JP2023052704A - がんを殺傷する細胞 - Google Patents

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Abstract

【課題】 本発明は、がんを処置するのに好適な細胞に基づく療法に関する。【解決手段】 本発明は、がん細胞を殺傷する能力を特徴とする顆粒球を形成するように分化する造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの培養物に関する。本発明はまた、前記顆粒球、前記造血細胞および顆粒球を同定するための方法、それを含む組成物およびキット、ならびにがんを処置するためのその使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、がんを処置するのに好適な細胞に基づく療法に関する。
がんは、世界の罹患および死亡の主因であり、先進国におけるがんの発生率は年々増大している。世界保健機関は、２０１２年だけで、約１４００万人の新しいがん症例（８２０万人の関連死）があり、次の２０年にわたって２２００万人の症例に上昇すると推定されると述べた。現在の治療戦略は、外科手術、放射線および細胞傷害性化学療法の組合せを含むが、これらの処置の多くは最終的には無効であり、有害な副作用と関連する。
安全性および効能が、腎細胞癌などのある特定のがんを処置するための治療技術としての造血幹細胞移植（HSCT）について評価されている。しかしながら、この処置は、潜在的に致命的な安全性の問題のため、依然として主に実験的なものとして見られており、レシピエントは多能性幹細胞の制御できない複製の結果として、移植片対宿主疾患（GVHD）を示す。かくして、改善された代替的ながん療法が必要である。
がんの発生率の増大にもかかわらず、約５０～６０％の個体はその生涯においてがんを発症しないことが観察されている。実際、稀な症例では、一部の個体は自然発生的ながんの退縮を示す。この観察は、自然発生的な退縮個体に由来する白血球の研究、および白血球輸注療法（LIFT）における前記白血球の使用をもたらした。
従来のＬＩＦＴは、ドナーから採取した顆粒球（例えば、好中球）のがん患者への直接移入のためにアフェレーシスを使用して行われる。現在の手法は、信頼できるがん治療としての使用にとって実用的または拡張可能ではない。第１に、好中球などの顆粒球は、非常に限られた保存可能期間（典型的には、２４時間未満）を有し、その保存を困難にしている。第２に、アフェレーシスには、必要な細胞容量を獲得するために約５人の（非常に稀である）ドナーが必要である。第３に、反復曝露に由来する免疫応答を回避するために、同じドナーをその後の投与において使用することができず、かくして、適切なドナーのプールの増加を必要とする。第４に、ドナーが、要求に応じて利用可能であるか、またはＬＩＦＴ手順のために顆粒球の終わりなき供給源を提供することをいとわないことを現実的に期待することはできない。第５に、ドナー由来顆粒球のがん殺傷効能は、時間と共に変化し、一貫性のない治療結果をもたらす。
まだ今のところ、従来のＬＩＦＴに対する実行可能な代替手段は提供されておらず、関連する問題に対する解決法も提供されていない。かくして、従来のＬＩＦＴは、拡張可能で、安全で、信頼できる治療技術として実行可能ではない。
本発明は、上記の問題のうちの少なくとも１つに対する解決法を提供する。
本発明者らは驚くべきことに、がん細胞を殺傷する能力を有する顆粒球に分化することができる造血細胞を選択することができることを見出した。そのような造血細胞がドナーから選択されたら、この細胞を、後に治療する目的で保存するか、または例えば、がんの処置において薬剤として直接使用することができる。有利なことに、本発明の方法によって取得可能な造血細胞を不死化し、かくして、保存する、および／または無限に増殖することができる安定な細胞株を提供することができる。かくして、本発明は、複数の稀なドナー、および／またはドナーから収集された顆粒球のがん患者への直接移入の必要性を低減させる。かくして、本発明は、実行可能な、拡張可能な、安全な、および／または信頼できる療法を提供する。
初めて、本発明者らは、顆粒球（例えば、好中球）のがん殺傷効能が、エピジェネティックに定義されるよりはむしろ、遺伝的に定義されることを示した。これは、ドナーから単離された造血細胞（例えば、造血幹細胞）に由来する顆粒球が、同じドナーから直接単離された成熟顆粒球と類似するがん殺傷効能を有することを示す実施例１９で示される。
有利なことに、高いがん殺傷活性を示す顆粒球を有することが見出されたドナーを、同様に高いがん殺傷活性を示す顆粒球に分化することができる造血細胞（例えば、造血幹細胞）の供給源として使用することができる。
有利なことに、そのような造血細胞を保存し、がんの処置における使用のための大量の顆粒球の生産に使用し、かくして、ドナーから十分な量の新鮮な顆粒球を単離する問題を克服することができる。
さらに、造血細胞由来顆粒球は、ドナーから単離された顆粒球よりも迅速にがん細胞を殺傷することが見出された。さらに、造血細胞由来顆粒球は、新鮮なドナー由来顆粒球よりも良好ながん殺傷効能（例えば、膵がん細胞に対する）を有し得る。
膵がんは、処置が最も難しいがんの１つであることが公知である。しかしながら驚くべきことに、本発明者らは、顆粒球、および膵臓細胞に対する特定の効能を有する顆粒球に分化する造血細胞の単離に成功した。
一態様では、本発明は、
ａ．少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（または少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、例えば、少なくとも１．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、１．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、または１．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される表面電位；および
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を特徴とする顆粒球を形成するように分化する造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物を提供する。
関連する態様では、本発明は、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球の表面電位を測定すること；および
ｂ．測定された表面電位が、少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（または少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、例えば、少なくとも１．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、１．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、または１．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される場合、前記ドナーから造血細胞を選択すること
を含む方法を提供する。
本明細書で使用される用語「取得可能」は、用語「取得された」も包含する。
本発明は、造血細胞の表面電位を測定すること；およびがんを処置するのに好適である顆粒球に分化させることができる造血細胞を選択することを含む、造血細胞を選択するための方法を提供する。かくして、一態様では、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．造血細胞の表面電位を測定すること；および
ｂ．２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満（または１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満）の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する、および／またはがん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞よりも高い（例えば、正の）表面電位を有する造血細胞を選択すること
を含む方法が提供される。
関連する態様は、がんを処置するのに好適である顆粒球に分化させることができる細胞を選択するための、造血細胞の表面電位の使用であって、２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満（または１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満）の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する、および／またはがん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞の表面電位よりも表面電位が高い（例えば、正の）、使用を提供する。
本発明は、処置のための対象（例えば、本明細書に記載の薬剤から利益を得る対象）を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．前記対象に由来する顆粒球と、がん細胞株とを混合すること；
ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
ｃ．前記混合物中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること；および
ｄ．対象に由来する顆粒球が混合物中の５％未満のがん細胞を殺傷する場合（好適には、前記対象に由来する顆粒球が混合物中の６０％未満、好ましくは、８０％または９０％未満のがん細胞を殺傷する場合）、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または顆粒球、または顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または本発明の医薬組成物を用いた処置のために前記対象を選択すること
を含む方法を提供する。
一部の実施形態では、対象に由来する顆粒球が混合物中の２０％または１０％未満のがん細胞を殺傷する場合、前記対象は、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または顆粒球、または顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または本発明の医薬組成物を用いた処置のために選択される。好ましくは、対象に由来する顆粒球が混合物中の５％または１％未満のがん細胞を殺傷する場合、前記対象は、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または顆粒球、または顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または本発明の医薬組成物を用いた処置のために選択される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法を使用して、がん細胞を殺傷する対象の顆粒球の能力をモニタリングすることもできる。
一態様では、本発明は、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を取得するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．がん細胞株と、ドナーから取得可能な顆粒球とを接触させて、試験試料を形成し、前記試験試料をインキュベートすること；および
ｂ．試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が、同じ型のがん細胞株および異なるドナーから取得可能な顆粒球を含む対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも高い場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること
を含む方法を提供する。
対照試料中で殺傷されたがん細胞の％を、本発明の方法を実行する前に、または本発明の方法を実行すると同時に（好ましくは、同時に）決定することができる。
例えば、一実施形態では、前記方法は、
ａ．がん細胞株と、第１のドナーから取得可能な顆粒球とを接触させて、試験試料を形成すること；
ｂ．同じ型のがん細胞株と、異なるドナーから取得可能な顆粒球（例えば、対照顆粒球）とを接触させて、対照試料を形成すること；
ｃ．前記試料をインキュベートすること；および
ｄ．試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも高い場合、前記第１のドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること
を含む。
一部の実施形態では、方法は、さらなるドナー（例えば、第２、第３、第４のドナーなど）に由来する顆粒球を含む複数の異なる試験試料の使用を含んでもよい。
言及される対照試料は、がん細胞を殺傷しない顆粒球（例えば、本明細書に記載の方法において少なくとも５％のがん細胞を殺傷しない顆粒球）を有するドナーに由来する試料であってもよい。他の実施形態では、言及される対照試料は、がん細胞を殺傷する顆粒球（例えば、本明細書に記載の方法において少なくとも５％のがん細胞を殺傷する顆粒球）を有するドナーに由来する試料であってもよく、その場合、前記方法を使用して、最適ながん殺傷活性を示す顆粒球を有するドナーを検出することができる。一実施形態では、対照試料は、本明細書に記載の方法において最大で５０％、４０％、３０％、２０％または１０％のがん細胞を殺傷する顆粒球を含む。好ましくは、対照試料は、本明細書に記載の方法において最大で５％のがん細胞を殺傷する顆粒球を含む。
好ましくは、造血細胞は、試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも少なくとも５％高い場合に取得される。一部の実施形態では、試験試料中で殺傷されたがん細胞の％は、対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％高い。より好ましくは、試験試料中で殺傷されたがん細胞の％は、対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも少なくとも３５％高い。
一実施形態では、方法は、５：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が、対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％高い場合に取得される。より好ましくは、方法は、５：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも少なくとも３０％高い場合に取得される。
一実施形態では、方法は、１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が、対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％高い場合に取得される。より好ましくは、方法は、１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも少なくとも２０％高い場合に取得される。
一態様では、本発明は、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を取得するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球と、がん細胞株とを混合して、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
ｃ．前記試験試料中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること；および
ｄ．前記顆粒球が試験試料中の少なくとも５％のがん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から造血細胞を取得すること
を含む方法を提供する。
顆粒球が混合物中の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％のがん細胞を殺傷する場合、造血細胞を、前記ドナー由来試料から取得することができる。
一実施形態では、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも６０％のがん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。
一実施形態では、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも７０％のがん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。
好ましくは、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも８０％または９０％のがん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。
一実施形態では、方法は、５：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも３０％のがん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。好ましくは、方法は、５：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも４０％のがん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。
一実施形態では、方法は、１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも４５％、５０％または６０％（好ましくは、少なくとも６０％）のがん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。より好ましくは、方法は、１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも８０％のがん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。
一部の実施形態では、がん細胞株は、子宮頸がん細胞株（例えば、HeLa）である。
一実施形態では、方法は、５：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも３０％の子宮頸がん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。好ましくは、方法は、５：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも４０％の子宮頸がん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。
一実施形態では、方法は、１０：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも４５％、５０％または６０％（好ましくは、少なくとも６０％）の子宮頸がん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。より好ましくは、方法は、１０：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも８０％の子宮頸がん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。
一部の実施形態では、がん細胞株は、膵がん細胞株（例えば、PANC-1）である。
一実施形態では、方法は、５：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも５０％または６０％の膵がん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。好ましくは、方法は、５：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも６５％または７０％の膵がん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。
一実施形態では、方法は、１０：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも７０％の膵がん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。好ましくは、方法は、１０：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、顆粒球が混合物中の少なくとも８０％または９０％の膵がん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から取得される。
一態様では、がん細胞を選択的に殺傷する顆粒球を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．がん細胞株と、ドナーから取得可能な顆粒球とを接触させて、試験試料を形成し、前記試験試料をインキュベートすること；および
ｂ．試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が、非がん細胞株および同じドナーから取得可能な顆粒球を含む対照試料中で殺傷された非がん細胞の％よりも高い場合、がん細胞について選択的であるとして前記顆粒球を選択すること
を含む方法が提供される。
この方法は、好ましくは、顆粒球が選択された場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得するさらなる工程を含む。
対照試料中で殺傷された非がん細胞の％を、本発明の方法を実行する前に、または本発明の方法を実行すると同時に（好ましくは、同時に）決定することができる。
例えば、一実施形態では、前記方法は、
ａ．がん細胞株と、ドナーから取得可能な顆粒球とを接触させて、試験試料を形成すること；
ｂ．非がん細胞株と、同じドナーから取得可能な顆粒球（例えば、対照顆粒球）とを接触させて、対照試料を形成すること；
ｃ．前記試料をインキュベートすること；および
ｄ．試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が対照試料中で殺傷された非がん細胞の％よりも高い場合、がん細胞について選択的であるとして前記顆粒球を選択すること
を含む。
一部の実施形態では、方法は、さらなるドナー（例えば、第２、第３、第４のドナーなど）に由来する顆粒球を含む複数の異なる試験試料の使用を含んでもよい。
一実施形態では、顆粒球は、試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が、試験試料中の非がん細胞の％よりも少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％または５０％高い場合、がん細胞について選択的であると考えられる。
一実施形態では、方法は、５：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも少なくとも１０％、２０％または３０％高い場合に取得される。
一実施形態では、方法は、１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含み、造血細胞は、試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも少なくとも１０％または２０％高い場合に取得される。
好ましくは、顆粒球は、本明細書に記載の方法において、３５％、２５％、１５％、１０％、５％または１％未満の非がん細胞を殺傷する。
任意の非がん細胞株を、前記方法において使用することができる。一実施形態では、非がん細胞株は、乳房上皮細胞などの上皮細胞である。好ましくは、非がん細胞株は、ＭＣＦ－１２Ｆ非がん細胞株（American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard. Manassas, VA 20110 USAから、ATCC（登録商標）CRL-10783（商標）として商業的に入手可能）である。
一実施形態では、がん細胞を選択的に殺傷する顆粒球を選択するための方法であって、
ａ．がん細胞株と、ドナーから取得可能な顆粒球とを接触させて、試験試料を形成し、前記試験試料をインキュベートすること；
ｂ．前記顆粒球を、
ｉ．試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が、同じ型のがん細胞株および異なるドナーから取得可能な顆粒球を含む第１の対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも高い場合；および
ｉｉ．試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が、非がん細胞株および（工程ａ．におけるドナーと）同じドナーから取得可能な顆粒球（例えば、対照顆粒球）を含む第２の対照試料中で殺傷された非がん細胞の％よりも高い場合
に選択すること
を含む方法が提供される。
一部の実施形態では、方法は、異なるドナーに由来する２つ以上の顆粒球（の培養物）によって殺傷された非がん細胞の％を比較し、かくして、非がん細胞の最も低い％の殺傷を示す顆粒球（およびドナー）の選択を可能にすることを含んでもよい。
一態様では、本発明は、膵がんの処置における使用にとって好適な顆粒球を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．顆粒球と、膵がん細胞株とを混合して、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
ｃ．前記混合物中で殺傷された膵がん細胞の％を測定すること；および
ｄ．混合物中の少なくとも５％の膵がん細胞を殺傷する顆粒球を選択すること
を含む方法を提供する。
膵がん細胞株は、膵管腺癌細胞株であってもよい。
顆粒球は、混合物中の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の膵がん細胞を殺傷してもよい。
一実施形態では、前記顆粒球は、混合物中の少なくとも６０％の膵がん細胞を殺傷する。
一実施形態では、前記顆粒球は、混合物中の少なくとも７０％の膵がん細胞を殺傷する。
好ましくは、前記顆粒球は、混合物中の少なくとも８０％または９０％の膵がん細胞を殺傷する。
一実施形態では、方法は、５：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含み、顆粒球は、混合物中の少なくとも５０％または６０％の膵がん細胞を殺傷する。好ましくは、方法は、５：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含み、顆粒球は、混合物中の少なくとも６５％または７０％の膵がん細胞を殺傷する。
一実施形態では、方法は、１０：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含み、顆粒球は、混合物中の少なくとも７０％の膵がん細胞を殺傷する。好ましくは、方法は、１０：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含み、顆粒球は、混合物中の少なくとも８０％または９０％の膵がん細胞を殺傷する。
一部の実施形態では、がん細胞株は、膵がん細胞株（例えば、PANC-1）である。
関連する態様は、がんの処置における使用にとって好適な顆粒球を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．顆粒球と、複数の異なるがん細胞株とを混合して、複数の混合物を提供すること；
ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
ｃ．前記混合物中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること；および
ｄ．顆粒球が混合物中の少なくとも５％のがん細胞を殺傷する場合、がん細胞株と同じ型／サブセットのがんの処置における使用にとって好適であるとして前記顆粒球を選択すること
を含む方法を提供する。
有利なことに、そのような方法は、複数のがん型／サブセットを殺傷する能力についての顆粒球の迅速なスクリーニングを可能にする。一部の実施形態では、その後、顆粒球が処置における使用にとって好適であるがんの型／サブセットに従って、顆粒球を分類する。
この文脈で使用される用語「型」は、がん細胞株と同じ臓器または組織のがんを意味する。例えば、がん細胞株が膵管腺癌細胞株である場合、混合物中の少なくとも５％の膵管腺癌細胞を殺傷する顆粒球は、全ての膵がんの処置における使用にとって好適であると考えられる。
この文脈で使用される用語「サブセット」は、がんが同じ臓器または組織のものであることだけでなく、がんががん細胞株とさらなる特徴を共有する（例えば、両方とも同じ臓器または組織の癌腫、肉腫などである）ことも意味する。例えば、がん細胞株が膵管腺癌細胞株である場合、混合物中の少なくとも７０％の膵管腺癌細胞を殺傷する顆粒球は、全ての膵管腺癌バリアントの処置における使用にとって好適であると考えられる。
前記のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、本明細書に開示される表面電位（例えば、細胞表面電荷）に基づいて顆粒球を測定および／または選択することをさらに含んでもよい。前記のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、本明細書に開示される細胞密度（例えば、少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの）に基づいて顆粒球を測定および／または選択することをさらに含んでもよい。前記のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、顆粒球上での、ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性に基づいて前記顆粒球を測定および／または選択することをさらに含んでもよい。
前記態様によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、がん殺傷活性（CKA）アッセイ（例えば、請求項６）の代表であってもよい。
本明細書で使用される用語「混合する」とは、連続的であるにしろ、同時的であるにしろ、任意の順序で１つまたは複数の成分を一緒に混合することを意味する。一実施形態では、「混合する」は、第１の成分と、第２の成分と（例えば、顆粒球と、がん細胞株と）を接触させることを意味する。
用語「複数」とは、少なくとも２を意味する。一実施形態では、「複数」は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０を意味する。「複数」は、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００を意味してもよい。一実施形態では、「複数」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０を意味する。別の実施形態では、「複数」は、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００を意味する。
一実施形態では、顆粒球は、ドナー、例えば、ヒトドナーから取得可能である。あるいは、またはさらに、顆粒球は、本発明の方法において使用されるがん細胞株と異なる型／サブセットのがんを有する対象から取得可能である。有利なことに、本発明者らは、ある型／サブセットのがんを有する対象が、異なるがん型／サブセットのがん細胞を殺傷する能力を有する顆粒球を有してもよいことを見出した。特に、対象において、対象が診断されたがんの細胞を殺傷する能力を有する顆粒球が特に低濃度である場合、これは驚くべきことである。
本発明の方法における使用のためのがん細胞株は、膵がん細胞株、肝臓がん細胞株、食道がん細胞株、胃がん細胞株、子宮頸がん細胞株、卵巣がん細胞株、肺がん細胞株、膀胱がん細胞株、腎臓がん細胞株、脳腫瘍細胞株、前立腺がん細胞株、骨髄腫のがん細胞株、非ホジキンリンパ腫（NHL）細胞株、喉頭がん細胞株、子宮がん細胞株、または乳がん細胞株から選択される１つまたは複数であってもよい。
好適な細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（U.K.）、Ｇｕｅｒｎｓｅｙ、Ｉｒｅｌａｎｄ、ＪｅｒｓｅｙおよびＬｉｅｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ、ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｑｕｅｅｎｓ Ｒｏａｄ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＴＷ１１ ０ＬＹ、ＵＫから商業的に入手可能である。例えば、膵臓細胞株は、Ｃａｐａｎ－２、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－８０；Ｐａｎｃ １０．０５、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２５４７；ＣＦＰＡＣ－１、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９１８；ＨＰＡＦ－ＩＩ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９７；ＳＷ １９９０、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２１７２；ＢｘＰＣ－３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６８７；ＡｓＰＣ－１、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６８２；ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＣＰ－１０２６（商標）；ＳＷ１９９０、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２１７２；ＳＵ．８６．８６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１８３７；ＢＸＰＣ－３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６８７；Ｐａｎｃ １０．０５、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２５４７；ＭＩＡ－ＰａＣａ－２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４２０；ＰＡＮＣ－１、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４６９；またはＡＴＣＣ（登録商標）ＴＣＰ－２０６０（商標）のうちの１つまたは複数であってもよい。
好ましくは、がん細胞株は、ＰＡＮＣ－１などの膵がん細胞株である。
一実施形態では、がん細胞株は、ＨｅＬａ細胞などの子宮頸がん細胞株である。
インキュベーション工程を、１時間～１００時間にわたって行ってもよい。好適には、インキュベーション工程を、５時間～７５時間、例えば、１０時間～２０時間にわたって行ってもよい。
インキュベーション工程を、６時間～６日間にわたって行ってもよい。好適には、インキュベーション工程を、６時間～２日間、例えば、１２時間～３６時間、例えば、１６～２４時間にわたって行ってもよい。一実施形態では、インキュベーション工程を、２４時間にわたって行う。インキュベーション工程を、細胞の増殖および生存にとって好適な任意の温度で、例えば、３５℃～４２℃、好適には、３７℃～３９℃の温度で行ってもよい。好ましくは、インキュベーション工程を、３７または３９℃で２４時間にわたって行う。好ましくは、インキュベーション工程を、３０～４０℃（例えば、３７℃）で１６～２４時間にわたって行う。
殺傷されたがん細胞の％を、出発がん細胞の総数を参照することによって測定することができる。殺傷されたがん細胞の数を、任意の好適な手段を使用して、例えば、生存性染色（例えば、トリパンブルー染色）、および顕微鏡観察によって、または他の自動化された手段を使用して、例えば、ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（11585 Sorrento Valley Rd., Suite 103, San Diego, CA 92121, USA）から入手可能なＲＴ－ＣＥＳ（商標）システムなどの細胞電気検知機器によって測定することができる。一部の実施形態では、殺傷されたがん細胞の％を、２４時間以内（例えば、がん細胞株および顆粒球のインキュベーションの）に決定することができる。殺傷されたがん細胞の％は、好ましくは、本発明の方法を実行する場合に殺傷されたがん細胞の最大数である。
殺傷されたがん細胞の数を、ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＤＰ Ａｎａｌｙｚｅｒシステム（登録商標）を使用して測定することもできる。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍは、電気インピーダンスを測定することによって連続的に細胞表現型の変化を、標識を使用せずに動的にモニタリングすることができるリアルタイム細胞分析装置である。そのような測定を、実施例１１に詳述されるように行うことができる。前記システムは、ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ６７７９ Ｍｅｓａ Ｒｉｄｇｅ Ｒｏａｄ ＃１００、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１ ＵＳＡから商業的に入手可能である。
本発明の方法は、少なくとも１：１、５：１または１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含んでもよい。好ましくは、この方法は、５：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含む。より好ましくは、この方法は、１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含む。
当業者であれば、本発明の方法が２つの試料間（例えば、「試験試料」と「対照試料」の間）の比較工程を含む場合、その条件（例えば、方法の間のアッセイ条件）が一定に保持されるべきであることを理解できる。例えば、顆粒球のがん細胞に対する濃度比は同じであるべきであり、時間条件なども同じであるべきである。比較が本明細書の２つの試料間で行われる場合、好適には、試料は等価である。例えば、比較される試料は、同じ試料型（例えば、血液）であり、同じプロセシング工程にかけてもよい。一部の実施形態では、試料間の唯一の相違は、前記試料を取得するドナーである。例えば、特定の特性を有する細胞の割合が決定される実施形態では、各試料中の細胞の総数は同じであってよく、適切な比較を行うことができる。
一実施形態では、混合物は、８ｘ１０5個の顆粒球および１．５ｘ１０4個のがん細胞、または好ましくは、８ｘ１０5個の顆粒球および８ｘ１０4個のがん細胞を含む。
一実施形態では、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも５％のがん細胞を殺傷することができる。顆粒球は、本明細書に記載の方法において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％のがん細胞を殺傷することができる。一実施形態では、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも６０％のがん細胞を殺傷することができる。一実施形態では、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも７０％のがん細胞を殺傷することができる。好ましくは、顆粒球は、本明細書に記載の方法において、少なくとも８０％または９０％のがん細胞を殺傷することができる。
方法が５：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも３０％のがん細胞を殺傷することができる。好ましくは、方法が５：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも４０％のがん細胞を殺傷することができる。方法が１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも４５％、５０％または６０％（好ましくは、少なくとも６０％）のがん細胞を殺傷することができる。より好ましくは、方法が１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも８０％のがん細胞を殺傷することができる。
一部の実施形態では、がん細胞株は、子宮頸がん細胞株（例えば、HeLa）である。方法が５：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも３０％の子宮頸がん細胞を殺傷することができる。好ましくは、方法が５：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも４０％の子宮頸がん細胞を殺傷することができる。方法が１０：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも４５％、５０％または６０％（好ましくは、少なくとも６０％）の子宮頸がん細胞を殺傷することができる。より好ましくは、方法が１０：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも８０％の子宮頸がん細胞を殺傷することができる。
一部の実施形態では、がん細胞株は、膵がん細胞株（例えば、PANC-1）である。方法が５：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも５０％または６０％の膵がん細胞を殺傷することができる。好ましくは、方法が５：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも６５％または７０％の膵がん細胞を殺傷することができる。方法が１０：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも７０％の膵がん細胞を殺傷することができる。好ましくは、方法が１０：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、本明細書に記載の方法において少なくとも８０％または９０％の膵がん細胞を殺傷することができる。
５％未満のがん細胞を殺傷する顆粒球は、好ましくは廃棄される。
好適には、顆粒球が少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％のがん細胞を殺傷する場合、その顆粒球を選択することができる。７０％未満（好適には、８０％、８５％、９０％または９５％未満）のがん細胞を殺傷する顆粒球は、好ましくは廃棄される。
一実施形態では、がんの処置における使用にとって好適な顆粒球を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、
ａ．顆粒球と、がん細胞株（好ましくは、膵がん細胞株または複数の異なるがん細胞株）とを混合して、８ｘ１０5個の顆粒球と、８ｘ１０4個のがん細胞とをそれぞれ含む混合物（または複数の混合物）を提供すること；
ｂ．前記混合物（または複数の混合物）を、３９℃で２４時間インキュベートすること；
ｃ．前記混合物（または複数の混合物）中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること；および
ｄ．顆粒球が混合物中の少なくとも５％のがん細胞を殺傷する場合、がん細胞株と同じ型／サブセットのがんの処置における使用にとって好適であるとして前記顆粒球を選択すること
を含む。
一実施形態では、前記態様によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法はまた、処置しようとする対象の顆粒球を同時にアッセイすることを含んでもよい。
本発明によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、選択された顆粒球が取得可能であるか、または取得されたドナーから造血細胞を取得することをさらに含んでもよい。かくして、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法はまた、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法を構成してもよい。
別の実施形態では、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球と、複数の異なるがん細胞株とを混合して、複数の混合物を提供すること；
ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
ｃ．前記混合物中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること；および
ｄ．顆粒球が混合物中の少なくとも５％のがん細胞を殺傷する場合、前記顆粒球によって殺傷されたがん細胞株と同じ型／サブセットのがんの処置における使用にとって好適であるとして前記ドナーに由来する造血細胞を選択すること
を含む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、本明細書に開示される表面電位に基づいて、および／または造血細胞から分化した顆粒球の表面電位に基づいて、造血細胞を測定および／または選択することをさらに含んでもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、本明細書に開示される細胞密度（例えば、少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの）に基づいて、および／または造血細胞から分化した顆粒球の細胞密度（例えば、少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの）に基づいて、造血細胞を測定および／または選択することをさらに含んでもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、造血細胞から分化した顆粒球上での、ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性に基づいて造血細胞を測定および／または選択することをさらに含んでもよい。
一態様では、本発明の方法によって取得可能な（例えば、取得された）造血細胞が提供される。
一態様では、本発明の方法によって取得可能な（例えば、取得された）顆粒球が提供される。
本発明に従って選択された造血細胞を、有利な特性を有する顆粒球（例えば、好中球）に分化させることができる。例えば、前記顆粒球は、ドナーから直接取得された顆粒球よりも迅速にがん細胞を殺傷することができる。一実施形態では、本明細書に記載の造血細胞から取得された顆粒球は、がん細胞との接触の１５時間以内に最大半量がん殺傷％を有する。好ましくは、本明細書に記載の造血細胞から取得された前記顆粒球は、がん細胞との接触の１０時間以内に最大半量がん殺傷％を有する。
好適には、そのような値は、顆粒球の、本明細書に記載の方法において使用されるがん細胞に対する比が１０：１である場合に得られる。
この文脈で使用される用語「最大半量がん殺傷％」とは、顆粒球によって殺傷され得る全がん細胞の半分を意味する。例えば、顆粒球が本明細書に記載の方法において使用される全がん細胞の５０％を殺傷する場合、最大半量がん殺傷％は、アッセイにおいて使用される全がん細胞の２５％であろう。
一部の実施形態では、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％未満のがん細胞を殺傷する顆粒球を廃棄してもよい。
本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、がんを処置するのに好適な細胞の選択を改善するために本明細書に記載の技術の組合せを含んでもよい。例えば、複数の造血細胞または顆粒球が規定された密度閾値を満たすため、それらが選択される場合、細胞表面電位／電気泳動移動度を評価して、高いＣＫＡの顆粒球（例えば、好中球）を産生する造血細胞を同定する、または改善されたＣＫＡを有する顆粒球を選択するのを助けることができる。有利なことに、そのような技術の組合せは、本発明の造血細胞または顆粒球を選択する能力を改善する。さらに、顆粒球（例えば、好中球）にそのような技術の組合せを適用することによって、改善されたＣＫＡを有する細胞を検出し、前記ドナーから造血細胞を取得することができる。
本発明はまた、本発明の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または本発明の方法に従って取得可能な造血細胞を、顆粒球に分化させることを含む分化方法も提供する。関連する態様では、そのような方法によって取得可能な（例えば、取得される）顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物が提供される。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物は、
ａ．少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（または少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、例えば、少なくとも１．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、１．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、または１．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される表面電位；および
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を有する顆粒球に関して富化されている。
一態様では、本発明は、造血細胞；および顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、増殖ホルモン；セロトニン、ビタミンＣ、ビタミンＤ、グルタミン（Gln）、アラキドン酸、ＡＧＥ－アルブミン、インターロイキン、ＴＮＦ－アルファ、Ｆｌｔ－３リガンド、トロンボポエチン、ウシ胎仔血清（FBS）、またはその組合せを含む医薬組成物を提供する。
一実施形態では、医薬組成物は、造血細胞；ならびに顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、および増殖ホルモン、およびセロトニン、およびビタミンＣ、およびビタミンＤ、およびグルタミン（Gln）、およびアラキドン酸、およびＡＧＥ－アルブミン、およびインターロイキン、およびＴＮＦ－アルファ、およびＦｌｔ－３リガンド、およびトロンボポエチン、およびウシ胎児血清（FBS）を含む。
好適には、増殖ホルモンは、ヒト成長ホルモンであってもよい。組成物中に含まれる造血細胞は、本発明の方法によって取得可能である（例えば、取得される）か、または本発明の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物の一部であってもよい。
一態様では、本発明は、顆粒球；顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、増殖ホルモン；セロトニン、ビタミンＣ、ビタミンＤ、グルタミン（Gln）、アラキドン酸、ＡＧＥ－アルブミン、インターロイキン、ＴＮＦ－アルファ（例えば、UniProt受託番号P01375）、Ｆｌｔ－３リガンド、トロンボポエチン（例えば、UniProt受託番号P40225）、ウシ胎仔血清（FBS）、またはその組合せを含む医薬組成物を提供する。組成物中に含まれる顆粒球は、本発明の方法によって取得可能である（例えば、取得される）。
一実施形態では、医薬組成物は、顆粒球；ならびに顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、および増殖ホルモン、およびセロトニン、およびビタミンＣ、およびビタミンＤ、およびグルタミン（Gln）、およびアラキドン酸、およびＡＧＥ－アルブミン、およびインターロイキン、およびＴＮＦ－アルファ、およびＦｌｔ－３リガンド、およびトロンボポエチン、およびウシ胎児血清（FBS）を含む。
インターロイキンは、インターロイキン－３（IL-3）（例えば、UniProt受託番号P08700）、インターロイキン８（IL-8）（例えば、UniProt受託番号P10145）、インターロイキン－４（IL-4）（例えば、UniProt受託番号P05112）、インターロイキン－６（IL-6）（例えば、UniProt受託番号P05231）、インターロイキン－１８（IL-18）（例えば、UniProt受託番号Q14116）、またはその組合せであってもよい。好適には、インターロイキンは、インターロイキン－３（IL-3）、インターロイキン８（IL-8）、インターロイキン－４（IL-4）、インターロイキン－６（IL-6）、およびインターロイキン－１８（IL-18）であってもよい。
一実施形態では、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、増殖ホルモン、セロトニン、ＡＧＥ－アルブミン、インターロイキン、ＴＮＦ－アルファ、Ｆｌｔ－３リガンド、またはトロンボポエチンは、ヒト顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、増殖ホルモン、セロトニン、ＡＧＥ－アルブミン、インターロイキン、ＴＮＦ－アルファ、Ｆｌｔ－３リガンド、またはトロンボポエチンであってもよい。
上記試薬は全て、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．（Suite B-310（Suite B-209、B-203も）、14 Zhong He Street、BDA、Beijing 100176、P.R.China）から商業的に入手可能である。
本発明はまた、薬剤としての使用のための、本明細書に記載の造血細胞、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、医薬組成物またはキットに関する。薬剤は、がんの処置における使用のためのものであってもよく、かくして、関連する態様では、がんの処置における使用のための、造血細胞、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、医薬組成物またはキットが提供される。本発明の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、医薬組成物またはキットを、それを必要とする対象に投与することを含む、がんを処置するための対応する方法も提供される。
別の態様では、本発明は、本発明の造血細胞、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または医薬組成物を含む細胞バンクを提供する。
さらなる態様では、
ａ．本発明の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、造血細胞、顆粒球、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または医薬組成物；および
ｂ．医学におけるその使用のための指示書
を含むキットが提供される。
本明細書で使用される用語「造血細胞」とは、顆粒球（好ましくは、好中球）に分化することができる細胞を指す。用語「造血細胞」は、かくして、造血幹細胞、ならびに顆粒球（好ましくは、好中球）に分化することができる前駆細胞（例えば、造血幹細胞から分化した）を包含する。前駆細胞は、本明細書では、「顆粒球前駆細胞」と呼ぶことができる。本発明による造血細胞は、造血幹細胞、顆粒球前駆細胞またはその組合せに関するものであってもよい。好ましくは、本明細書で使用される用語「造血細胞」は、ヒト胚性幹細胞を包含しない。一実施形態では、造血細胞は、造血経路の細胞またはそれと同等の細胞である。一実施形態では、造血細胞は、人工多能性幹細胞（iPSC）またはそれと同等の細胞である。一実施形態では、ｉＰＳＣは、ドナーの体細胞から取得可能である。ｉＰＳＣの生成は、当業界で周知の技術であり、Ｙｕら（２００７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８：１９１７－１９２０（その教示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一実施形態では、造血細胞は、核移植胚性幹細胞（NT-ESC）またはそれと同等の細胞である。一実施形態では、ＮＴ－ＥＳＣは、ドナー由来細胞の核を、元の核が除去された卵細胞に注入することによって取得可能である。ＮＴ－ＥＳＣの生成は、当業界で周知の技術であり、Ｔａｃｈｉｂａｎａ Ｍ、Ａｍａｔｏ Ｐ、Ｓｐａｒｍａｎ Ｍら（２０１３）、Ｃｅｌｌ、１５４（２）：４６５－４６６（その教示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
造血細胞がドナー由来試料から取得される一実施形態では、前記造血細胞を、前記試料から単離することができる。造血細胞がドナー由来試料から取得される別の実施形態では、前記試料は、体細胞を含む試料であり、造血細胞は、前記試料中の細胞（例えば、体細胞）の多能性を誘導して、ｉＰＳＣを得ることによって取得される。
造血細胞がドナー由来試料から取得される別の実施形態では、前記試料は、体細胞を含む試料であり、造血細胞は、前記試料中の細胞（例えば、体細胞）の核を、卵細胞（例えば、元の核が除去された）に注入して、ＮＴ－ＥＳＣを得ることによって取得される。
一実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞である。造血幹細胞を、例えば、ＣＤ３４（例えば、UniProt受託番号P28906）、ＣＤ５９（例えば、UniProt受託番号P13987）、Ｔｈｙ１（例えば、UniProt受託番号P04216）、ＣＤ３８（例えば、UniProt受託番号P28907）、Ｃ－ｋｉｔ（例えば、UniProt受託番号P10721）、およびｌｉｎから選択される細胞表面ポリペプチドマーカーに基づいて選択することができる。一実施形態では、造血幹細胞は、細胞表面ポリペプチドマーカーＣＤ３４+、ＣＤ５９+、Ｔｈｙ１+、ＣＤ３８low/-、Ｃ－ｋｉｔlow/-、およびｌｉｎ-を含む。好ましくは、造血細胞は、ＣＤ３４を発現する。前記マーカーの存在または非存在を検出するための抗体は、商業的に入手可能であり、例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒおよびＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから取得することができる。
別の実施形態では、造血細胞は、顆粒球前駆細胞である。顆粒球前駆細胞は、共通骨髄性前駆細胞、骨髄芽球、Ｎ．前骨髄球、Ｎ．骨髄球、Ｎ．後骨髄球、Ｎ．好中球桿状核球、またはその組合せから選択される１つまたは複数であってもよい。
造血細胞（造血幹細胞もしくは顆粒球前駆細胞など）または細胞培養物を、顆粒球に分化させることができる。分化を、Ｌｉｅｂｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２００４ Ｆｅｂ １；１０３（３）：８５２－９、および／またはＣｈｏｉら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１１ Ｍａｒ；６（３）：２９６－３１３、および／またはＴｉｍｍｉｎｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２００９；１０４（４）：８３２－４０（これらは参照により本明細書に組み込まれる）における開示に基づく方法などの任意の好適な方法を使用して実行することができる。
一態様では、本発明は、造血細胞と、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、増殖ホルモン；セロトニン、ビタミンＣ、ビタミンＤ、グルタミン（Gln）、アラキドン酸、ＡＧＥ－アルブミン、インターロイキン、ＴＮＦ－アルファ、Ｆｌｔ－３リガンド、トロンボポエチン、ウシ胎仔血清（FBS）、またはその組合せとを混合することを含む、前記造血細胞を分化させる方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、造血細胞と、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、および増殖ホルモン、およびセロトニン、およびビタミンＣ、およびビタミンＤ、およびグルタミン（Gln）、およびアラキドン酸、およびＡＧＥ－アルブミン、およびインターロイキン、およびＴＮＦ－アルファ、およびＦｌｔ－３リガンド、およびトロンボポエチン、およびウシ胎仔血清（FBS）とを混合することを含む、前記造血細胞を分化させる方法を提供する。
前記造血細胞は、造血細胞培養物の一部であってもよい。
一実施形態では、造血細胞の分化は、前記造血細胞を、１つまたは複数の支持細胞と共に培養することを含む。好適には、支持細胞は、ＯＰ９細胞であってもよい。ＯＰ９細胞（ATCC（登録商標）CRL-2749（商標））は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（U.K.）、Ｇｕｅｒｎｓｅｙ、Ｉｒｅｌａｎｄ、ＪｅｒｓｅｙおよびＬｉｅｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ、ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｑｕｅｅｎｓ Ｒｏａｄ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＴＷ１１ ０ＬＹ、ＵＫから商業的に入手可能である。一実施形態では、造血細胞を、１つまたは複数の支持細胞およびＦｌｔ－３リガンド、トロンボポエチン、ウシ胎仔血清（FBS）、またはその組合せと共に培養することができる。
かくして、一実施形態では、本発明の医薬組成物または細胞培養物は、ＯＰ９細胞などの支持細胞をさらに含んでもよい。
用語「顆粒球」は、以下の細胞型：好中球、好塩基球、および好酸球を包含する。好ましくは、顆粒球は、好中球である。顆粒球は、細胞表面ポリペプチドマーカーＣＤ１１ｂ（例えば、UniProt受託番号P11215）およびＣＤ１５を発現してもよい。顆粒球はまた、活性酸素種（Ｏ2 -）を産生してもよい。
本発明は、がんの処置における使用にとって好適である顆粒球を包含する。好適には、前記顆粒球は、少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（好適には、少なくとも２．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも２．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される表面電位を含む。一実施形態では、前記顆粒球は、少なくとも２．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、または少なくとも３．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を含む。好適には、前記顆粒球は、少なくとも３．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、または少なくとも３．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を含んでもよい。好ましくは、前記顆粒球は、少なくとも３．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、または少なくとも４．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を含んでもよい。顆粒球は、がん細胞を殺傷する能力も有する。
あるいは、前記顆粒球は、少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも１．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を含んでもよい。例えば、前記顆粒球は、少なくとも１．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、または少なくとも１．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を含んでもよい。顆粒球は、がん細胞を殺傷する能力も有する。
「がん細胞を殺傷する能力」を、細胞（例えば、好中球などの顆粒球）と、がん細胞とを混合すること、および前記がん細胞の生存能力を測定すること（例えば、インキュベーション後）によって決定することができる。がん細胞が最早生存可能でない場合（すなわち、殺傷されている場合）、その細胞はがん細胞を殺傷する能力を示す。一実施形態では、がん細胞を殺傷する能力は、本明細書に記載のがん殺傷活性（CKA）アッセイを使用して決定される。
一実施形態では、ＣＫＡアッセイは、
ａ．がん細胞株と、顆粒球とを接触させて、試験試料を形成すること（好ましくは、顆粒球のがん細胞に対する比は１０：１）；
ｂ．前記試験試料をインキュベートすること；および
ｃ．前記試験試料中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること
を含む。
一実施形態では、ＣＫＡアッセイは、
ａ．顆粒球と、がん細胞株とを混合して、混合物を提供すること（好ましくは、顆粒球のがん細胞に対する比は１０：１）；
ｂ．前記混合物をインキュベートすること；および
ｃ．前記混合物中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること
を含む。
好ましい実施形態では、ＣＫＡアッセイは、
ａ．顆粒球と、がん細胞株とを混合して、８ｘ１０5個の顆粒球と、８ｘ１０4個のがん細胞とを含む混合物を提供すること；
ｂ．前記混合物を、３９℃で２４時間インキュベートすること；
ｃ．前記混合物中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること
を含む。
好ましい実施形態では、ＣＫＡアッセイは、
ａ．顆粒球と、がん細胞株とを混合して、少なくとも１：１（例えば、５：１または１０：１）の顆粒球のがん細胞に対する比を含む混合物を提供すること；
ｂ．前記混合物を１６～２４時間（例えば、３０～４０℃で）インキュベートすること；
ｃ．前記混合物中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること
を含む。
一実施形態では、顆粒球は、それが本明細書に記載の方法において少なくとも５％のがん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。顆粒球は、それが少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の存在するがん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。一実施形態では、顆粒球は、それが少なくとも６０％の存在するがん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。一実施形態では、顆粒球は、それが少なくとも７０％の存在するがん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。好ましくは、顆粒球は、それが少なくとも８０％または９０％の存在するがん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。
方法が５：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、それが少なくとも３０％の存在するがん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。好ましくは、方法が５：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、それが少なくとも４０％の存在するがん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。方法が１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、それが少なくとも４５％、５０％または６０％（好ましくは、少なくとも６０％）の存在するがん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。より好ましくは、方法が１０：１の顆粒球のがん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、それが少なくとも８０％の存在するがん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。
一部の実施形態では、がん細胞株は、子宮頸がん細胞株（例えば、HeLa）である。方法が５：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、それが少なくとも３０％の存在する子宮頸がん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。好ましくは、方法が５：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、それが少なくとも４０％の存在する子宮頸がん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。方法が１０：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、それが少なくとも４５％、５０％または６０％（好ましくは、少なくとも６０％）の存在する子宮頸がん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。より好ましくは、方法が１０：１の顆粒球の子宮頸がん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、それが少なくとも８０％の存在する子宮頸がん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。
一部の実施形態では、がん細胞株は、膵がん細胞株（例えば、PANC-1）である。方法が５：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、それが少なくとも５０％または６０％の存在する膵がん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。好ましくは、方法が５：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、それが少なくとも６５％または７０％の存在する膵がん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。方法が１０：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含む実施形態では、顆粒球は、それが少なくとも７０％の存在する膵がん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。好ましくは、方法が１０：１の顆粒球の膵がん細胞に対する比の使用を含む場合、顆粒球は、それが少なくとも８０％または９０％の存在する膵がん細胞を殺傷する場合、がん細胞を殺傷すると考えることができる。
５％未満のがん細胞を殺傷する顆粒球は、好ましくは廃棄される。
前記段落は、本明細書に記載の方法のそれぞれに適用され、前記開示を、本明細書に記載の方法のいずれかと組み合わせることができる。
がん細胞を殺傷する能力を有する（「がん細胞を殺傷すると考えられる」）細胞を、本明細書におけるＣＫＡアッセイ（例えば、上記のCKAアッセイ）において少なくとも７０％または７５％のＣＫＡを有する細胞と定義することができる。好適には、前記細胞は、本明細書におけるＣＫＡアッセイ（例えば、上記のCKAアッセイ）において少なくとも８０％または９０％の活性を有してもよい。
「がん細胞を殺傷する能力」を有する（「がん細胞を殺傷すると考えられる」）細胞は、がんの処置における使用にとって好適である。「がん細胞を殺傷する能力」を有する細胞に分化させることができる造血細胞も、がんの処置における使用にとって好適であると考えられる。
一態様では、本発明は、
ａ．少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度；および
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を特徴とする顆粒球を形成するように分化する造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物を提供する。
一態様では、本発明は、
ａ．１．０７７ｇ／ｍｌより高い密度；および
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を特徴とする顆粒球を形成するように分化する造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物を提供する。
少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度を有する顆粒球は、実施例２１に記載の方法によって取得可能であってよい。一実施形態では、そのような方法は、
ｉ．１．０７７ｇ／ｍｌの密度に調整されたスクロース溶液を提供すること；
ｉｉ．顆粒球を含む組成物を添加すること；および
ｉｉｉ．高密度顆粒球（例えば、好中球）を沈降させるために遠心分離すること
を含む。
少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度を有する顆粒球は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）－１０７７キット（Sigma-Aldrichから商業的に入手可能であり、カタログ番号10771-100ML）などの商業的に入手可能なキットを使用して取得可能であってよい。
一部の実施形態では、１．０７７ｇ／ｍｌの密度を有する顆粒球は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ分離によって得られる。典型的には、そのような顆粒球は、分離後に１．０７７ Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ媒体の底に見出されるが、低密度顆粒球（例えば、1.077g/ml未満の密度を有する）は、１．０７７－血漿境界面に見出される。
かくして、本発明による（および本発明における使用のための）顆粒球は、少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度を有してもよく、１．０７７ｇ／ｍｌ未満の密度を有する顆粒球は、本発明から除外してもよい。一部の実施形態では、本発明による顆粒球は、少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度および本明細書に記載の細胞表面電位を有する。したがって、全ての細胞表面電位の実施形態が、前記顆粒球に同等に適用される。
好ましくは、顆粒球は、１．０７７ｇ／ｍｌより高い密度を有する。
一実施形態では、顆粒球は、少なくとも１．０７８ｇ／ｍｌの密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、少なくとも１．０７９ｇ／ｍｌの密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、少なくとも１．０８０ｇ／ｍｌの密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、少なくとも１．０８１ｇ／ｍｌの密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、少なくとも１．０８２ｇ／ｍｌの密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、少なくとも１．０８３ｇ／ｍｌの密度を有する。好ましくは、顆粒球は、１．０８２ｇ／ｍｌの、または１．０８２ｇ／ｍｌより高い密度を有する。
一実施形態では、顆粒球は、１．０８４ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、１．０８３ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、１．０８２ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、１．０８１ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、１．０８０ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、１．０７９ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、顆粒球は、１．０７８ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。
一実施形態では、顆粒球は、１．０７７ｇ／ｍｌ～１．０８４ｇ／ｍｌの密度（例えば、１．０７７ｇ／ｍｌより高いが、１．０８４ｇ／ｍｌ未満の密度）を有する。顆粒球は、１．０７９ｇ／ｍｌ～１．０８４ｇ／ｍｌの密度、例えば、１．０８０ｇ／ｍｌ～１．０８４ｇ／ｍｌの密度を有してもよい。顆粒球は、１．０８０ｇ／ｍｌ～１．０８３ｇ／ｍｌの密度、例えば、１．０８０ｇ／ｍｌ～１．０８２ｇ／ｍｌの密度を有してもよい。
一実施形態では、造血細胞は、少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度を有する。好ましくは、造血細胞は、１．０７７ｇ／ｍｌより高い密度を有する。
一実施形態では、造血細胞は、少なくとも１．０７８ｇ／ｍｌの密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、少なくとも１．０７９ｇ／ｍｌの密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、少なくとも１．０８０ｇ／ｍｌの密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、少なくとも１．０８１ｇ／ｍｌの密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、少なくとも１．０８２ｇ／ｍｌの密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、少なくとも１．０８３ｇ／ｍｌの密度を有する。
一実施形態では、造血細胞は、１．０８４ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、１．０８３ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、１．０８２ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、１．０８１ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、１．０８０ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、１．０７９ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。一実施形態では、造血細胞は、１．０７８ｇ／ｍｌ未満の密度を有する。
一実施形態では、造血細胞は、１．０７７ｇ／ｍｌ～１．０８４ｇ／ｍｌの密度（例えば、１．０７７ｇ／ｍｌより高いが、１．０８４ｇ／ｍｌ未満の密度）を有する。造血細胞は、１．０７９ｇ／ｍｌ～１．０８４ｇ／ｍｌの密度、例えば、１．０８０ｇ／ｍｌ～１．０８４ｇ／ｍｌの密度を有してもよい。造血細胞は、１．０８０ｇ／ｍｌ～１．０８３ｇ／ｍｌの密度、例えば、１．０８０ｇ／ｍｌ～１．０８２ｇ／ｍｌの密度を有してもよい。
一態様では、本発明は、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球の密度を測定すること；および
ｂ．顆粒球の測定された密度が少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌである場合、前記ドナーから造血細胞を選択すること
を含む方法を提供する。
本発明はまた、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．造血細胞の密度を測定すること；および
ｂ．１．０７７ｇ／ｍｌ未満の密度を有する、および／またはがん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞よりも高い密度を有する造血細胞を選択すること
を含む方法も提供する。
一態様では、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物を分化させることを含む方法であって、前記造血細胞が、
ａ．少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度；および
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を特徴とする顆粒球を形成するように分化する、方法が提供される。
本発明はまた、前記方法によって取得可能な顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの培養物も提供する。
一態様では、本発明は、
ａ．ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性；ならびに
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を特徴とする顆粒球を形成するように分化する造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物を提供する。
前記受容体の存在または非存在を、当業者には公知の任意の技術を使用して決定することができる。例えば、当業者であれば、前記受容体の存在または非存在を検出するために、任意選択によりＦＡＣＳと組み合わせて、標識された抗体を使用することができる。
受容体の活性／不活性を、任意の公知の技術を使用して決定することもできる。例えば、前記活性／不活性と関連する遺伝子発現の変化を検出することによる。
好ましくは、顆粒球は、ｔｏｌｌ様受容体を発現する；プログラム細胞死１（PD-1）受容体（例えば、UniProt受託番号Q15116）；ＣＤ１５（例えば、UniProt受託番号P07333）；ＣＤ２２４（例えば、UniProt受託番号P19440）；ＣＸＣＲ１（例えば、UniProt受託番号P25024）；および／またはＣＸＣＲ２（例えば、UniProt受託番号P25025）を発現しない（好ましくは、プログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；およびＣＸＣＲ２を発現しない）。
あるいは、またはさらに、ＰＤ－１受容倍；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；およびＣＸＣＲ２のうちの１つまたは複数を、不活性形態で発現させるか、または発現後に不活化することができる。
ｔｏｌｌ様受容体は、ＴＬＲ１（例えば、UniProt受託番号Q15399）、ＴＬＲ２（例えば、UniProt受託番号O60603）、ＴＬＲ３（例えば、UniProt受託番号O15455）、ＴＬＲ４（例えば、UniProt受託番号O00206）、ＴＬＲ５（例えば、UniProt受託番号O60602）、ＴＬＲ６（例えば、UniProt受託番号Q9Y2C9）、ＴＬＲ７（例えば、UniProt受託番号Q9NYK1）、ＴＬＲ８（例えば、UniProt受託番号Q9NR97）、ＴＬＲ９（例えば、UniProt受託番号Q9NR96）、ＴＬＲ１０（例えば、UniProt受託番号Q9BXR5）、および／またはＴＬＲ１１（例えば、UniProt受託番号Q6R590）のうちの１つまたは複数であってもよい。好ましくは、ｔｏｌｌ様受容体は、ＴＬＲ４である。
理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、
ＰＤ－Ｌ１は、高いＣＫＡを有する顆粒球（例えば、好中球）上でその受容体ＰＤ－１と結合しない、および／もしくは高いＣＫＡを有する顆粒球（例えば、好中球）は、ＰＤ－Ｌ１を産生しない；ならびに／または
高いＣＫＡを有する顆粒球（例えば、好中球）は、その表面上に活性なｔｏｌｌ様受容体を有する；ならびに／または
ＣＤ１１５およびＣＤ２２４マーカーは、高いＣＫＡを有する顆粒球（例えば、好中球）上で発現されない；
ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２は、低いＣＫＡを有する顆粒球（例えば、好中球）の受容体である、すなわち、高いＣＫＡを有する顆粒球（例えば、好中球）は、ＣＸＣＲ１＆ＣＸＣＲ２を発現しない、もしくはＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２は前記顆粒球（例えば、好中球）中で阻害される
と考えている。
一実施形態では、上記の細胞表面ポリペプチド発現プロファイルを有する顆粒球も、本明細書に記載の細胞表面電位および／または密度を有する。
一態様では、本発明は、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球上でのｔｏｌｌ様受容体；プログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／またはＣＸＣＲ２の発現または活性を検出すること；ならびに
ｂ．ｔｏｌｌ様受容体が発現されるか、もしくは活性である；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２が発現されないか、もしくは不活性である場合、前記ドナーから造血細胞を選択すること
を含む方法を提供する。
一態様では、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物を分化させることを含む方法であって、前記造血細胞が、
ａ．ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性；ならびに
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を特徴とする顆粒球を形成するように分化する、方法が提供される。
本発明はまた、前記方法によって取得可能な顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの培養物も提供する。
造血細胞を、不死化することができる。当業者であれば、特に、細胞周期を脱調節するウイルス遺伝子（例えば、５型アデノウイルスのＥ１遺伝子）の導入、およびテロメラーゼの人工的発現を含む不死化技術に精通している。不死化は、有利なことに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで安定に培養することができる細胞株の調製を可能にする。かくして、一態様では、本発明は、選択された造血細胞、ならびに安定な造血細胞培養物から取得可能な（例えば、取得される）不死化細胞株を提供する。好適には、不死化細胞株または安定な造血細胞培養物は、本発明の方法によって取得可能である（例えば、取得される）。
造血細胞培養物または細胞株を参照して使用される用語「安定な」とは、細胞培養物または細胞株が、非改変細胞（すなわち、ドナーから取得され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養に直接かけられた細胞）よりも、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養に適するように改変されていることを意味する。したがって、前記「安定な」細胞培養物または細胞株は、非改変細胞と比較した場合、より多い複製回数（好ましくは、長期間にわたる）を受けることができる。
造血細胞は、好適には、ドナー、例えば、ヒトドナーから取得可能である（例えば、取得される）。
本明細書で使用される用語「ドナー」とは、生体液試料が取得される対象（好適には、ヒト対象）を指す。造血細胞または顆粒球が取得可能である任意の好適な生体液試料を、本発明において使用することができる。
かくして、ドナー由来試料を参照して本明細書で使用される用語「試料」は、造血細胞を含む、または造血細胞が取得可能である任意の試料であってもよい（例えば、前記造血細胞がｉＰＳＣである場合、前記試料は体細胞を含んでもよい）。
一実施形態では、生体液試料（または「試料」）は、末梢血試料などの血液試料である。本明細書で使用される用語「血液」は、全血、血清、および血漿を包含する。血液を遠心分離にかけて、赤血球、白血球、および血漿を分離することができる。遠心分離後、単核細胞層を、本発明における使用のために除去することができる。
ドナーを、以下の特徴：性別、年齢、病歴、および／または血液型のうちの１つまたは複数に基づいて選択することができる。一実施形態では、ドナーが男性である場合に前記ドナーを選択してもよい。別の実施形態では、ドナーが１８～２５歳（好適には、１８～２４歳）である場合に前記ドナーを選択してもよい。好適には、ドナーが１８～２５歳（好適には、１８～２４歳）の男性である場合に前記ドナーを選択してもよい。理論によって束縛されることを望むものではないが、成人早期の男性は、がん細胞を殺傷する能力を有する顆粒球（例えば、好中球）を産生する可能性がより高いと考えられる。
好適には、ドナーから取得可能な（例えば、取得される）顆粒球は、少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位、およびがん細胞を殺傷する能力を有してもよい。別の実施形態では、ドナーから取得可能な（例えば、取得される）顆粒球は、少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位、およびがん細胞を殺傷する能力を有する。
本発明はまた、細胞表面電位の測定にも関する。細胞の表面電位を、当業界で公知の任意の好適な技術を使用して決定することができる。一実施形態では、表面電位は、電気泳動を使用して決定される。電気泳動技術を、好適な電気泳動媒体内に含まれる細胞に電圧を印加し、細胞移動度を測定することによって実行することができる。以下のプロトコールを用いることができる：
ｉ．電気泳動チャンバー中に含まれる細胞（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび２９１ｍＭグルコース緩衝液中に懸濁される）に、２００Ｖの直流を印加する；および
ｉｉ．３ｍＡの電流を印加しながら、前記細胞（例えば、顆粒球または造血細胞）が固定の長さを通過するのにかかった時間を測定する（例えば、任意選択によりCCDカメラに接続された顕微鏡の使用による）。
電気泳動移動度「μ」（単位μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃで表される）を、以下の式：
μ＝ｕｇＳ／Ｉ
（式中、
「ｕ」＝工程ｉｉ．によって測定される電気泳動速度；
「ｇ」＝電気泳動媒体の伝導率；
「Ｓ」＝電気泳動チャンバーの断面積；および
「Ｉ」＝電流である）
を使用して算出することができる。
一実施形態では、電気泳動移動度は、
ｉ．１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび２９１ｍＭグルコース中に懸濁された造血細胞または顆粒球を電気泳動チャンバーに添加すること；
ｉｉ．２００Ｖ／３ｍＡの直流を印加すること；ならびに
ｉｉｉ．前記造血細胞または顆粒球が所与の時間に電極に向かって移動した距離（ｍｍ）を測定すること；ならびに
ｉｖ．上記の式を使用して電気泳動移動度を算出すること
によって決定される。
電気泳動を、０．９％（等張性）ＮａＣｌ溶液中で行ってもよい。好ましくは、一定の電流を使用する（例えば、３ｍＡ）。
電気泳動移動度アッセイは、Ｊｏｈａｎｎ Ｂａｕｅｒによって編集された「Ｃｅｌｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」（CRC Press, Inc.により発行されたISBN 0-8493-8918-6）（その教示はその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたものであってよい。
理論によって束縛されることを望むものではないが、より高いＣＫＡを有する顆粒球（例えば、好中球）に分化することができる造血細胞（例えば、CD34を発現する造血幹細胞）は、より正に荷電し、したがって、より低いＣＫＡの顆粒球（例えば、好中球）に分化する類似するサイズおよび重量／密度の造血細胞（例えば、CD34を発現する造血幹細胞）よりも、所与の時間で負に荷電した電極に向かってさらに移動すると考えられる。同様に、より高いＣＫＡを有する顆粒球（例えば、好中球）は、より正に荷電し、したがって、より低いＣＫＡを有する可能性がある類似するサイズおよび重量／密度の顆粒球（例えば、好中球）よりも、所与の時間で負に荷電した電極に向かってさらに移動すると考えられる。
好ましくは、細胞表面電位は、電気泳動移動度に等しく、電気泳動中に所与の時間で細胞が移動した距離に比例する。より高い正電荷を有する細胞は、より低く正に荷電した（または負に荷電した）細胞よりも電気泳動中に電極に向かってさらに移動する。そのような細胞は、したがって、より低く正に荷電した（または負に荷電した）細胞よりも高い細胞表面電位の値を有するであろう。細胞の表面電位は、少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも２．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定することができる。好適には、細胞の表面電位は、少なくとも２．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも２．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定することができる。好適には、細胞の表面電位は、少なくとも３．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも３．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定することができる。好ましくは、細胞の表面電位は、少なくとも３．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも３．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定することができる。より好ましくは、細胞の表面電位は、少なくとも４．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定することができる。細胞は、造血細胞、または顆粒球であってもよい。
一実施形態では、本発明の造血細胞は、少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも１．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、例えば、少なくとも１．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは１．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（好ましくは、少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有してもよい。一実施形態では、造血細胞は、少なくとも２．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも２．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有してもよい。好適には、造血細胞は、少なくとも２．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも３．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有してもよい。好適には、造血細胞は、少なくとも３．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも３．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有してもよい。より好ましくは、造血細胞は、少なくとも３．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも４．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有してもよい。
一実施形態では、本発明の顆粒球は、少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも１．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、例えば、少なくとも１．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも１．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（好ましくは、少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有してもよい。一実施形態では、顆粒球は、少なくとも２．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも２．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有してもよい。好適には、顆粒球は、少なくとも２．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも３．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有してもよい。好ましくは、顆粒球は、少なくとも３．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも３．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有してもよい。より好ましくは、顆粒球は、少なくとも３．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも４．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有してもよい。
本発明は、ドナーから取得可能な（例えば、取得される）顆粒球の表面電位を測定することを含んでもよい。表面電位が少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（またはあるいは、少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される場合、造血細胞は、ドナーから選択される。有利なことに、これは、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞の選択のための単純な、および／または迅速な、および／または信頼できるスクリーニング方法を提供する。用いられる方法による一部の実施形態では、迅速なスクリーニングを使用して、より複雑なアッセイ（例えば、CKAアッセイなど）を必要とすることなく、ドナーが好適であるかどうかを決定することができる。その後、機能的アッセイ（本明細書に記載のCKAアッセイなど）を実施して、例えば、ドナーから選択された造血細胞を顆粒球に分化させること、およびＣＫＡアッセイにおいて前記顆粒球を試験することによって、スクリーニングを検証することができる。必要とされる細胞表面電位および／または必要とされるＣＫＡを有さない細胞を廃棄してもよい。
さらに、またはあるいは、造血細胞の表面電位を測定し、それが、２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満（好ましくは、２．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満、より好ましくは、３．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは４．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満）の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する；および／またはがん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球（例えば、好中球）を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞よりも高い表面電位を有する場合、造血細胞を選択することができる。有利なことに、これは、前記細胞ががんの処置における使用にとって好適であるかどうかを決定するための造血細胞の迅速なスクリーニングを可能にする。かくして、本発明は、２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満（好ましくは、２．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満、より好ましくは、３．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは４．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満）の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する；および／またはがん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球（例えば、好中球）を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞よりも高い表面電位を有する造血細胞を包含する。
一実施形態では、スクリーニング基準（例えば、より高い表面電位を有さない、および／または２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する）を満たさない造血細胞は廃棄される。
さらに、またはあるいは、造血細胞の表面電位を測定し、それが、１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満（好適には、１．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満、より好適には、１．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは１．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満）の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する；および／またはがん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球（例えば、好中球）を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞よりも高い表面電位を有する場合、造血細胞を選択することができる。かくして、本発明は、１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満（好適には、１．２５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満、より好適には、１．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは１．７５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満）の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する；および／またはがん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球（例えば、好中球）を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞よりも高い表面電位を有する造血細胞を包含する。
一実施形態では、スクリーニング基準（例えば、より高い表面電位を有さない、および／または１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する）を満たさない造血細胞は廃棄される。
用語「より高い表面電位」とは、より高い正の表面電荷を意味する。
「がん細胞を殺傷する能力の低下」を、同じ実験条件下で２つ以上の顆粒球（例えば、好中球）を試験すること、および殺傷されたがん細胞の濃度／量を比較することによって、実験的に決定することができる。「がん細胞を殺傷する能力の低下」を、本明細書に記載の方法またはＣＫＡアッセイを使用して決定することができる。一実施形態では、「がん細胞を殺傷する能力の低下」は、細胞が、本発明の細胞（すなわち、本明細書で定義される「がん細胞を殺傷能力」を有する細胞）よりも１０％または２０％少ないがん細胞を殺傷することを意味する。好ましくは、「がん細胞を殺傷する能力の低下」は、細胞が本発明の細胞よりも５％少ないがん細胞またはそれより少ないがん細胞を殺傷することを意味する。
かくして、この方法に従って、適切な造血細胞表面電位の値（がんの処置における使用にとって好適な顆粒球に分化させることができる造血細胞の選択を可能にする）を、それから取得可能な顆粒球の表面電位間の相関に基づいて、および／またはがん細胞を殺傷する能力に基づいて、経験的に決定することができる。
関連する態様では、本発明は、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球（例えば、好中球）が、
ｉ．少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（または少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される表面電位；および
ｉｉ．がん細胞を殺傷する能力
を特徴とする、前記ドナーから取得可能な造血細胞の表面電位を測定すること；ならびに
ｂ．造血細胞を選択するための方法において測定された表面電位を使用すること
を含む方法を提供する。
「造血細胞を選択するための方法」は、表面電位の測定値が得られたのと同じドナー、または異なるドナーから造血細胞を選択することを指してもよい。
一態様では、本発明は、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を取得するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球の細胞表面電荷を測定すること；および
ｂ．前記顆粒球が対照顆粒球と比較した場合、より高い正の細胞表面電荷を有する場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること
を含む方法を提供する。
対照顆粒球は、負、正または中性の電荷を有してもよい。好ましくは、対照顆粒球は、正電荷を有する。好ましくは、対照顆粒球は、がん細胞を殺傷しない（例えば、本明細書に記載の方法において少なくとも５％のがん細胞を殺傷しない）顆粒球である。対照顆粒球は、好ましくは、工程ａ．のドナーと異なるドナーから取得される。
一実施形態では、方法は、前記顆粒球が対照顆粒球と比較した場合、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％または３００％高く正に荷電している細胞表面電荷を有する場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得することを含む。
別の態様では、本発明は、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な造血細胞の細胞表面電荷を測定すること；および
ｂ．前記造血細胞が、対照造血細胞と比較した場合、より高い正の細胞表面電荷を有する場合、前記造血細胞を、がんの処置における使用にとって好適なものとして選択すること
を含む方法を提供する。
対照顆粒球または造血細胞の細胞表面電荷を、本発明の方法を実行する前に、または本発明の方法を実行すると同時に（好ましくは、同時に）決定することができる。
例えば、一実施形態では、前記方法は、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球または造血細胞の細胞表面電荷を測定すること；
ｂ．対照顆粒球または造血細胞の細胞表面電荷を測定すること；および
ｃ．前記顆粒球が、前記対照顆粒球と比較した場合により高い正の細胞表面電荷を有する場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること；または前記造血細胞が、対照造血細胞と比較した場合により高い正の細胞表面電荷を有する場合、がんの処置における使用にとって好適なものとして前記造血細胞を選択すること
を含む。
一部の実施形態では、方法は、さらなるドナー（例えば、第２、第３、第４のドナーなど）に由来する顆粒球を含む複数の異なる試験試料の使用を含んでもよい。
対照造血細胞は、負、正または中性の電荷を有してもよい。好ましくは、対照造血細胞は、正電荷を有する。好ましくは、対照造血細胞は、がん細胞を殺傷する顆粒球に分化しない造血細胞である（例えば、前記造血細胞は、本明細書に記載の方法において少なくとも５％のがん細胞を殺傷する顆粒球に分化しない）。対照造血細胞は、好ましくは、工程ａ．のドナーと異なるドナーから取得される。
一実施形態では、方法は、造血細胞が対照造血細胞と比較した場合、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％または３００％高く正に荷電している細胞表面電荷を有する場合、前記ドナーに由来する試料から前記造血細胞を取得することを含む。
一態様では、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な試料中の正の細胞表面電荷を有する顆粒球の濃度を測定すること；および
ｂ．正の細胞表面電荷を有する前記顆粒球の濃度が、異なるドナーに由来するそれ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する顆粒球の濃度よりも高い場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること
を含む方法が提供される。
言及される対照試料は、がん細胞を殺傷しない顆粒球（例えば、本明細書に記載の方法において少なくとも５％のがん細胞を殺傷しない顆粒球）を有するドナーに由来する試料であってもよい。
一実施形態では、方法は、正の細胞表面電荷を有する顆粒球の濃度が、異なるドナーに由来するそれ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する顆粒球の濃度よりも少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％または３００％高い場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得することを含む。好ましくは、正の細胞表面電荷を有する顆粒球の濃度は、異なるドナーに由来するそれ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する顆粒球の濃度よりも少なくとも５０％高い。
別の態様では、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な試料中の正の細胞表面電荷を有する造血細胞の濃度を測定すること；および
ｂ．正の細胞表面電荷を有する造血細胞の濃度が、異なるドナーに由来するそれ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する造血細胞の濃度よりも高い場合、がんの処置における使用にとって好適なものとして前記造血細胞を選択すること
を含む方法が提供される。
異なるドナーに由来するそれ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する顆粒球または造血細胞の濃度を、本発明の方法を実行する前に、または本発明の方法を実行すると同時に（好ましくは、同時に）決定することができる。
例えば、一実施形態では、前記方法は、
ａ．（第１の）ドナーから取得可能な試料中の正の細胞表面電荷を有する顆粒球または造血細胞の濃度を測定すること；
ｂ．異なるドナーに由来するそれ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する顆粒球または造血細胞の濃度を測定すること；および
ｃ．正の細胞表面電荷を有する前記顆粒球の濃度が、それ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する顆粒球の濃度よりも高い場合、前記（第１の）ドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること；または前記（第１の）ドナーに由来する正の細胞表面電荷を有する前記造血細胞の濃度が、それ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する造血細胞の濃度よりも高い場合、がんの処置における使用にとって好適なものとして造血細胞を選択すること
を含む。
一部の実施形態では、方法は、さらなるドナー（例えば、第２、第３、第４のドナーなど）に由来する顆粒球を含む複数の異なる試験試料の使用を含んでもよい。
言及される対照試料は、がん細胞を殺傷する顆粒球に分化しない造血細胞を有するドナーに由来する試料であってもよい（例えば、前記造血細胞は、本明細書に記載の方法において少なくとも５％のがん細胞を殺傷する顆粒球に分化しない）。
一実施形態では、方法は、正の細胞表面電荷を有する造血細胞の濃度が、異なるドナーに由来するそれ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する造血細胞の濃度よりも少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％または３００％高い場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得することを含む。好ましくは、正の細胞表面電荷を有する造血細胞の濃度は、異なるドナーに由来するそれ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する造血細胞の濃度よりも少なくとも５０％高い。
一態様では、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．第１のドナーから取得可能な顆粒球の細胞表面電荷を測定すること；
ｂ．対照顆粒球と比較した場合、より高い正の細胞表面電荷を有する前記第１のドナーから取得可能な顆粒球を同定すること；
ｃ．工程ｂ．で同定された顆粒球の濃度を測定すること；
ｄ．工程ｃ．で測定された前記顆粒球の濃度と、第２の（またはさらなる）ドナーから取得可能な顆粒球の濃度とを比較することであって、前記第２の（またはさらなる）ドナーに由来する顆粒球が、対照顆粒球と比較した場合、より高い正の細胞表面電荷を有する、比較すること；および
ｅ．比較が、前記第２の（またはさらなる）ドナーから取得可能な前記顆粒球の濃度と比較した場合に前記第１のドナーから取得可能な前記顆粒球のより高い濃度を同定する場合、前記第１のドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること
を含む方法が提供される。
一実施形態では、工程ｄ．において比較される、第１のドナーから取得可能な顆粒球および第２のドナーから取得可能な顆粒球は、等しい細胞表面電荷を有する。
対照顆粒球は、負、正または中性の電荷を有してもよい。好ましくは、対照顆粒球は、正電荷を有する。好ましくは、対照顆粒球は、がん細胞を殺傷しない（例えば、本明細書に記載の方法において少なくとも５％のがん細胞を殺傷しない）顆粒球である。対照顆粒球は、好ましくは、工程ａ．のドナーと異なるドナーから取得される。
一実施形態では、前記第１のドナーから取得可能な顆粒球は、対照顆粒球と比較した場合、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％または３００％高く正に荷電している細胞表面電荷を有する。
一実施形態では、比較は、前記第２の（またはさらなる）ドナーから取得可能な前記顆粒球の濃度よりも少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％または３００％高い、前記第１のドナーから取得可能な前記顆粒球の濃度を同定する。好ましくは、少なくとも５０％高い。
一態様では、がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．第１のドナーから取得可能な造血細胞の細胞表面電荷を測定すること；
ｂ．対照造血細胞と比較した場合、より高い正の細胞表面電荷を有する前記第１のドナーから取得可能な造血細胞を同定すること；
ｃ．工程ｂ．で同定された造血細胞の濃度を測定すること；
ｄ．工程ｃ．で測定された前記造血細胞の濃度と、第２の（またはさらなる）ドナーから取得可能な造血細胞の濃度とを比較することであって、前記第２の（またはさらなる）ドナーに由来する造血細胞が、対照造血細胞と比較した場合、より高い正の細胞表面電荷を有する、比較すること；および
ｅ．比較が、前記第２の（またはさらなる）ドナーから取得可能な前記造血細胞の濃度と比較した場合に前記第１のドナーから取得可能な前記造血細胞のより高い濃度を同定する場合、がんの処置における使用にとって好適なものとして前記第１のドナーから取得可能な造血細胞を選択すること
を含む方法が提供される。
一実施形態では、工程ｄ．において比較される、第１のドナーから取得可能な造血細胞および第２のドナーから取得可能な造血細胞は、等しい細胞表面電荷を有する。
対照顆粒球または造血細胞の細胞表面電荷を、本発明の方法を実行する前に、または本発明の方法を実行すると同時に（好ましくは、同時に）決定することができる。
対照造血細胞は、負、正または中性の電荷を有してもよい。好ましくは、対照造血細胞は、正電荷を有する。好ましくは、対照造血細胞は、がん細胞を殺傷する顆粒球に分化しない造血細胞である（例えば、前記造血細胞は、本明細書に記載の方法において少なくとも５％のがん細胞を殺傷する顆粒球に分化しない）。対照造血細胞は、好ましくは、工程ａ．のドナーと異なるドナーから取得される。
一実施形態では、前記第１のドナーから取得可能な造血細胞は、対照造血細胞と比較した場合、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％または３００％高く正に荷電している細胞表面電荷を有する。
一実施形態では、比較は、前記第２の（またはさらなる）ドナーから取得可能な前記造血細胞の濃度よりも少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％または３００％高い、前記第１のドナーから取得可能な前記造血細胞の濃度を同定する。好ましくは、少なくとも５０％高い。
一部の実施形態では、さらなるドナーは、第３、第４、第５または第６のドナーであってもよい。
一実施形態では、細胞表面電荷の測定は、顆粒球または造血細胞と、正に荷電した手段および負に荷電した手段（例えば、ナノ粒子）とを接触させることを含み、顆粒球または造血細胞の正に荷電した手段への優先的結合は、細胞表面が負に荷電していることを示し、顆粒球または造血細胞の負に荷電した手段への優先的結合は、細胞表面が正に荷電していることを示す。
一実施形態では、顆粒球または造血細胞は、それに負に荷電した手段が結合することができ、正に荷電した手段が結合することができない場合、正の細胞表面電荷を有する。一実施形態では、顆粒球または造血細胞は、それに正に荷電した手段が結合することができ、負に荷電した手段が結合することができない場合、負の細胞表面電荷を有する。
そのような負および／または正に荷電した手段を使用して、試料中の顆粒球または造血細胞の濃度を測定することもできる。
正に荷電した手段は、正に荷電した粒子、ナノプローブもしくはナノ粒子、または陽イオン交換媒体であってもよい。
一態様では、本発明は、前記電荷を手段として（より高い）正の細胞表面電荷を含む顆粒球または造血細胞を単離することを含む。例えば、前記細胞を、負に荷電した粒子、ナノプローブもしくはナノ粒子、または陰イオン交換媒体などの負に荷電した手段を使用して単離することができる。そのような技術を使用して、前記実施形態において顆粒球の細胞表面電荷または正の細胞表面電荷を有する顆粒球の濃度を測定することができる。
細胞を、負に荷電した、中性に荷電した、または弱く正に荷電した顆粒球または造血細胞から単離することができる。
一実施形態では、正または負に荷電した手段（例えば、ナノ粒子）は、蛍光によって検出可能であってもよい。別の実施形態では、正または負に荷電した手段（例えば、ナノ粒子）は、磁気によって捕捉され、かくして、前記手段と相互作用する細胞の単離を可能にしてもよい。
好適なナノ粒子を、超常磁性酸化鉄（II、III）（Ｆｅ3Ｏ4）ナノ粒子（NP）を、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）とコンジュゲートさせて、テトラエチルオルトシリケート（TEOS）および水酸化アンモニウム（ＮＨ4ＯＨ）との反応時にＮＰの表面上に二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）殻の薄層を形成することによって調製することができる。イソチオシアン酸フルオレセイン（FITC）を、ＳｉＯ2殻中に埋め込み、かくして、Ｓｉに結合したヒドロキシル基（ＳｉＯ2－ＯＨ）を露出させ、負の表面電荷を創出することができる。分枝状ポリ（エチレンイミン）（PEI）分子を使用して、非共有的様式でＳｉＯ2－ＯＨ基を被覆するだけでなく、正電荷を担持するさらなるアミン基を露出させることもできる。
かくして、一実施形態では、負に荷電したナノ粒子は、Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子をＡＰＴＥＳとコンジュゲートさせて、テトラエチルオルトシリケート（TEOS）および水酸化アンモニウム（ＮＨ4ＯＨ）との反応時にナノ粒子表面上にＳｉＯ2殻の薄層を形成すること、およびＳｉＯ2殻中にＦＩＴＣを埋め込むこと、かくして、ＳｉＯ2－ＯＨ基を露出させること（負の表面電荷を創出すること）によって調製される。
別の実施形態では、正に荷電したナノ粒子は、負に荷電したナノ粒子（本明細書に記載のもの）と、ＰＥＩ分子（例えば、正電荷を担持するさらなるアミン基を露出させるため）とを接触させることによって調製される。
一実施形態では、負に荷電した手段（例えば、ナノ粒子）は、少なくとも－５ｍＶ、－１０ｍＶ、－２０ｍＶ、－３０ｍＶ、または－４０ｍＶの負の表面電荷を有してもよい。好ましくは、負に荷電した手段（例えば、ナノ粒子）は、少なくとも－３５ｍＶの負の表面電荷を有してもよい。
一実施形態では、正に荷電した手段（例えば、ナノ粒子）は、少なくとも＋５ｍＶ、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋３０ｍＶ、または＋４０ｍＶの正の表面電荷を有してもよい。好ましくは、正に荷電した手段（例えば、ナノ粒子）は、少なくとも＋３５ｍＶの正の表面電荷を有してもよい。
前記正または負に荷電した手段（例えば、ナノ粒子）の表面電荷は、正または負に荷電した手段（例えば、ナノ粒子）の表面ゼータ電位を指してもよい。表面ゼータ電位を、動的光散乱粒径分析装置（例えば、Zetasizer Nano-ZS90、Malvern、UK）を用いて測定することができる。
細胞表面電荷を使用して、顆粒球（高いがん殺傷活性を有する）および関連する造血細胞を選択することができることは驚くべきことである。６０年にわたって、全ての哺乳動物細胞は負に荷電しているということ、およびこれは個体間で同じ細胞型について一貫しているということが支持されてきた。理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、顆粒球は正であるという現在受け入れられている理論が、細胞表面電荷を分析するために使用される技術の限界（例えば、Ｎａ＋、Ｃａ＋などの可溶性イオンが失われている）から生じていると考えている。本発明者らは、顆粒球上の正電荷を、ヒト好中球において最も豊富なタンパク質であるヒト好中球ペプチド（HNP）によって提供することができると考えている。ＨＮＰは、アルギニン、リシン、およびシステインに富む２０～４０個のアミノ酸を含有し、ペプチドを正に荷電させ、「陽イオンペプチド」と呼ばれる。ＨＮＰは、一方の側が疎水性であり、他方の側が親水性かつ正に荷電している、両親媒性の折り畳まれた棹状構造を有する。ＨＮＰの主な標的は、がん細胞上の負に荷電した脂質二重層膜であると考えられる。ＨＮＰの活性化機構は、ペプチド前駆体中の正電荷を中和する負に荷電したリーダーペプチドの切断である。標的細胞上で、成熟両親媒性ＨＮＰは、２つの主なエフェクター作用を発揮する。第１に、ＨＮＰは、標的細胞の細胞膜上でバレル様小孔を形成する。単量体ＨＮＰの疎水性側は、標的二重層膜の疎水性部分に対して整列し、一方、ＨＮＰの親水性側は、他の同様に整列したＨＮＰと共に親水性小孔を形成する。この孔は、標的がん細胞の膨張および破裂（細胞溶解）を引き起こす。第２に、ＨＮＰは、ミトコンドリアを含有する標的細胞の細胞質に進入したら、負に荷電したミトコンドリア外膜に結合し、これを中和することができ、急速なアポトーシスを誘発するための周知の機構であるミトコンドリア膜貫通電位の消失をもたらす。本発明者らは、したがって、より高い正の細胞電荷を有する顆粒球（例えば、好中球）は、より多くのＨＮＰを含有し、したがって、より高いがん殺傷活性を有すると考える。
一実施形態では、前記方法によって得られた顆粒球を、がん殺傷アッセイまたは本明細書に記載の方法によって機能的にアッセイすることができる。
本明細書に記載の細胞は、細胞培養物（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物）の一部であってもよい。細胞培養物は、複数の異なる細胞型（例えば、造血細胞、または顆粒球とは別の）を含んでもよい。
一実施形態では、細胞培養物は、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物である。細胞培養物は、少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（または少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される表面電位；およびがん細胞を殺傷する能力を特徴とする顆粒球を形成するように分化する造血細胞に関して富化されていてもよい。あるいは、またはさらに、細胞培養物は、少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度；およびがん細胞を殺傷する能力を有する顆粒球を形成するように分化する造血細胞に関して富化されていてもよい。あるいは、またはさらに、細胞培養物は、ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性；ならびにがん細胞を殺傷する能力を有する顆粒球を形成するように分化する造血細胞に関して富化されていてもよい。
一実施形態では、用語「造血細胞に関して富化される」とは、本明細書に記載の造血細胞（例えば、本発明の方法によって選択される）が、細胞培養物中に含まれる全造血細胞（好ましくは、全細胞）の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を占めることを意味する。
一実施形態では、用語「造血細胞に関して富化される」とは、
（ｉ）少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（または少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される表面電位；または
（ｉｉ）少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度；または
（ｉｉｉ）ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性；ならびに
がん細胞を殺傷する能力を特徴とする顆粒球を形成するように分化する造血細胞が、細胞培養物中に含まれる全造血細胞（好ましくは、全細胞）の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を占めることを意味する。
別の実施形態では、細胞培養物は、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物である。前記顆粒球は、本発明の造血細胞を分化させることによって取得可能である。顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物は、少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（または少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される表面電位；およびがん細胞を殺傷する能力を有する顆粒球に関して富化されていてもよい。あるいは、またはさらに、細胞培養物は、少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度；およびがん細胞を殺傷する能力を有する顆粒球に関して富化されていてもよい。あるいは、またはさらに、細胞培養物は、ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性；ならびにがん細胞を殺傷する能力を有する顆粒球に関して富化されていてもよい。
一実施形態では、用語「顆粒球に関して富化される」とは、本明細書に記載の顆粒球（例えば、本発明の方法によって選択される）が、細胞培養物中に含まれる全顆粒球（好ましくは、全細胞）の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を占めることを意味する。
一実施形態では、用語「顆粒球に関して富化される」とは、
（ｉ）少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ（または少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ）の電気泳動移動度によって規定される表面電位；または
（ｉｉ）少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度；または
（ｉｉｉ）ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性；ならびに
がん細胞を殺傷する能力を有する顆粒球が、細胞培養物中に含まれる全顆粒球（好ましくは、全細胞）の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を占めることを意味する。
本発明の細胞、細胞培養物または医薬組成物を、低温凍結などの１つまたは複数のさらなるプロセシング工程にかけることができる。さらなるプロセシング工程は、前記細胞、細胞培養物または医薬組成物と、保存媒体、例えば、低温保存媒体とを混合することを含んでもよい。
本発明は、細胞バンクに本発明の細胞、細胞培養物、または医薬組成物を預託することをさらに含んでもよく、かくして、関連する態様では、細胞、細胞培養物または医薬組成物を含む細胞バンクを提供する。本明細書で使用される用語「細胞バンク」とは、細胞の生存にとって好適な条件下で細胞を維持する保存設備を指す。例えば、細胞を、代謝的に休眠状態で保存することができる（例えば、低温凍結される）。好適には、細胞バンク内に含まれる細胞は、適切な回復のために分類される（例えば、血液型、および／またはヒト白血球抗原（HLA）型に基づく）。一実施形態では、細胞を、それ（またはそれから分化した細胞）が殺傷するがんの型に基づいて分類することができる。細胞バンクが顆粒球細胞バンクである場合、前記細胞バンクを、本発明の造血細胞を使用して補充することができる。一部の実施形態では、ドナーから取得された造血細胞または顆粒球を保存した後、前記ドナーに投与し（例えば、前記ドナーががんと診断された場合）、かくして、オーダーメイド医療を構成することができる。
本発明の細胞または細胞培養物を、その下流の適用（例えば、細胞バンク中での保存、または療法における使用）に基づいて、任意の好適な様式で製剤化することができる。
かくして、本発明の一態様は、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または本発明の医薬組成物を含む細胞バンクを提供する。
一実施形態では、本発明の細胞または細胞培養物は、本発明の細胞または細胞培養物と、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、増殖ホルモン；セロトニン、ビタミンＣ、ビタミンＤ、グルタミン（Gln）、アラキドン酸、ＡＧＥ－アルブミン、インターロイキン、ＴＮＦ－アルファ、Ｆｌｔ－３リガンド、トロンボポエチン、ウシ胎仔血清（FBS）、またはその組合せとを含む医薬組成物として製剤化される。
一実施形態では、本発明の細胞または細胞培養物は、本発明の細胞または細胞培養物と、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、および増殖ホルモン、およびセロトニン、およびビタミンＣ、およびビタミンＤ、およびグルタミン（Gln）、およびアラキドン酸、およびＡＧＥ－アルブミン、およびインターロイキン、およびＴＮＦ－アルファ、およびＦｌｔ－３リガンド、およびトロンボポエチン、およびウシ胎仔血清（FBS）とを含む医薬組成物として製剤化される。
一実施形態では、細胞、細胞培養物または医薬組成物は、薬学的に許容される担体と共に製剤化される。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」とは、対象（例えば、患者）に損害を引き起こすことなく、静脈内、動脈内、腹腔内、腫瘍内、髄腔内またはその組合せ（好ましくは、静脈内）で前記対象に投与することができる担体を意味する。かくして、一実施形態では、薬学的に許容される担体は、滅菌生理食塩溶液などの注入可能な担体である。
本発明は、細胞、細胞培養物、医薬組成物、および医学における使用のためのキットを提供する。例えば、薬剤としての使用のための、本発明の造血細胞、造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、医薬組成物またはキットが提供される。薬剤は、がんの処置において特に有用である。
一実施形態では、がんは、固形腫瘍がんである。用語「固形腫瘍がん」とは、嚢胞または液体包有物を含有しない異常な、組織の悪性の塊を指す。固形腫瘍がんの例としては、癌腫、肉腫、およびリンパ腫が挙げられる。
固形腫瘍がんは、癌腫であってもよい。癌腫は、腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、腎細胞癌、非浸潤性乳管癌（DCIS）、浸潤性腺管癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌またはその組合せのうちの１つまたは複数から選択することができる。癌腫はまた、上皮性新生物、扁平上皮性新生物、扁平上皮癌、基底細胞性新生物、基底細胞癌、移行上皮癌、腺癌（特定不能腺癌（NOS）、形成性胃線維炎、ビポーマ、胆管癌、肝細胞癌NOS、腺様嚢胞癌、腎細胞癌、グラビッツ腫瘍）、皮膚付属器新生物（ａｄｎｅｘａｌ ａｎｄ ｓｋｉｎ ａｐｐｅｎｄａｇｅ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）、粘表皮新生物、嚢胞性、粘液性および漿液性新生物、導管性、小葉性および髄様性新生物、腺房細胞新生物、または複合上皮性新生物から選択することもできる。
あるいは、固形腫瘍がんは、肉腫であってもよい。肉腫は、アスキン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、骨肉腫、または軟部組織肉腫（胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫、隆起性皮膚線維肉腫（DFSP）、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍（GIST）、血管周囲細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、悪性線維性組織球腫、未分化多形肉腫、悪性末梢神経鞘腫（MPNST）、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫など）から選択することができる。
あるいは、固形腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、またはホジキンリンパ腫などのリンパ腫であってもよい。
一実施形態では、本発明の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、造血細胞、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球、医薬組成物またはキットは、膵がん、肝臓がん、食道がん、胃がん、子宮頸がん、卵巣がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、脳腫瘍、前立腺がん、骨髄腫のがん、非ホジキンリンパ腫（NHL）、喉頭がん、子宮がん、または乳がんのうちの１つまたは複数の処置における使用のためのものである。
好ましくは、本発明の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、造血細胞、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球、医薬組成物またはキットは、膵がんの処置における使用のためのものである。膵がんは、膵臓腺癌（例えば、膵管腺癌）などの膵臓固形腫瘍がんであってよい。
本明細書における「がん細胞」に対する参照（例えば、「がん細胞を殺傷する能力」の文脈における）は、上記のがんのいずれかのがん細胞を指してもよい。好適には、「がん細胞」は、膵がん細胞などの固形腫瘍がん細胞であってよい。
一態様では、本発明は、がんを処置する方法であって、
ａ．本明細書に記載の方法によって顆粒球または造血細胞を取得すること；および
ｂ．前記顆粒球または造血細胞を対象に投与すること
を含む方法を提供する。
一部の実施形態では、造血細胞を、投与前に顆粒球に分化させることができる。
一実施形態では、本発明の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、造血細胞、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球、医薬組成物またはキットを、対象（例えば、がんを有する対象）に投与する。投与前に、薬剤（例えば、本発明の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または医薬組成物を含む）と、処置しようとする対象とのマッチング工程があってもよい。マッチングは、造血細胞、または顆粒球が誘導されるドナーから誘導されるデータ、および処置しようとする対象から取得された同様のデータに基づくものであってもよい。マッチングを、血液型、ヒト白血球抗原（HLA）型類似性、またはその組合せに基づいて達成することができる。
典型的な処置レジメンは、１０6、１０7、１０8もしくは１０9個の細胞、または最大で１０12、１０13もしくは１０14個の細胞を対象に投与することを含んでもよい。一実施形態では、処置レジメンは、少なくとも１ｘ１０9個の細胞の用量を対象に投与することを含む。好適には、処置レジメンは、少なくとも２ｘ１０9個の細胞または少なくとも５ｘ１０9個の細胞の用量を対象に投与することを含んでもよい。一実施形態では、処置レジメンは、少なくとも１ｘ１０10個の細胞または少なくとも５ｘ１０10個の細胞の用量を対象に投与することを含んでもよい。少なくとも１ｘ１０11個または少なくとも２ｘ１０11個の細胞を対象に投与してもよい。一部の実施形態では、１ｘ１０9～３ｘ１０11個または１ｘ１０10～３ｘ１０11個の細胞が対象に投与される。好適には、５ｘ１０10～２．５ｘ１０11個の細胞が対象に投与される。
処置のための対象に、週に１回、２回、３回、４回、５回、または６回投与することができる。あるいは、対象に毎日（例えば、１日1回または２回）投与してもよい。他の実施形態では、対象に週に、または２週に１回投与してもよい。好ましくは、投与は毎週である。当業者であれば、対象の必要、および薬剤の効能に基づいて、用量を調整することができることを理解するであろう。例えば、薬剤の効能が高い場合、用量を低下させてもよい。
一実施形態では、処置のための対象は、少なくとも２ｘ１０9個の細胞または少なくとも２ｘ１０10個の細胞を毎週（例えば、週１回）投与される。好適には、処置のための対象に、少なくとも１ｘ１０11個または少なくとも２ｘ１０11個の細胞を毎週投与することができる。
処置期間は、処置に対する対象の応答、ならびに／またはがんの型および／もしくは重症度に基づいて変化させることができる。例えば、処置のための対象に、少なくとも１または２週間にわたって投与してもよい。好適には、処置のための対象に、少なくとも３または４週間にわたって投与してもよい。一実施形態では、処置のための対象は、少なくとも５または６週間、好適には、少なくとも７または８週間にわたって投与される。
一実施形態では、処置のための対象は、４～８週間にわたって、少なくとも２ｘ１０9個の細胞を投与され、ここで、前記細胞は、週１回投与される。好適には、処置のための対象は、８週間にわたって、少なくとも２ｘ１０9個の細胞（好ましくは、少なくとも２ｘ１０10個または２ｘ１０11個の細胞）を投与され、ここで、前記細胞は、週１回投与される。
投与は、限定されるものではないが、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、腫瘍切除腔への注入、髄腔内注射、またはその組合せなどの、任意の好適な技術または経路によるものであってもよい。好適には、薬剤を、静脈内投与することができる。
白血球増殖因子を、本発明の薬剤と共に投与することができる。投与は、連続的または同時的（好適には、同時的）であってもよい。好適な白血球増殖因子は、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、増殖ホルモン；セロトニン、ビタミンＣ、ビタミンＤ、グルタミン（Gln）、アラキドン酸、ＡＧＥ－アルブミン、インターロイキン、ＴＮＦ－アルファ、Ｆｌｔ－３リガンド、トロンボポエチン、ウシ胎仔血清（FBS）、またはその組合せを含んでもよい。好適には、白血球増殖因子は、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、および増殖ホルモン、およびセロトニン、およびビタミンＣ、およびビタミンＤ、およびグルタミン（Gln）、およびアラキドン酸、およびＡＧＥ－アルブミン、およびインターロイキン、およびＴＮＦ－アルファ、およびＦｌｔ－３リガンド、およびトロンボポエチン、およびウシ胎児血清（FBS）を含んでもよい。前記の特定の例としては、限定されるものではないが、ＬＥＵＫＩＮＥ（登録商標）ブランドのサルグラモスチム、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）ブランドのフィルグラスチム、およびＮＥＵＬＡＳＴ Ａ（登録商標）ブランドの５ＰＥＧ－フィルグラスチムが挙げられる。
薬剤が造血細胞（例えば、造血細胞培養物）である場合、薬剤を、顆粒球－コロニー刺激因子；および増殖ホルモン；およびセロトニン；およびインターロイキンと共に投与する（例えば、連続的または同時的、好ましくは、同時的に）ことができる。一実施形態では、顆粒球前駆細胞（例えば、顆粒球前駆細胞培養物）を、顆粒球－コロニー刺激因子；および増殖ホルモン；およびセロトニン；およびインターロイキンと共に投与する（例えば、連続的または同時的、好ましくは、同時的に）。
本発明はまた、本発明の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球、顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または医薬組成物；および医薬におけるその使用のための指示書を含むキットも提供する。好適には、指示書は、前記実施形態のいずれか１つに記載されたがんの処置におけるその使用のためのものであってもよい。一部の実施形態では、指示書はまた、適切な投薬レジメン（例えば、前記実施形態に記載されたような）を詳述する。一実施形態では、指示書は、がん、好ましくは、膵がんの処置における前記キットの使用のためのものである。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第２０版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）、およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１）は、本開示において使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
本開示は、本明細書に開示される例示的な方法および材料によって限定されず、本明細書に記載のものと類似するか、または等価である任意の方法および材料を、本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値範囲は、その範囲を規定する数を含む。
本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様または実施形態の限定ではない。
他の用語の定義は、本明細書を通じて出現してもよい。例示的な実施形態をより詳細に説明する前に、本開示が記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして変化してもよいことが理解されるべきである。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろうため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであることも理解されるべきである。
値の範囲が提供される場合、本文が別途明確に示さない限り、その範囲の上限と下限の間の、下限の単位の小数第２位で四捨五入したものまでの、それぞれの介在する値も、具体的に開示されることが理解される。任意の記述される値または記述される範囲中の介在する値と、その記述される範囲中の任意の他の記述される値または介在する値との間のそれぞれの小さい方の範囲は、本開示内に包含される。これらの小さい方の範囲の上限および下限を、独立に範囲中に含有させるか、またはそれから排除してもよく、小さい方の範囲にいずれかの限界が含まれる、いずれの限界も含まれない、または両方の限界が含まれるそれぞれの範囲も、本開示内に包含され、記述される範囲中の任意の限界が明示的に排除され得る。記述される範囲が一方または両方の限界を含む場合、これらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲も、本開示に含まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に記述しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。かくして、例えば、「造血細胞」に対する参照は、複数のそのような候補薬剤を含み、「造血細胞」に対する参照は、１つまたは複数の造血細胞に対する参照および当業者には公知のその等価物などを含む。
本明細書で考察される刊行物は単に、本出願の出願日より前にその開示について提供されるものである。本明細書に記載のものは、そのような刊行物が本明細書に添付される特許請求の範囲に対する先行技術であることの承認と解釈されるべきではない。
ここで、本発明を、ほんの一例として、以下の図面および実施例を参照して説明する。
ここで、本発明の実施形態を、ほんの一例として、添付の図面を参照して説明する。
図１は、異なるドナーに由来する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比でのドナー由来好中球（DDN）の細胞傷害性の結果（MTTアッセイ）を示す。ドナー間のＣＫＡのレベル差は、より高いエフェクター：標的細胞比で維持される。エフェクター：ＤＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞。 図２は、異なるドナーに由来する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比での３つのＣＤ３４＋幹細胞由来好中球集団の細胞傷害性の結果を示す。結果は、異なるドナーに由来する幹細胞由来好中球が示差的なＣＫＡを有することを示す。エフェクター：ＳＣＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞およびＰＡＮＣ－１（膵がん）。 図３は、異なるドナーに由来する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比でのドナー由来好中球（DDN）の細胞傷害性の結果（xCELLigenceアッセイ）を示す。ドナー間のＣＫＡのレベル差は、より高いエフェクター：標的細胞比で維持される。エフェクター：ＤＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞。 図４は、異なるがん細胞型に対する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比での新鮮なドナー由来好中球の細胞傷害性の結果を示す。結果は、異なるドナーに由来するＤＤＮが示差的なＣＫＡを有し、膵がん細胞に対してより高いＣＫＡを有することを示す。エフェクター：ＤＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）およびＰＡＮＣ－１細胞（膵がん）。 図５は、非がん細胞およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比と比較した、がん細胞型に関するドナー由来好中球の選択的細胞傷害性を示す。結果は、がん細胞を殺傷するＤＤＮが、非がん細胞に対する最小限の影響を有することを示し、選択性が確認される。エフェクター：ＤＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）およびＰＡＮＣ－１細胞（膵がん）およびＭＣＦ－１２Ｆ（非がん細胞、正常な乳房上皮）。 図６は、５つの異なる培養物に由来する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比でのＣＤ３４＋幹細胞由来好中球集団（臍帯血幹細胞由来）の細胞傷害性の結果を示す。結果は、ＭＴＴアッセイを用いて生成され、ｅｘ ｖｉｖｏで生成された好中球が示差的なＣＫＡを有することを示す。エフェクター：ＳＣＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞。 図７は、異なるがん細胞型に対する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比での３つのＣＤ３４＋幹細胞由来好中球集団の細胞傷害性の結果を示す。結果は、異なるドナーに由来するＳＣＤＮが示差的なＣＫＡを有し、膵がん細胞に対してより高いＣＫＡを有することを示す。エフェクター：ＳＣＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）およびＰＡＮＣ－１細胞（膵がん）。 図８は、異なるドナーに由来する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比での３つのＣＤ３４＋幹細胞由来好中球集団の細胞傷害性の結果を示す。結果は、異なるドナーに由来する幹細胞由来好中球が示差的なＣＫＡを有することを示す。エフェクター：ＳＣＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）およびＰＡＮＣ－１細胞（膵がん）。 図９は、異なるドナー（LC267、LC268、LC269）に由来する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比での３つのＣＤ３４＋幹細胞由来好中球集団の細胞傷害性の結果を示す。結果は、異なるドナーに由来する幹細胞由来好中球が選択的細胞傷害性を有することを示す。エフェクター：ＳＣＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）、ＰＡＮＣ－１細胞（膵がん）およびＭＣＦ－１２Ｆ細胞（非がん細胞、正常な乳房上皮）。 図１０は、異なるドナー（LC252、LC253、LC254）に由来する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比での３つのＣＤ３４＋幹細胞由来好中球集団の細胞傷害性の結果を示す。結果は、異なるドナーに由来する幹細胞由来好中球が選択的細胞傷害性を有することを示す。エフェクター：ＳＣＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）、ＰＡＮＣ－１細胞（膵がん）およびＭＣＦ－１２Ｆ細胞（非がん細胞、正常な乳房上皮）。 図１１は、同じドナーに由来する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比でのドナー由来好中球の細胞傷害性の結果と共に、３つのＣＤ３４＋幹細胞由来好中球培養物の細胞傷害性の結果を示す。同じドナーに由来するＳＣＤＮおよびＤＤＮは、類似するＣＫＡレベルを有する。ＤＤＮとＳＣＤＮとの類似するＣＫＡの関係は、ドナーＬＣ２５３について、エフェクターの標的細胞に対する様々な比で維持された。エフェクター：ＳＣＤＮおよびＤＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）。 図１２は、同じドナーに由来する、およびエフェクターの標的細胞に対する様々な比での新鮮なドナー由来好中球の細胞傷害性の結果と共に、３つのＣＤ３４＋幹細胞由来好中球培養物の細胞傷害性の結果を示す。ＳＣＤＮおよびＤＤＮは、類似するＣＫＡレベルを有する。ＤＤＮとＳＣＤＮとの同じＣＫＡの関係は、ドナーＬＣ２５３について、エフェクターの標的細胞に対する様々な比で維持された。エフェクター：ＳＣＤＮおよびＤＤＮ；標的：ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）。 図１３は、経時的な自然由来好中球と幹細胞由来好中球との細胞傷害性の比較を示す。より高いＣＫＡ（ドナーLC269）が、ＤＤＮとＳＣＤＮとの間で維持される。エフェクター：ＳＣＤＮおよびＤＤＮ（３つの異なるＳＣＤＮおよびＤＤＮ培養物）；標的：ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）。
実施例１
ドナーの採用
ドナーは、実施例２に記載されるＣＫＡアッセイにおいて高レベルのがん殺傷活性（CKA）を示す好中球を有する確率に基づいて予備選択される。予備選択基準は、
・同意書に提供または試料採取に影響する重篤な医学的または精神状態にないこと；
・療法のために標的化されるがんの既往歴または家族歴がないこと；
・試料採取日以前の３ヶ月間に化学療法または放射線療法の履歴がないこと；
・１８～２４歳の年齢であること；
・任意選択により、男性であること（理論によって束縛されることを望むものではないが、男性由来好中球は、CKAアッセイにおいて試験した場合、最も高いレベルのCKAを示すと考えられる）；および
・任意選択により、血液型ＯまたはＲｈ－であること
を含む。
白血球（WBC）を、ドナーから約１８ｍｌのヒト血液を引き出すことによって収集する。血液を３つのＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）ＣＰＴチューブに分割し、２３℃で３５分間、１７５ｘｇで遠心分離する。単核細胞（MN）層を収集し、１５ｍｌの円錐チューブに移す。ＭＮ細胞を２３℃で５分間、４２０ｘｇで遠心分離し、１０ｍｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（DMEM）（Invitrogen、Carlsbad、CA）＋１０％ウシ胎仔血清（FBS）（Sigma.St. Louis、MO）で洗浄する。細胞を計数し、１．６ｘ１０6細胞／ｍｌの最終濃度となるように培地中に再懸濁する。
実施例２
ＣＫＡアッセイにおける抽出された顆粒球のＣＫＡの試験
細胞を、Ｔ２５フラスコ中のＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で８０％の集密度になるまで培養する。細胞株を、Ｔ７５ｃｍ2細胞培養フラスコ中の、以下の成分：１０％体積／体積のＦＢＳ、ペニシリン（Sigma.St. Louis、MO）、ストレプトマイシン（Sigma.St. Louis、MO）、およびＬ－グルタミン補給物（Sigma.St. Louis、MO）を添加したＤＭＥＭ中、３７℃、８％ＣＯ2で増殖させ、維持する。培養された膵がん細胞（例えば、American Type Culture Collection - United Kingdom (U.K.)、Guernsey、Ireland、Jersey and Liechtenstein、LGC Standards、Queens Road、Teddington、Middlesex TW11 0LY、UKから商業的に入手可能なCapan-2、ATCC HTB-80；Panc 10.05、ATCC CRL-2547；CFPAC-1、ATCC CRL-1918；HPAF-II、ATCC CRL-1997；SW 1990、ATCC CRL-2172；BxPC-3、ATCC CRL-1687；AsPC-1、ATCC CRL-1682；ATCC（登録商標）TCP-1026（商標）；SW1990、ATCC CRL-2172；SU.86.86、ATCC CRL-1837；BXPC-3、ATCC CRL-1687；Panc 10.05、ATCC CRL-2547；MIA-PaCa-2、ATCC CRL-1420；PANC-1、ATCC CRL-1469；またはATCC（登録商標）TCP-2060（商標））を分割し、培養フラスコ中で７０％の表面集密度に達するまで継代する。
細胞をトリプシン処理し、回収し、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅを用いて計数する。アッセイプレート（２４ウェル）に、２４ウェル平底プレート中、ウェルあたり８ｘ１０4個の膵がん細胞（例えば、膵管腺癌細胞）を播種する。プレートを、５％ＣＯ2中、３７℃で２４時間インキュベートする。細胞を、２．５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎを用いて４５分間標識する。新鮮な培地を細胞に添加し、それらをＣＯ2インキュベータに戻す。
５００μｌのＭＮ細胞懸濁液（８ｘ１０5個の顆粒球）を、膵がん細胞を２４時間増殖させた各ウェルに添加することによって、ＣＫＡアッセイを実行する。細胞を混合し、３９℃で２４時間、５％ＣＯ2中のインキュベータに入れる。２４時間のインキュベーション後、トリプシン処理によって細胞を回収し、遠心分離する。細胞を、１００μｌの冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に再懸濁した後、１２５μｌの０．４％Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅを添加する。細胞を、顕微鏡下で計数する（位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を使用する）。
このアッセイにおいて少なくとも７０％または少なくとも８０％のがん細胞を殺傷することができる（すなわち、それぞれ、少なくとも７０％のCKAまたは８０％のCKAを有する）顆粒球（例えば、好中球）は、がんの処置における使用にとって特に好適であると考えられる。
実施例３
造血細胞および好中球の表面電位の試験
電気泳動を使用して、電気泳動移動度を測定することによって造血細胞（例えば、造血幹細胞、および／または前駆細胞）および好中球における表面電位の変化を調査する。機械的剥離および培養基質からの収集によって、懸濁した細胞を培養物から収集する。収集された細胞を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび２９１ｍＭグルコースを含有する電気泳動緩衝溶液中に再分配し、方形ガラス電気泳動チャンバー中に導入する。電気泳動チャンバーにわたって２００ＶのＤＣを印加する。ＣＣＤカメラを備えた顕微鏡下で、３ｍＡで、細胞が固定した長さを通過するのに必要な時間を記録することによって、細胞の電気泳動速度、ｕを測定する。電気泳動移動度、μは、μ＝ｕｇＳ／Ｉ（式中、ｇは媒体の電導度であり、Ｓは電気泳動チャンバーの断面積であり、Ｉは電流である）によって算出される。それぞれの条件について、典型的には、少なくとも９回の読取りを行って、細胞の電気泳動移動度を算出する。
実施例４
末梢血からの造血幹細胞の抽出
同意を与える際に、ドナーは、ドナーに対してあり得る不快感を最小限にしながら、末梢造血幹細胞を回収するのを助けるために、顆粒球－コロニー刺激因子（G-CSF）および／または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、例えば、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（Amgen Inc. USAから商業的に入手可能）を与えられる。長期に持続する多能性幹細胞を同定するために、細胞表面ポリペプチドマーカーを使用する。好適には、マーカーは、ＣＤ３４+、ＣＤ５９+、Ｔｈｙ１+、ＣＤ３８low/-、Ｃ－ｋｉｔ-/low、およびｌｉｎ-を含んでもよい。
実施例５
造血細胞の拡張および分化
造血細胞（例えば、造血幹細胞）を、上清増殖因子懸濁液を使用して刺激して、より多くの幹細胞を発生させるか、または前駆細胞（例えば、骨髄性もしくは顆粒球前駆細胞）または顆粒球に分化させる。好適な好中球合成法は、Ｌｉｅｂｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２００４ Ｆｅｂ １；１０３（３）：８５２－９およびＣｈｏｉら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１１ Ｍａｒ；６（３）：２９６－３１３に開示されている。
プロトコールは、４つの主な段階：
・造血細胞の培養および増殖；
・高用量の顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、ヒト成長ホルモン（HGH）；セロトニン、ビタミンＣ、ビタミンＤ、グルタミン（Gln）、アラキドン酸、ＡＧＥ－アルブミン、インターロイキン－３（IL-3）、インターロイキン－８（IL-8）、インターロイキン－４（IL-4）、インターロイキン－６（IL-6）、インターロイキン－１８（IL-18）、ＴＮＦ－アルファ、Ｆｌｔ－３リガンド、トロンボポエチン、ウシ胎仔血清（FBS）、またはその組合せを用いた多能性骨髄性前駆細胞の短期的拡張；ならびに
・骨髄性前駆細胞の、好中球、好酸球、樹状細胞（DC）、ランゲルハンス細胞（LC）、マクロファージおよび破骨細胞への指向性分化
から構成される。
実施例６
細胞バンクの調製
造血幹細胞、それから取得可能な顆粒球前駆細胞および顆粒球を、低温凍結し、適切な細胞バンク中で保存する。
実施例７
固形腫瘍の処置のための患者における使用
保存された造血細胞（例えば、造血幹細胞またはそれから取得可能な顆粒球前駆細胞）、およびそれから分化した顆粒球（例えば、好中球）を、患者のがんの型、血液型（ABO、rhおよびHLA）、および／または遺伝学に基づいて、がん患者とマッチングする。また、患者を、ヒト白血球抗原（HLA）類似性に基づいてマッチングしてもよい。
患者を、以下を使用して処置する：
・患者への、顆粒球－コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、セロトニン、およびインターロイキンと一緒の造血細胞（造血幹細胞、および顆粒球前駆細胞を含む）のＩＶ輸注；または
・患者への、刺激された顆粒球前駆細胞（造血幹細胞から取得可能）のＩＶ輸注。理論によって束縛されることを望むものではないが、前記細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＫＡアッセイにおいて高いＣＫＡを有する顆粒球（例えば、好中球）に自然に分化すると考えられる；または
・造血細胞（例えば、造血幹細胞）から分化したＣＫＡアッセイにおいて高いＣＫＡを有する顆粒球（例えば、好中球）の直接ＩＶ輸注。
典型的には、細胞に、週あたり投与される２ｘ１０11の細胞容量を８週間にわたって週１回輸注する。療法の進行をモニタリングし、それに応じて投薬を適合させる。
実施例８
膵がんを有する患者の処置
メアリーは、６９歳で転移性膵管腺癌（PDAC）と診断される。外科手術は最早選択肢になく（切除不能）、ゲムシタビンは疾患進行の防止には不十分であり、アブラキサンまたはフォルフィリノックスは、彼女に残された時間を家族と共に楽しむことをできなくさせるであろう副作用のため、彼女の腫瘍学者の推奨によると適切ではない。メアリーの予後は、３～６ヶ月の生存であり、彼女が、近々生まれると期待されるその孫を見るのに十分なほど長く生きるのは絶望的である。
メアリーは、白血球輸注療法（LIFT）を試すよう勧められる。療法の潜在的な好適性を評価するために、病院はメアリーから２０ｍｌの血液を抽出し、それを、がん殺傷活性アッセイを使用する分析に送り、このアッセイは、彼女の顆粒球の膵がん殺傷活性が５％未満であると同定する。そのような低い読取り値は、彼女の体内の顆粒球の効能が改善されない場合、彼女を殺すであろう彼女のがんを撃退する彼女自身の自然免疫系の不十分性を示す。
メアリーの患者ノートおよびアッセイ結果を、好適ながん殺傷顆粒球マッチを見出すために使用する。メアリーの血液型はＡ型である。メアリーのプロファイルを、細胞バンクのための細胞データベースを使用して処理し、好適な顆粒球（低温凍結前に、実施例２のがん殺傷活性アッセイにおいて７０～９０％のがん殺傷活性（CKA）を示す）を同定する。顆粒球の低温凍結は、ＣＫＡの保持に役立ち、したがって、細胞を、さらに試験することなく病院（The Royal Marsden）に直接送付することができる。メアリーは、彼女の最初の処置のためにその週に訪問する予定である。病院は、細胞を適切に保存する。メアリーは、厳重な管理の下、１２月１３日にＣＫＡを有する２ｘ１０9個の顆粒球の１回目の輸注を受ける。メアリーは、３日後に病院に戻るよう勧められ、そこで彼女は超音波走査を受け、有意な腫瘍溶解を示し、腫瘍溶解症候群の兆候を示さない。医療チームは、顆粒球用量が２ｘ１０11に達するまで、３回の連続する処置セッションにわたって、それを徐々に増加させることを決定する。
超音波を、１月１７日に実行する；４回の処置の４週間の過程の１週後に完了し、完全な腫瘍破壊および瘢痕組織への変換を観察し、良好な治癒が起こる。ｉ）生検と並行して、メアリーの血液中の転移性がん細胞の存在を評価するため（がんの完全な消失を確認するため）；およびｉｉ）メアリーの顆粒球のがん殺傷活性を試験するため（寛解のリスクを示すため）に、メアリーの血液２０ｍｌを採取する。メアリーは、最初は毎月、次いで、６ヶ月毎に定期検査を受ける。
２年後、新しい腫瘍がメアリーの膵臓に発見される。彼女の主治医は、放射線療法を用いて腫瘍を処置し、単回高用量のＬＩＦＴを投与して、血液中に存在し得る全てのがん細胞が確実に破壊されるようにする。メアリーは、彼女とその家族が取り戻した人生を楽しみ、彼女は成長を見る機会を得る。
療法の後、細胞バンクからの造血細胞（例えば、造血幹細胞）を刺激してより多くの顆粒球（実施例２のアッセイを使用して試験した場合に所望のCKAを有する）を産生させ、ストックを補充する。かくして、類似する患者状況のために必要な顆粒球の十分なストックが確保される。
実施例９
ＭＴＴ「ＣＫＡアッセイ」
ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、黄色のテトラゾールであり、正に荷電し、生きている真核細胞に容易に浸透する。活発な代謝を示す生細胞は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存的オキシドリダクターゼミトコンドリア酵素により、ＭＴＴを、紫色のホルマザン生成物（１（Ｅ，Ｚ）－５－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－１，３－ジフェニルホルマザン）に変換し、５７０ｎｍ近くの最大吸光度を示す。細胞が死ぬとき、それらはＭＴＴをホルマザンに変換する能力を失い、かくして、色の形成は生細胞のみの有用かつ便利なマーカーとして役立つ。可溶化溶液を添加して、不溶性の紫色のホルマザン生成物を、着色溶液中に溶解する。この着色溶液の吸光度を、分光光度計によって５７０ｎｍの波長で測定することによって定量することができる。６９０ｎｍの参照波長の吸光を、５７０ｎｍ波長の吸光から差し引く。したがって、ＭＴＴアッセイを使用して、がん殺傷活性（CKA）、つまり、がん細胞に対する細胞傷害性を決定するための方法としてどれぐらい多くの生細胞が残存するかを測定した。
ＨｅＬａ標的細胞を調製するための方法
１日目：
１）ＨｅＬａ細胞（頑強型の子宮頸がん細胞）を培養し、それらが対数増殖期に達した時に回収した。
２）１００００個のＨｅＬａ細胞（標的細胞）を、最終容量１００μＬで９６ウェル平底プレートの各ウェルに添加した。
３）標的細胞を静置して一晩接着させた後、白血球（エフェクター細胞）を添加し、全ての実験条件を３組設定した。
２日目：
４）エフェクター細胞を、様々な比（例えば、１：１、５：１、１０：１、５０：１のエフェクターの標的細胞に対する比）で標的細胞に添加した。
５）細胞を静置して３７℃で１６～２４時間インキュベートした。
６）標的細胞のみ、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘの存在下の標的細胞も、それぞれ、０％および１００％の細胞傷害性に関する対照として３組播種した。
所望のインキュベーション時間の後：
１）ウェルをＰＢＳで２回洗浄して、エフェクター細胞および死滅した標的細胞を除去した。
２）培養培地を用いてキット溶液を１０倍に溶解することにより、ＭＴＴ溶液を調製した、すなわち、１００ウェルあたり、１０００μＬ（１ｍＬ）のＭＴＴストック（キット中に提供される）を取り、９０００μＬ（９ｍＬ）の培養培地（RPMI-1640）を添加した。
３）ウェルあたり１００μｌの工程２で調製されたＭＴＴ溶液を添加した。
４）これを４時間インキュベートした。
５）ＭＴＴ溶液を全てのウェルから除去し、１００μｌ／ウェルの溶媒を添加した（キット中に提供される）。
６）必要となった場合にピペッティングによってホルマザン結晶を溶解し、プレートを５７０および６９０ｎｍで読み取った。６９０ｎｍで測定したバックグラウンド吸光度を、５７０ｎｍで測定した吸光度から差し引いた。
ドナー好中球における可変的ＣＫＡの証明
匿名の血液ドナーに由来する白血球コーンを選択し、好中球を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ分離（Oh H, Siano B, Diamond S. Neutrophil Isolation Protocol. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 2008;（17）745）によって単離した。これらの好中球を、１：１および５：１のエフェクターの標的細胞に対する比で上記のＭＴＴアッセイにおいて使用した。
図１は、異なるドナーに関してＭＴＴによって記録された細胞傷害性パーセンテージを示す。１：１と５：１の比でドナー間に差異がある。結論として、ＭＴＴアッセイは、異なるドナーに由来する好中球間でのＣＫＡにおける差異を証明することができる。
実施例１０
幹細胞由来好中球のＣＫＡの証明
ＣＤ３４＋幹細胞に由来する好中球の培養
本発明者らは、Ｔｉｍｍｉｎｓ ＮＥ、Ｐａｌｆｒｅｙｍａｎ Ｅ、Ｍａｒｔｕｒａｎａ Ｆ、Ｄｉｅｔｍａｉｒ Ｓ、Ｌｕｉｋｅｎｇａ Ｓ、Ｌｏｐｅｚ Ｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃａｌｅ ｅｘ ｖｉｖｏ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｆｒｏｍ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． ２００９；１０４（４）：８３２－４０によって記載されたプロトコールを使用して、ＣＤ３４タンパク質を発現する臍帯血由来幹細胞に由来する好中球を培養した。
得られた培養物を、蛍光活性化細胞選別（FACS）によってＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ１５マーカーを使用して好中球含量について試験した。本発明者らはまた、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）アッセイ（Sigma-Aldrichから商業的に入手可能なキットおよびプロトコール、カタログ番号840W-1KT）の使用により、活性酸素種（ROS）の産生、より具体的には、スーパーオキシドアニオン（Ｏ2 -）の産生も測定した。
ＲＯＳ活性の差異が幹細胞由来好中球の年齢に基づいて見出されたため（データは示されない）、本発明者らは、一貫性／同等性について同じ日に３つの幹細胞バッチを数えた。ＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ１５＋細胞の割合のＦＡＣＳ由来計数の結果を、表１に列挙する。
Figure 2023052704000001
ＣＤ３４＋由来好中球のＣＫＡの証明
幹細胞由来好中球（バッチ008A、709Aおよび915）を、ＨｅＬａ標的細胞を使用するＣＫＡ ＭＴＴアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した（実施例９を参照）。エフェクターの標的細胞に対する比は、ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１５＋に基づく。結果を図２にまとめるが、これは、ＣＤ３４＋幹細胞由来好中球が、ＨｅＬａ細胞のＣＫＡアッセイにおいて細胞傷害性を示すこと、およびその結果が異なるドナー間で異なるということを示す。バッチ００８Ａは、他のバッチと同時に調製され、同じように培養されるにもかかわらず、１０：１までのエフェクターの標的に対する比でバッチ９１５および７０９Ａよりも一貫して低い細胞傷害性を示す。
この結果は、異なるドナーに由来する幹細胞を、ａ）がん殺傷能力を示す好中球を産生するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させることができること、およびｂ）このがん殺傷活性が供給源ドナーによって異なることを示す。
この結果は、自然免疫系によるがん殺傷活性（CKA）が個体によって異なり、白血球コーンによりドナーから直接採取した好中球において見られるのと同じＣＫＡの先天的変動が、ドナーの幹細胞中にも認められるという事実を支持する。自然免疫系の高いがん殺傷活性が示されたドナーを選択し、ｅｘ ｖｉｖｏでの拡張および分化のためにその造血細胞（すなわち、造血幹細胞）を使用することにより、がんの処置において使用するための高いがん殺傷活性を示す白血球を含む細胞バンクを創出することができる。
実施例１１
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ「ＣＫＡアッセイ」
ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＤＰ Ａｎａｌｙｚｅｒシステム（登録商標）を使用し、製造業者の指示書に従った。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍは、電気インピーダンスを測定することによって連続的に細胞表現型の変化を、標識を使用せずに動的にモニタリングすることができるリアルタイム細胞分析装置である。このシステムは、組織培養Ｅプレートの各ウェルの底部に組み込まれた互いに咬合する金微小電極を使用してインピーダンスを測定する。インピーダンス測定値は、Ｃｅｌｌ Ｉｎｄｅｘ（CI）値として表示され、生存能力を含む、細胞の生物学的状態に関する定量的情報を提供する。細胞生存能力のインピーダンスに基づくモニタリングは、細胞数およびＭＴＴに基づく読出し値と相関する。インピーダンスに基づく細胞生存能力の測定値の動的態様は、好中球を使用して細胞傷害効果を誘導する場合に必要な時間的情報を提供する。特に、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍはまた、細胞傷害および細胞死アッセイにおいて、最も低いＣＩ値によって示される、好中球がその最大効果を達成する場合（そのようなデータが望まれる場合）の最適な時点を正確に示すこともできる。典型的には、６，０００個のがん細胞（HeLaもしくはPANC-1）または健康な、非がん性細胞（MCF-12F）を、１６ウェルプレートの底部に入れる（システムは、最大３個のプレートを同時に読み取ることができる）。細胞をウェルに添加した最初の数時間については、インピーダンスが急速に増大する。これは、懸濁液から落下し、電極上に沈着し、接着斑を形成する細胞によって引き起こされる。添加される細胞の初期数が低く、ウェルの底部に空の空間がある場合、細胞は増殖し、ＣＩの徐々にであるが、安定的な増大を引き起こすであろう。細胞が集密に達した時、ＣＩ値は、バルク媒体に接近できる電極表面積が最早変化しないという事実を反映して、プラトーに達する。「正規化点」と呼ばれるこの点で、好中球を添加する（典型的には、変化するエフェクター：標的比で）。細胞溶解のパーセンテージは、簡単な式：細胞溶解のパーセンテージ＝（（細胞指数3L9 7@/■
れる。
典型的には、アッセイを最大７０時間実行し、実施例１２～２０に提示される結果を生成するのに使用した。実施例１２～１９に提示される結果は、それぞれの細胞型についてアッセイ中に達成された最大細胞溶解％である。
図３～１３に示される比は、エフェクター（例えば、好中球）の標的（例えば、がん細胞）に対する比である。典型的には、５：１または１０：１の好中球のがん細胞に対する比を使用した。
実施例１２
ドナー由来好中球における可変的ＣＫＡの証明
図３は、異なるドナーに関してｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイによって記録された最大細胞傷害性パーセンテージを示す。このアッセイはまた、１：１と５：１の比（好中球のHeLa細胞に対する比）でのドナー間の差異を示す。結論として、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイも、異なるドナーに由来する好中球間でのＣＫＡの差異を証明することができ、これが、顆粒球のがん細胞に対する様々な比にわたって一貫していたことを証明することができる。
このアッセイを、最大４０時間にわたって行った。
実施例１３
異なるがん細胞型上でのドナー由来好中球のＣＫＡの証明
５人の異なるドナーから単離された好中球を、ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）とＰＡＮＣ－１細胞（膵がん）の両方に対するＣＫＡについて試験した。
図４は、それぞれのがん細胞型に対する、および異なるドナーに関するＣＫＡアッセイ（xCELLigenceアッセイ）により記録された最大細胞傷害性パーセンテージを示す。膵がん細胞に対する細胞傷害性パーセンテージは、より高く、膵がんが典型的には、処置が最も難しいがんの１つであることを考えれば、驚くべきことであった。再度、異なるドナーに由来するドナー由来好中球（DDN）は、示差的なＣＫＡを有することが示された。
実施例１４
がん細胞に対するドナー由来好中球のＣＫＡの選択性の証明
５人の異なるドナーから単離された好中球を、ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）、ＰＡＮＣ－１細胞（膵がん）ならびに非がんＭＣＦ－１２Ｆ細胞（正常乳房上皮細胞）の両方に対するＣＫＡについて試験した。
図５は、ＨｅＬａおよびＰＡＮＣ－１がん細胞株と、ＭＣＦ－１２Ｆ非がん細胞株に対する各ドナーに由来する好中球に関するＣＫＡアッセイ（xCELLigenceアッセイ）により記録された最大細胞傷害性パーセンテージを示す。有利なことに、ＤＤＮは、がん細胞について高度に選択的であり、非がん細胞に対しては最小限の影響を示した。
実施例１５
ＣＤ３４＋幹細胞に由来する好中球の培養
臍帯血由来幹細胞に由来する好中球を培養したさらなる結果を、好中球を臍帯血から単離されたＣＤ３４＋造血幹細胞から生成することができることを示す、表２に提示する。ＣＤ３４＋は、造血幹細胞マーカーである。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１５は、成熟好中球マーカーである。
Figure 2023052704000002
実施例１６
ＣＤ３４＋幹細胞由来好中球（SCDN）のＣＫＡの証明
結果は、ＣＤ３４＋幹細胞由来好中球のさらなる集団を用いるｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイによって得られ（図６）、上記のＭＴＴアッセイによって得られた結果と一致していた。ＳＣＤＮ（ex vivoで生成された）は再度、示差的なＣＫＡを有することが示され、培養物５は低いＣＫＡの好中球を示し、培養物１は高いＣＫＡの好中球を示した。
実施例１７
異なるがん細胞型上での幹細胞由来好中球のＣＫＡの証明
３人の異なるドナーから単離されたＣＤ３４＋幹細胞由来好中球を、ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）とＰＡＮＣ－１細胞（膵がん）の両方に対するＣＫＡについて試験した。
図７は、それぞれのがん細胞型に対する、ならびにドナーＬＣ２６７、ＬＣ２６８およびＬＣ２６９に関するＣＫＡアッセイ（xCELLigenceアッセイ）により記録された最大細胞傷害性パーセンテージを示す。ＤＤＮについて得られた結果と同様（実施例１４を参照）、膵がんに対する細胞傷害性パーセンテージは、ＨｅＬａ細胞について観察されたものよりも高かった（５：１と１０：１の両方の、エフェクターの標的細胞に対する比で）。異なるドナーに由来するＳＣＤＮも、示差的なＣＫＡを有することが示された。このアッセイを、最大４５時間にわたって行った。
同様の結果が、ドナーＬＣ２５２、ＬＣ２５３およびＬＣ２５４から得られたＳＣＤＮについても得られた（図８）。
実施例１８
がん細胞に対する幹細胞由来好中球のＣＫＡの選択性の証明
３人の異なるドナーのＣＤ３４＋幹細胞に由来する好中球を、ＨｅＬａ細胞（子宮頸がん）、ＰＡＮＣ－１細胞（膵がん）ならびに非がんＭＣＦ－１２Ｆ細胞（正常乳房上皮細胞）の両方に対するＣＫＡについて試験した。
図９は、ドナーＬＣ２６７、ＬＣ２６８およびＬＣ２６９に関するそれぞれのがん細胞型および非がん細胞型に対するＣＫＡアッセイ（xCELLigenceアッセイ－最大４５時間にわたって行った）により記録された最大細胞傷害性パーセンテージを示す。有利なことに、ＳＣＤＮは、がん細胞について高度に選択的であり、非がん細胞に対しては最小限の影響を示した。同じドナーに由来するＤＤＮを示す図３と同様、ドナーＬＣ２６９に由来するＳＣＤＮが、最も高いＣＫＡを有し、ＬＣ２６８は２番目であり、ＬＣ２６７は最も低いＣＫＡを示した。かくして、ＣＫＡはエピジェネティックに定義される形質というよりもむしろ、遺伝的に定義されると結論付けることができる。
同様の結果が、ドナーＬＣ２５２、ＬＣ２５３およびＬＣ２５４のＳＣＤＮについても得られた（図１０）。
実施例１９
好中球のＣＫＡが遺伝的にコードされることの証明
３人の異なるドナーから単離された好中球（ＤＤＮ）、ならびに同じドナーのＣＤ３４＋幹細胞に由来するＳＣＤＮを、ＣＫＡについて試験した。
図１１は、ＤＤＮおよびＳＣＤＮに関するドナーＬＣ２５２、ＬＣ２５３およびＬＣ２５４のＨｅＬａ細胞に対するＣＫＡアッセイ（xCELLigenceアッセイ－最大５０時間にわたって行った）により記録された最大細胞傷害性パーセンテージを示す。驚くべきことに、ＳＣＤＮは、同じドナーに由来するＤＤＮのものと同様に高いＣＫＡを示したが、これは再度、ＣＫＡが遺伝子レベルでコードされることを示している。図１０と同様、ドナーＬＣ２５３は最も高いＣＫＡを有する好中球（およびＳＣＤＮ）を提供したが、ドナーＬＣ２５２およびＬＣ２５４は、より低いＣＫＡを有する好中球（およびＳＣＤＮ）を提供した。
これは、高いＣＫＡを有する好中球（例えば、ＤＤＮ）を有することがわかったドナーを、同様に高いＣＫＡを有する好中球（例えば、ＳＣＤＮ）に分化させることができるＣＤ３４＋幹細胞の供給源として使用することもできることを示す。
同様の結果が、ドナーＬＣ２６７、ＬＣ２６８およびＬＣ２６９のＳＣＤＮについても得られた（図１２－最大４５時間にわたって行った）。
実施例２０
ＳＣＤＮがＤＤＮよりも迅速にがん細胞を殺傷することの証明
ドナーＬＣ２６７、ＬＣ２６８、およびＬＣ２６９のＳＣＤＮおよびＤＤＮのＣＫＡを、最大４５時間の期間で決定した。このアッセイを、実施例１１に従って行った。
驚くべきことに、結果（図１３）は、ＳＣＤＮが同じドナーに由来するＤＤＮよりも迅速にがん細胞を殺傷することを示す。ドナーＬＣ２６９のＳＣＤＮは、特に迅速ながん殺傷効能を示し、約１８時間で約５０％のがん細胞を殺傷し（ＤＤＮについての３５％と比較して）、ＳＣＤＮの最大半量殺傷は１０時間以内に起こった（ＤＤＮについてはこの時点で無視できるほどの殺傷であったのと比較して）。
実施例２１
高密度好中球の単離
１０ｍｌのヘパリン処理した（２０Ｕ／ｍｌ）ヒト血液を、塩水中の等量の３％デキストランＴ５００と混合し、室温で３０分間インキュベートして、赤血球を沈降させる。１０ｍｌのスクロース１．０７７ｇ／ｍｌを用いて５０ｍｌの円錐ポリプロピレンチューブを調製し、１．０７７ｇ／ｍｌのスクロース層の頂部に白血球に富む上清をゆっくりと層化させた後、ブレーキを使用せずに室温で３０分間、４００ｘｇで遠心分離する。高密度好中球（HDN）がペレット中に出現する。低密度好中球（LDN）は、１．０７７ｇ／ｍｌのスクロース層と血漿との間の境界面に単球およびリンパ球と共に同時精製される。
ＨＤＮを、本明細書に記載のＣＫＡアッセイにおいて試験することができる。造血細胞は、ＨＤＮを有するドナーから好適に取得される。
実施例２２
人工多能性幹細胞（iPSC）の高いＣＫＡを有する好中球への分化
高いＣＫＡを有する好中球を含むドナーを同定する。体細胞（例えば、線維芽細胞）をドナーから単離し、ｉＰＳＣの培養物を確立するために使用する。ｉＰＳＣを、例えば、Ｓｗｅｅｎｅｙ ＣＬ、Ｍｅｒｌｉｎｇ ＲＫ、Ｃｈｏｉ Ｕ、Ｐｒｉｅｌ ＤＢ、Ｋｕｈｎｓ ＤＢ、Ｗａｎｇ ＨおよびＭａｌｅｃｈ ＨＬ、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１４；１１２４：１８９－２０６、およびＳｗｅｅｎｅｙら（２０１６）、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、３４（６）、１５１３－１５２６（その教示は参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されたプロトコールを使用して、成熟好中球に分化させる。
得られる成熟好中球は、同じドナーに由来するＨＳＣに由来するＤＤＮおよびＳＣＤＮのものと類似するＣＫＡレベルを有することが示される（MTTアッセイとxCELLigenceアッセイの両方によって試験される場合）。
続いて、成熟好中球を、ｉＰＳＣが元々誘導された、いかなる免疫応答も誘発しないドナーに注入する。
上記の明細書に記載された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な改変および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかとなるであろう。本発明を特定の好ましい実施形態と関連して記載してきたが、特許請求される発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、本発明を実行するための記載された様式の様々な改変は、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連する分野の当業者には自明であり、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
節
１． ａ．少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位；および
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を特徴とする顆粒球を形成するように分化する造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
２． ａ．少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度；および
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を特徴とする顆粒球を形成するように分化する造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
３． ａ．ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性；ならびに
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を特徴とする顆粒球を形成するように分化する造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
４． 造血細胞が、
ａ．少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度；ならびに／または
ｂ．ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性
をさらに特徴とする顆粒球を形成するように分化する、節１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
５． 顆粒球が、ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびにプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；およびＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性を特徴とする、節３または４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
６． 細胞培養物が造血細胞について富化される、節１～５のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
７． ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物中の少なくとも７０％の細胞が造血細胞である、節１～６のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
８． 造血細胞がドナー、好ましくは、ヒトドナーから取得可能である、節１～７のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
９． ドナーが男性ドナーである、節８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
１０． ドナーが１８～２５歳の年齢である、節８または９に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
１１． 造血細胞が、１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する、および／または節１、２もしくは３で定義された特徴ｂと比較した場合、がん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞よりも高い表面電位を有する、節１～１０のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
１２． 造血細胞が、少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも２．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも３．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する、節１～１１のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
１３． 顆粒球が、少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも２．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも３．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する、節１～１２のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
１４． 顆粒球が好中球である、節１～１３のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
１５． がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球の表面電位を測定すること；および
ｂ．測定された表面電位が少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される場合、前記ドナーから造血細胞を選択すること
を含む方法。
１６． がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球の密度を測定すること；および
ｂ．顆粒球の測定された密度が少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌである場合、前記ドナーから造血細胞を選択すること
を含む方法。
１７． がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球上でのｔｏｌｌ様受容体；プログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／またはＣＸＣＲ２の発現または活性を検出すること；ならびに
ｂ．ｔｏｌｌ様受容体が発現されるか、もしくは活性である；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２が発現されないか、もしくは不活性である場合、前記ドナーから造血細胞を選択すること
を含む方法。
１８． がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．造血細胞の表面電位を測定すること；および
ｂ．１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する、および／またはがん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞よりも高い表面電位を有する造血細胞を選択すること
を含む方法。
１９． がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するための方法であって、
ａ．造血細胞の密度を測定すること；および
ｂ．１．０７７ｇ／ｍｌ未満の密度を有する、および／またはがん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞よりも高い密度を有する造血細胞を選択すること
を含む方法。
２０． 造血細胞が、少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する、節１５～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１． 造血細胞が、少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも２．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃまたは少なくとも３．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する、節１５～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２． 表面電位が電気泳動によって決定される、節１５～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３． 節１５～１９のいずれか１つの工程ｂにおいて選択されない造血細胞を廃棄することをさらに含む、節１５～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４． 造血細胞が造血幹細胞である、節１５～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５． 造血細胞が、共通骨髄性前駆細胞、骨髄芽球、Ｎ．前骨髄球、Ｎ．骨髄球、Ｎ．後骨髄球、Ｎ．好中球桿状核球、またはその組合せなどの顆粒球前駆細胞である、節１５～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６． 顆粒球が好中球である、節１５～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７． 造血細胞を顆粒球に分化させることをさらに含む、節１５～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８． 造血細胞がドナー、好ましくは、ヒトドナーから取得可能である、節１６～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９． ドナーが男性ドナーである、節１５～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０． ドナーが１８～２５歳の年齢である、節１５～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１． がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．ドナーから取得可能な顆粒球と、細胞株とを混合して、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
ｃ．前記混合物中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること；および
ｄ．前記顆粒球が混合物中の少なくとも７０％のがん細胞を殺傷する場合、前記ドナーから造血細胞を選択すること
を含む方法。
３２． がんを処置するのに好適である顆粒球に分化させることができる細胞を選択するための、造血細胞の表面電位の使用であって、１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ未満の電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する、および／またはがん細胞を殺傷する能力が低下した顆粒球を形成するように分化する、それ以外は同一の造血細胞の表面電位よりも表面電位が高い、使用。
３３． 造血細胞が、少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、または少なくとも２．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、または少なくとも２．５μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃ、または少なくとも３．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位を有する、節３２に記載の使用。
３４． 膵がんの処置における使用にとって好適な顆粒球を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．顆粒球と、膵がん細胞株とを混合して、混合物を形成すること；
ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
ｃ．前記混合物中で殺傷された膵がん細胞の％を測定すること；および
ｄ．混合物中の少なくとも７０％の膵がん細胞を殺傷する顆粒球を選択すること
を含む方法。
３５． 膵がん細胞株が、膵管腺癌細胞株である、節３４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
３６． がんの処置における使用にとって好適な顆粒球を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．顆粒球と、複数の異なるがん細胞株とを混合して、複数の混合物を提供すること；
ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
ｃ．前記混合物中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること；および
ｄ．顆粒球が混合物中の少なくとも７０％のがん細胞を殺傷する場合、がん細胞株と同じ型／サブセットのがんの処置における使用にとって好適であるとして顆粒球を選択すること
を含む方法。
３７． 混合物中の７０％未満のがん細胞を殺傷する顆粒球を廃棄することをさらに含む、節３４～３６のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
３８． 顆粒球がドナー、好ましくは、ヒトドナーから取得可能である、節３４～３７のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
３９． 顆粒球が、前記方法において使用されるがん細胞株と異なる型／サブセットのがんを有する対象から取得可能である、節３４～３８のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
４０． がん細胞株が、膵がん細胞株、肝臓がん細胞株、食道がん細胞株、胃がん細胞株、子宮頸がん細胞株、卵巣がん細胞株、肺がん細胞株、膀胱がん細胞株、腎臓がん細胞株、脳腫瘍細胞株、前立腺がん細胞株、骨髄腫のがん細胞株、非ホジキンリンパ腫（NHL）細胞株、喉頭がん細胞株、子宮がん細胞株、または乳がん細胞株から選択される１つまたは複数である、節３４～３９のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
４１． 選択された顆粒球が取得可能であるドナーから造血細胞を取得することをさらに含む、節３８～４０のいずれか１つに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
４２． 節３４～４１のいずれか１つに記載の方法によって取得可能な顆粒球。
４３． 節１～１４のいずれか１つに記載の造血細胞、または節１５～３１のいずれか１つに記載の方法に従って取得可能な造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物を顆粒球に分化させることを含む方法。
４４． 節４３に記載の方法によって取得可能な顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物であって、
ａ．少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位；および
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を有する顆粒球に関して富化された細胞培養物。
４５． 節４３に記載の方法によって取得可能な顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物であって、
ａ．少なくとも１．０７７ｇ／ｍｌの密度；および
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を有する顆粒球に関して富化された細胞培養物。
４６． 節４３に記載の方法によって取得可能な顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物であって、
ａ．ｔｏｌｌ様受容体の発現もしくは活性；ならびに／またはプログラム細胞死１（PD-1）受容体；ＣＤ１１５；ＣＤ２２４；ＣＸＣＲ１；および／もしくはＣＸＣＲ２の発現の非存在もしくは不活性；ならびに
ｂ．がん細胞を殺傷する能力
を有する顆粒球に関して富化された細胞培養物。
４７．
ａ．造血細胞または顆粒球；および
ｂ．顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、増殖ホルモン；セロトニン、ビタミンＣ、ビタミンＤ、グルタミン（Gln）、アラキドン酸、ＡＧＥ－アルブミン、インターロイキン、ＴＮＦ－アルファ、Ｆｌｔ－３リガンド、トロンボポエチン、ウシ胎仔血清（FBS）、またはその組合せ
を含む医薬組成物。
４８． がんの処置における使用のための、節１～１４のいずれか１つに記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４２に記載の顆粒球、または節４４～４６に記載の顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４７に記載の医薬組成物。
４９． がんの処置のための薬剤の製造における、節１～１４のいずれか１つに記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４２に記載の顆粒球、または節４４～４６のいずれか１つに記載の顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４７に記載の医薬組成物の使用。
５０． 節１～１４のいずれか１つに記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４２に記載の顆粒球、または節４４～４６のいずれか１つに記載の顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４７に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんを処置するための方法。
５１． がんが固形腫瘍がんである、節１～１４のいずれか１つに記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４２に記載の顆粒球、または節４４～４６のいずれか１つに記載の顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または使用のための節４７に記載の医薬組成物、節４８～５０のいずれか１つに記載の使用または方法。
５２． がんが膵がん、肝臓がん、食道がん、胃がん、子宮頸がん、卵巣がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、脳腫瘍、前立腺がん、骨髄腫のがん、非ホジキンリンパ腫（NHL）、喉頭がん、子宮がん、または乳がんのうちの１つまたは複数である、節１～１４のいずれか１つに記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４２に記載の顆粒球、または節４４～４６のいずれか１つに記載の顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または使用のための節４７に記載の医薬組成物、節４８～５０のいずれか１つに記載の使用または方法。
５３． 節１～１４のいずれか１つに記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４２に記載の顆粒球、または節４４～４６のいずれか１つに記載の顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４７に記載の医薬組成物を用いた処置のための対象を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ．前記対象に由来する顆粒球と、がん細胞株とを混合すること；
ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
ｃ．前記混合物中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること；および
ｄ．対象に由来する顆粒球が混合物中の７０％未満のがん細胞を殺傷する場合、節１～１４のいずれか１つに記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４２に記載の顆粒球、または節４４～４６のいずれか１つに記載の顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４７に記載の医薬組成物を用いた処置のために前記対象を選択すること
を含む方法。
５４． 対象に由来する顆粒球が、混合物中の５０％未満または２５％未満（好ましくは、１０％または５％未満）のがん細胞を殺傷する場合、前記対象が処置のために選択される、節５３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
５５． 節１～１４のいずれか１つに記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４２に記載の顆粒球、または節４４～４６のいずれか１つに記載の顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４７に記載の医薬組成物を含む細胞バンク。
５６．
ａ．節１～１４のいずれか１つに記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４２に記載の顆粒球、または節４４～４６のいずれか１つに記載の顆粒球のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または節４７に記載の医薬組成物；および
ｂ．医学におけるその使用のための指示書
を含むキット。
５７． 前記指示書が、がん、好ましくは、膵がんの処置におけるその使用のためのものである、節５６に記載のキット。

Claims (28)

  1. がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を取得するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
    ａ．がん細胞株と、ドナーから取得可能な顆粒球とを接触させて、試験試料を形成し、前記試験試料をインキュベートすること；および
    ｂ．試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が、同じ型のがん細胞株および異なるドナーから取得可能な顆粒球を含む対照試料中で殺傷されたがん細胞の％よりも高い場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること
    を含む方法。
  2. がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を取得するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
    ａ．ドナーから取得可能な顆粒球と、がん細胞株とを混合して、混合物を形成すること；
    ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
    ｃ．前記試験試料中で殺傷されたがん細胞の％を測定すること；および
    ｄ．前記顆粒球が試験試料中の少なくとも５％のがん細胞を殺傷する場合、前記ドナー由来試料から造血細胞を取得すること
    を含む方法。
  3. 造血細胞が、造血幹細胞である、請求項１または２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  4. 造血細胞が、共通骨髄性前駆細胞、骨髄芽球、Ｎ．前骨髄球、Ｎ．骨髄球、Ｎ．後骨髄球、Ｎ．好中球桿状核球、またはその組合せなどの顆粒球前駆細胞である、請求項１または２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  5. 造血細胞が、前記ドナーの体細胞から取得可能な人工多能性幹細胞である、請求項１または２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  6. 膵がんの処置における使用にとって好適な顆粒球を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
    ａ．顆粒球と、膵がん細胞株とを混合して、混合物を形成すること；
    ｂ．前記混合物をインキュベートすること；
    ｃ．前記混合物中で殺傷された膵がん細胞の％を測定すること；および
    ｄ．混合物中の少なくとも５％の膵がん細胞を殺傷する顆粒球を選択すること
    を含む方法。
  7. がん細胞を選択的に殺傷する顆粒球を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
    ａ．がん細胞株と、ドナーから取得可能な顆粒球とを接触させて、試験試料を形成し、前記試験試料をインキュベートすること；および
    ｂ．試験試料中で殺傷されたがん細胞の％が、非がん細胞株および同じドナーから取得可能な顆粒球を含む対照試料中で殺傷された非がん細胞の％よりも高い場合、がん細胞について選択的であるとして前記顆粒球を選択すること
    を含む方法。
  8. がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
    ａ．ドナーから取得可能な顆粒球の細胞表面電荷を測定すること；および
    ｂ．前記顆粒球が対照顆粒球と比較した場合、より高い正の細胞表面電荷を有する場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること
    を含む方法。
  9. がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
    ａ．ドナーから取得可能な試料中の正の細胞表面電荷を有する顆粒球の濃度を測定すること；および
    ｂ．正の細胞表面電荷を有する前記顆粒球の濃度が、異なるドナーに由来するそれ以外は同一の対照試料中の正の細胞表面電荷を有する顆粒球の濃度よりも高い場合、前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること
    を含む方法。
  10. がんの処置における使用にとって好適な造血細胞を選択するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
    ａ．第１のドナーから取得可能な顆粒球の細胞表面電荷を測定すること；
    ｂ．対照顆粒球と比較した場合、より高い正の細胞表面電荷を有する前記第１のドナーから取得可能な顆粒球を同定すること；
    ｃ．工程ｂ．で同定された顆粒球の濃度を測定すること；
    ｄ．工程ｃ．で測定された前記顆粒球の濃度と、第２の（またはさらなる）ドナーから取得可能な顆粒球の濃度とを比較することであって、前記第２の（またはさらなる）ドナーに由来する顆粒球が、対照顆粒球と比較した場合、より高い正の細胞表面電荷を有する、比較すること；および
    ｅ．比較が、前記第２の（またはさらなる）ドナーから取得可能な前記顆粒球の濃度と比較した場合に前記第１のドナーから取得可能な前記顆粒球のより高い濃度を同定する場合、前記第１のドナーに由来する試料から造血細胞を取得すること
    を含む方法。
  11. 顆粒球が、負に荷電したナノプローブまたはナノ粒子によって接触され、好ましくは、前記顆粒球が前記接触後に単離される、請求項８～１０のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  12. がん細胞株が、膵がん細胞株、肝臓がん細胞株、食道がん細胞株、胃がん細胞株、子宮頸がん細胞株、卵巣がん細胞株、肺がん細胞株、膀胱がん細胞株、腎臓がん細胞株、脳腫瘍細胞株、前立腺がん細胞株、骨髄腫のがん細胞株、非ホジキンリンパ腫（NHL）細胞株、喉頭がん細胞株、子宮がん細胞株、または乳がん細胞株から選択される１つまたは複数である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  13. がん細胞株が、膵がん細胞株である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  14. がん細胞株が膵管腺癌細胞株であり、好ましくは、がん細胞株がＰＡＮＣ－１細胞株である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  15. 顆粒球が好中球である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  16. 混合物中の５％未満のがん細胞を殺傷する顆粒球を廃棄することをさらに含む、請求項６もしくは７または１２～１５のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  17. 選択された顆粒球が取得可能である前記ドナーに由来する試料から造血細胞を取得することをさらに含む、請求項６もしくは７または１２～１６のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  18. 好ましくは、造血細胞が正に荷電した細胞表面を有する、請求項１～５、８～１５または１７のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な造血細胞またはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
  19. 好ましくは、顆粒球が正に荷電した細胞表面を有する、請求項６もしくは７もしくは１２～１７のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な、または請求項１８に記載の造血細胞もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物から分化した顆粒球またはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物。
  20. 造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物であって、前記造血細胞が、
    ａ．少なくとも１．０μｍ．ｃｍ／ｖｏｌｔ．ｓｅｃの電気泳動移動度によって規定される表面電位および／または１．０７７ｇ／ｍｌより高い密度；ならびに
    ｂ．がん細胞を殺傷する能力
    を特徴とする顆粒球を形成するように分化する、細胞培養物。
  21. ａ．請求項１８に記載の造血細胞もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項１９に記載の顆粒球もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または請求項２０に記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物；および
    ｂ．顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、増殖ホルモン；セロトニン、ビタミンＣ、ビタミンＤ、グルタミン（Gln）、アラキドン酸、ＡＧＥ－アルブミン、インターロイキン、ＴＮＦ－アルファ、Ｆｌｔ－３リガンド、トロンボポエチン、ウシ胎仔血清（FBS）、またはその組合せ
    を含む医薬組成物。
  22. ａ．請求項１８に記載の造血細胞もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項１９に記載の顆粒球もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項２０に記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または請求項２１に記載の医薬組成物；および
    ｂ．医学におけるその使用のための指示書
    を含むキット。
  23. がんの処置における使用のための、請求項１８に記載の造血細胞もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項１９に記載の顆粒球もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項２０に記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項２１に記載の医薬組成物、または請求項２２に記載のキット。
  24. がんの処置のための薬剤の製造における、請求項１８に記載の造血細胞もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項１９に記載の顆粒球もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項２０に記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項２１に記載の医薬組成物、または請求項２２に記載のキットの使用。
  25. 請求項１８に記載の造血細胞もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項１９に記載の顆粒球もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項２０に記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または請求項２１に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんの処置のための方法。
  26. がんが固形腫瘍がんである、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の造血細胞もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、医薬組成物、または使用のためのキット、使用または方法。
  27. がんが、膵がん、肝臓がん、食道がん、胃がん、子宮頸がん、卵巣がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、脳腫瘍、前立腺がん、骨髄腫のがん、非ホジキンリンパ腫（NHL）、喉頭がん、子宮がん、または乳がんのうちの１つまたは複数である、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の造血細胞もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、顆粒球もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または使用のための医薬組成物、使用または方法。
  28. 請求項１８に記載の造血細胞もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項１９に記載の顆粒球もしくはそのｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、請求項２０に記載の造血細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物、または請求項２１に記載の医薬組成物を含む細胞バンク。
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