金森病的干细胞制剂具有重要的医学价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。该间充质干细胞注射液能有效的维持干细胞的活力，能够提高纹状体多巴胺含量，可有效治疗帕金森病。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种间充质干细胞注射液，包括间充质干细胞、羟乙基淀粉、人血白蛋白、维生素C、人参皂苷和溶媒。
在本发明中，羟乙基淀粉为临床血液容量扩充剂，具有较好的细胞保护作用；人血白蛋白为临床注射级成分，可为细胞提供营养；维生素C可维持过氧化物酶的活性，可保存细胞的活性；溶媒可保持细胞的渗透压，利于细胞的保持活性。本发明将几种物质组合使用后可以更好地维持间充质干细胞的活力，从而具有更好的疗效。
作为优选，每100mL间充质干细胞注射液中包括：
间充质干细胞：(0.5～l)×108个；
羟乙基淀粉：1～10g；
人血白蛋白：1～5g；
维生素C：0.3～0.7g；
人参皂苷：2～10g；
溶媒：补足。
优选地，每100mL间充质干细胞注射液中包括：
间充质干细胞：1×108个；
羟乙基淀粉：1～10g；
人血白蛋白：1～5g；
维生素C：0.3～0.7g；
人参皂苷：2～10g；
溶媒：补足。
在本发明提供的实施例中，每100mL间充质干细胞注射液中包括：
间充质干细胞：1×108个；
羟乙基淀粉：5g；
人血白蛋白：3g；
维生素C：0.5g；
人参皂苷：6g；
溶媒：补足。
在本发明提供的另一实施例中，每100mL间充质干细胞注射液中包括：
间充质干细胞：1×108个；
羟乙基淀粉：1g；
人血白蛋白：1g；
维生素C：0.3g；
人参皂苷：2g；
溶媒：补足。
在本发明提供的另一实施例中，每100mL间充质干细胞注射液中包括：
间充质干细胞：1×108个；
羟乙基淀粉：10g；
人血白蛋白：5g；
维生素C：0.7g；
人参皂苷：10g；
溶媒：补足。
作为优选，间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
作为优选，脐带间充质干细胞为第2～5代脐带间充质干细胞。
在本发明提供的实施例中，脐带间充质干细胞为第4代脐带间充质干细胞。
作为优选，溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。临床输注以复方电解质注射液为最佳。
作为优选，复方电解质注射液为勃脉力A复方电解质注射液。
在本发明提供的实施例中，生理盐水为0.9％氯化钠注射液。
作为优选，羟乙基淀粉为羟乙基淀粉130/0.4。羟乙基淀粉130/0.4为分子量为13万道尔顿、羟乙基化比例为40％(取代度为0.4)的羟乙基淀粉。
本发明还提供了该间充质干细胞注射液在制备提高纹状体多巴胺含量的药物或治疗帕金森病的药物中的应用。
本发明还提供了该间充质干细胞注射液的制备方法，包括：将羟乙基淀粉、人血白蛋白、维生素C、人参皂苷和溶媒混匀，过滤除菌，得到混合液；
采用混合液重悬间充质干细胞，得到间充质干细胞注射液。
作为优选，过滤除菌采用除菌级亲水性过滤器过滤除菌。
作为优选，除菌级亲水性过滤器的孔径为0.1～1μm。
本发明提供了一种间充质干细胞注射液及其制备方法。该间充质干细胞注射液包括间充质干细胞、羟乙基淀粉、人血白蛋白、维生素C、人参皂苷和溶媒。本发明具有如下有益效果：
1、本发明采用脐带间充质干细胞制备干细胞注射液，取材方便，不违反伦理问题；
2、本发明制备的间充质干细胞注射液能有效的维持干细胞的活力，在4℃条件下放置24h后活率依然能够达到90％以上，使用方便；
3、本发明的间充质干细胞注射液能够提高纹状体多巴胺含量，可有效治疗帕金森病。
附图说明
图1示脐带间充质干细胞的鉴定结果；其中A示P2代细胞培养72h后在显微镜下放大40倍的图片；B示P2代细胞培养72h后在显微镜下放大100倍的图片；C示P4代细胞培养72h后在显微镜下放大40倍的图片；D示P4代细胞培养72h后在显微镜下放大100倍的图片；
图2示脐带间充质干细胞的染色鉴定结果；2-1示P2代脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大40倍的图片；2-2示P2代脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大100倍的图片；2-3示P5代脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大40倍的图片；2-4示P5代脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞后在显微镜下放大100倍的图片；2-5示P2代脐带间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞后在显微镜下放大100倍的图片；2-6示P5代脐带间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞后在显微镜下放大100倍的图片。
具体实施方式
本发明公开了一种间充质干细胞注射液及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多功能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。
本发明提供的间充质干细胞注射液及其制备方法和应用中所用生物材料、试剂或仪器均可由市场购得。人参皂苷购买于成都曼思特生物科技有限公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 脐间充质干细胞的制备
在无菌条件下，取离开母体时间不超过2h的新鲜脐带，并筛查产妇是否携带传染性疾病病原体(乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病抗体阴性)，将新鲜脐带置于含有双抗的PBS中于4℃保温箱中运回实验室。
将新鲜脐带用无菌的PBS清洗，再用75％乙醇消毒，然后用PBS清洗干净，前后清洗消毒所用溶液体积均为能将脐带浸泡在其中为宜，去除脐带最外层膜及静、动脉后，将脐带剪碎至1-3cm3大小的块，将其以0.5-1cm的间距均匀接种于培养皿中，缓慢加入50μL-100μL/cm2完全培养基，置于37℃、CO2浓度为5％的培养箱中静止培养。
细胞贴壁融合达80％以上后，用胰酶进行消化收集至离心管中，1500rpm离心5min，分装至多个培养皿中进行传代培养，传至2-5代后，观察细胞生长状态，用胰酶消化后使用PBS缓冲溶液洗涤，1500rpm离心收集。
将上述制备的2-5代脐带间充质干细胞进行鉴定，包括：显微镜观察、流式检测和染色观察。鉴定方法参照“国际细胞治疗协会(ISCT)”所定制的标准。
1)显微镜观察结果
显微镜观察的结果见图1。由图1可以看出72h后的细胞已经形成较典型的脐带间充质样，并有明显的贴壁现象。
2)流式检测
将P5代脐带间充质干细胞进行流式细胞仪检测，结果见表1。由表1可知，本实施例获得的间充质干细胞可表达CD105、CD73、CD90和HLA-ABC(表达量高于95％)，不表达CD34、CD45和HLA-DR等(表达量低于1％)。
表1 脐带间充质干细胞的流式检测结果
标记抗体 阳性比率(％) 标记抗体 阳性比率(％)
CD34 0 CD105 97.51
CD90 99.48 HLA-ABC 99.10
CD45 0.13 HLA-DR 0.21
CD73 99.27 / /
3)染色观察
将P2和P5代脐带间充质干细胞进行体外诱导分化为成软脂肪细胞和成骨细胞，染色观察，结果见图2。由图2可见，本发明制备的脐带间充质干细胞经过适宜条件可向成脂肪细胞和成骨细胞分化，证明本发明制备的脐带间充质干细胞具有多向分化能力。
结论：
上述试验结果可以证明本发明所制备的细胞具备间充质干细胞的特性。
实施例2 脐带间充质干细胞注射液的制备
配制100mL干细胞注射液的方法：将羟乙基淀粉130/0.4 5g(质量体积比终浓度为5％)、白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液15mL(质量体积比终浓度为3％)、维生素C 0.5g(质量体积比终浓度为0.5％)、人参皂苷6g(质量体积比终浓度为6％)和0.9％氯化钠注射液66.5mL混匀，用孔径为0.1-1μm的除菌级亲水性过滤器过滤除菌；将P3代脐带间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
实施例3 脐带间充质干细胞注射液的制备
配制100mL干细胞注射液的方法：将羟乙基淀粉130/0.4 1g(质量体积比终浓度为1％)、白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液5mL(质量体积比终浓度为1％)、维生素C 0.3g(质量体积比终浓度为0.3％)、人参皂苷2g(质量体积比终浓度为2％)和0.9％氯化钠注射液86.7mL混匀，用孔径为0.1-1μm的除菌级亲水性过滤器过滤除菌；将P4代脐带间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
实施例4 脐带间充质干细胞注射液的制备
配制100mL干细胞注射液的方法：将羟乙基淀粉130/0.4 10g(质量体积比终浓度为10％)、白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液25mL(质量体积比终浓度为5％)、维生素C0.7g(质量体积比终浓度为0.7％)、人参皂苷10g(质量体积比终浓度为20％)和0.9％氯化钠注射液44.3mL混匀，用孔径为0.1-1μm的除菌级亲水性过滤器过滤除菌；将P5代脐带间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
实施例5 脐带间充质干细胞注射液的常规检测
上述实施例2-4制备的脐带间充质干细胞注射液均留样进行内毒素检测、细菌真菌检测、支原体检测，检测结果均为阴性为合格。
实施例6 脐带间充质干细胞注射液的功能鉴定
(1)试验分组：
试验组1：实施例2制备的脐带间充质干细胞注射液；
试验组2：实施例3制备的脐带间充质干细胞注射液；
试验组3：实施例4制备的脐带间充质干细胞注射液；
对照组1：对照组1采用注射剂与实施例2基本相同，只是不添加人参皂苷，具体为：将羟乙基淀粉130/0.4 10g(质量体积比终浓度为10％)、白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液30mL(质量体积比终浓度为6％)、维生素C 1g(质量体积比终浓度为1％)和0.9％氯化钠注射液70mL混匀，将脐带间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
对照组2：对照组2采用注射剂与实施例2相同，只是不添加人参皂苷和人血白蛋白原液，具体为：将羟乙基淀粉130/0.4 10g(质量体积比终浓度为10％)、维生素C 1g(质量体积比终浓度为1％)和0.9％氯化钠注射液100mL混匀，将脐带间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
对照组3：对照组3注射剂中只添加人参皂苷；具体为：将人参皂苷12g(质量体积比终浓度为12％)和0.9％氯化钠注射液100mL混匀，将脐带间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
对照组4：对照组4注射剂中只添加人参皂苷和人血白蛋白；具体为：将白蛋白浓度为20％的人血白蛋白原液30mL(质量体积比终浓度为6％)、人参皂苷12g(质量体积比终浓度为12％)和0.9％氯化钠注射液70mL混匀，将脐带间充质干细胞(细胞终浓度l×106个/mL)于混合液中重悬混匀，制备完毕。
(2)试验方法
分别取少量4℃冰箱放置0h、4h、8h、12h、24h实施例2-4的脐带间充质干细胞注射液和对照组1-4制备的间充质干细胞悬液进行台盼蓝染色计数，计算细胞活率，结果如表2、3所示：
表2 各试验组细胞活率检测结果
表3 各对照组细胞活率检测结果
计数时间点 对照组1 对照组2 对照组3 对照组4
0h 98.2％±0.2％ 98.2％±0.2％ 98.2％±0.2％ 98.2％±0.2％
4h 95.2％±0.5％ 92.5％±0.3％ 96.5％±0.3％ 95.5％±0.3％
8h 91.1％±0.2％ 87.1％±0.3％ 93.8％±0.1％ 90.7％±0.2％
12h 87.3％±0.4％ 84.2％±0.1％ 90.0％±0.4％ 90.2％±0.4％
24h 83.1％±0.2％ 78.1％±0.5％ 87.2％±0.2％ 86.1％±0.1％
从表2、3可以看出，本发明的脐带间充质干细胞注射液放置经过24h后，其活力依旧较高，并且达到国家要求的一般细胞治疗活率大于等于85％，并且细胞活率经过24h后活率均显著高于对照组1～对照组4。
实施例6 脐带间充质干细胞注射液对治疗小鼠帕金森病的实验效果
(一)PD模型的鉴定：
购买30只PD模型大鼠，模型建立后1周开始，用0.5mg/kg阿扑吗啡腹腔注射诱导其向健侧旋转，记录大鼠旋转次数，每次测定持续40分钟，每周1次，凡旋转次数超过7次/min以上，即为成功模型。购买PD模型均为成功模型。
(二)MSCs的治疗：
将30只PD模型大鼠随机分为3组，每组10只，分别为A、B、C三组：
A组：为空白对照；
B组：为生理盐水组；
C组：本发明实施例2脐带间充质干细胞制剂移植组；
用CM-Dil标记细胞：将本发明的干细胞制剂组合物取1mL细胞悬液，加入5ul CM-Dil荧光染料，37℃避光孵育5min，然后4℃避光孵育15min，用生理盐水洗涤两次，置于荧光显微镜下观察。
PD模型大鼠用10％水合氯醛(0.2mL/100g)腹腔注射麻醉，常规消毒，固定于脑立体定位仪上，保持前后水平，移植注射部位与造模注射部位一致。移植细胞数量为：A组空白对照，即不做任何处理、B组注射10μL等体积生理盐水、C组原位移植MSCs，将上述标记CM-Dil的细胞用本发明中实施例2的溶剂重悬至10μL，即细胞量为1×106个。3组均缝合切口，每日正常喂养清洁。治疗效果的检测方法通常采用行为学观察、免疫组化检测，具体试验方法如下：
(1)行为学观察
1)移植MSCs后，各组PD大鼠每周定时腹腔注射阿扑吗啡(0.5mg/kg)诱导PD样症状，约10min待大鼠旋转稳定后，摄像记录5min内大鼠旋转次数，连续诱导，观察4周。
2)第2周，C组(MSCs移植组)于移植2周后，PD大鼠的旋转次数开始减少，连续移植后第4周，旋转次数明显少于A组(空白对照组)(P＜0.05)，PD大鼠的旋转行为得到较为显著的改善。B组于移植后第2周开始直到第8周(观察期末)旋转次数与对照组无明显变化。
3)PD大鼠细胞移植后其旋转圈数由移植前的10～12圈/min降至4～5圈/min。
(2)免疫组化检测TH的表达
1)灌注固定对照组及细胞移植组PD大鼠后，取脑组织制备冰冻切片做TH免疫组织化学染色，观察大鼠脑黑质多巴胺细胞的损毁情况；并在荧光显微镜下观察CM-Dil标记的移植细胞在脑内的存活和生长情况。
2)TH免疫免疫组织化学结果：对照组PD大鼠损毁侧黑质的TH免疫阳性细胞较少，细胞移植术后4周，可以看到损毁侧黑质散在的TH免疫阳性细胞，胞体呈现椭圆形或椎体状。
3)ELISA检测PD大鼠脑纹状体多巴胺含量，细胞移植后4w，TLISA法检测各组大鼠大脑纹状体多巴胺含量，含量如表4所示：
表4 各组大鼠脑纹状体多巴胺含量
由以上表4可以看出，C组经过细胞移植4周后PD大鼠的纹状体多巴胺含量明显高于其他两组。可见，本发明的脐带间充质干细胞组合物能有效治疗帕金森病。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞注射液，其特征在于，包括间充质干细胞、羟乙基淀粉、人血白蛋白、维生素C、人参皂苷和溶媒。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，每100mL间充质干细胞注射液中包括：
间充质干细胞：(0.5～l)×108个；
羟乙基淀粉：1～10g；
人血白蛋白：1～5g；
维生素C：0.3～0.7g；
人参皂苷：2～10g；
溶媒：补足。
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。
5.根据权利要求4所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述复方电解质注射液为勃脉力A复方电解质注射液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述羟乙基淀粉为羟乙基淀粉130/0.4。
7.如权利要求1至6中任一项所述间充质干细胞注射液在制备提高纹状体多巴胺含量的药物或治疗帕金森病的药物中的应用。
8.如权利要求1至6中任一项所述间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，包括：将羟乙基淀粉、人血白蛋白、维生素C、人参皂苷和溶媒混匀，过滤除菌，得到混合液；
采用所述混合液重悬间充质干细胞，得到间充质干细胞注射液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述过滤除菌采用除菌级亲水性过滤器过滤除菌。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述除菌级亲水性过滤器的孔径为0.1～1μm。
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