CN117815369A

CN117815369A - 重组蛋白ccl11在治疗恶性胸腔积液中的应用

Info

Publication number: CN117815369A
Application number: CN202311869406.9A
Authority: CN
Inventors: 沈华浩; 应颂敏; 张敏
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2023-12-31
Filing date: 2023-12-31
Publication date: 2024-04-05

Abstract

本发明涉及重组蛋白CCL11在治疗恶性胸腔积液中的应用。具体地，本发明提供了一种治疗和/或缓解恶性胸腔积液的方法—胸腔内注射重组蛋白CCL11。本发明首次发现CCL11通过增加胸腔中的嗜酸性粒细胞缓解MPE。通过构建MPE动物模型，胸腔内注射CCL11重组蛋白后，胸腔中嗜酸性粒细胞显著增加，同时MPE明显缓解。本发明为临床开发新型药物治疗MPE患者提供了新思路、新靶点。

Description

重组蛋白CCL11在治疗恶性胸腔积液中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及重组蛋白CCL11在治疗恶性胸腔积液中的应用。

背景技术

恶性胸腔积液(Malignant Pleural effusions,MPE)是癌症病人的常见并发症。MPE是原发于胸膜腔的恶性胸膜间皮瘤或来自肺、胃肠道、乳腺等其他部位的肿瘤转移至胸膜腔引起的胸腔积液。MPE是恶性肿瘤患者的不良预后征象，MPE患者中位生存期为3-12个月，预后差、病死率高，临床治疗存在巨大挑战。

MPE患者主要表现为进行性加重的呼吸困难、胸痛和干咳，严重影响患者生活质量。目前针对MPE的治疗主要包括胸腔闭式引流和化学/外科胸膜固定术，均为姑息性治疗，无法明显改善患者生存期。

综上所述，MPE并发症患者的中位生存期短、预后差、病死率高，目前尚缺乏有效的治疗药物。因此，本领域迫切需要新的有效治疗和缓解MPE并发症的药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种有效治疗和缓解MPE并发症的药物及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种重组蛋白CCL11或编码蛋白CCL11的核酸分子的用途，用于制备治疗和/或缓解对象恶性胸腔积液(MPE)的药物。

在另一优选例中，所述的对象(subject)具有选自下组的一个或多个MPE分型特征：

(a)胸腔积液中，CCL11蛋白的数量显著上升；和/或

(b)胸腔积液中，嗜酸性粒细胞数量显著下降；和/或

(c)嗜酸性粒细胞中选自下组的标志物表达显著上调：Cxcl13、Ccl3、Ccl4、或其组合；和/或

(d)嗜酸性粒细胞中选自下组的标志物表达显著下调：S100a9、Ear1、Ear6、或其组合。

在另一优选例中，所述的“显著上升”指CCL11蛋白在所述对象的胸腔积液中数量或浓度C1，与CCL11蛋白在胸腔漏出液数量或浓度C0的比值(即C1/C0)，≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

在另一优选例中，胸腔积液中，CCL11蛋白的浓度≥800pg/mL,较佳地≥1000pg/mL；更佳地≥1100pg/mL。

在另一优选例中，所述的“嗜酸性粒细胞数量显著下降”指嗜酸性粒细胞数量在所述对象的胸腔积液中数量或浓度B1，与嗜酸性粒细胞数量在自身外周血中的数量或浓度B0的比值(即B1/B0)，≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3。

在另一优选例中，所述的“嗜酸性粒细胞数量显著下降”指嗜酸性粒细胞数量在所述对象的胸腔积液中数量或浓度D1，与嗜酸性粒细胞数量在胸腔漏出液中的数量或浓度D0的比值(即D1/D0)，≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3。

在另一优选例中，所述的“表达显著上调”指所述标志物在所述对象的嗜酸性粒细胞中的表达量(mRNA或蛋白)M1，与所述标志物在自身骨髓中的嗜酸性粒细胞中的表达量(mRNA或蛋白)M0的比值(即M1/M0)，≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

在另一优选例中，所述的“表达显著下调”指所述标志物在所述对象的嗜酸性粒细胞中的表达量(mRNA或蛋白)N1，与所述标志物在自身骨髓中的嗜酸性粒细胞中的表达量(mRNA或蛋白)N0的比值(即N1/N0)，≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3。

在另一优选例中，所述的对象(subject)具有选自下组的一个或多个辅助的分型特征：

(Y1)外周血中嗜酸性粒细胞的数量正常或基本正常；和/或

(Y2)外周血中T细胞的数量正常或基本正常。

在另一优选例中，所述的对象的免疫T细胞功能完好。

在另一优选例中，所述的重组蛋白CCL11通过募集嗜酸性粒细胞进入胸腔，进而通过嗜酸性粒细胞来缓解MPE。

在另一优选例中，所述的重组蛋白CCL11为外源性的重组CCL11(rCCL11)。

在另一优选例中，所述的重组蛋白CCL11为人源的或鼠源的。

在另一优选例中，所述的MPE是指由原位性肿瘤或转移性肿瘤导致的胸腔积液。

在另一优选例中，所述的原位性肿瘤选自下组：肺癌、乳腺癌，或其组合。

在另一优选例中，所述的转移性肿瘤选自下组：结肠癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌，或其组合。

在另一优选例中，所述的对象的胸腔积液中CD3+T细胞上Ki67的表达量低；和/或所述的对象的胸腔积液中CD3+T细胞上CD69的表达量低。

在另一优选例中，所述的“Ki67的表达量低”指Ki67在所述对象的胸腔积液中的CD3+T细胞上的表达量E1，与Ki67在自身外周血中的CD3+T细胞上的表达量E0的比值(即E1/E0)，≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3。

在另一优选例中，所述的“CD69表达量低”指CD69在所述对象的胸腔积液中的CD3+T细胞上的表达量F1，与CD69在自身外周血中的CD3+T细胞上的表达量F0的比值(即F1/F0)，≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3。

在另一优选例中，所述的对象的胸腔积液中NK细胞、DC细胞和单核巨噬细胞含量低。

在另一优选例中，所述的“NK细胞、DC细胞，和单核巨噬细胞含量低”指在所述对象的胸腔积液中，NK细胞的数量(分子项)与胸腔漏出液中的NK细胞的数量(分母项)的比值Z1≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3；

DC细胞的数量(分子项)与胸腔漏出液中的NK细胞的数量(分母项)的比值Z2≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3；和

单核巨噬细胞的数量(分子项)与胸腔漏出液中的NK细胞的数量(分母项)的比值Z3，≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3。

在另一优选例中，所述的对象的胸腔积液中γδT细胞、Th1细胞，和Th17细胞含量低。

在另一优选例中，所述的“γδT细胞、Th1细胞、和Th17细胞含量低”指在所述对象的胸腔积液中，γδT细胞(分子项)与胸腔漏出液中的γδT细胞的数量(分母项)的比值Z4≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3；

Th1细胞的数量(分子项)与胸腔漏出液中的Th1细胞的数量(分母项)的比值Z5≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3；和

Th17细胞的数量(分子项)与胸腔漏出液中的Th17细胞的数量(分母项)的比值Z6，≤0.75，较佳地≤0.5，更佳地≤0.3。

在另一优选例中，所述的对象的胸腔积液中Treg细胞含量高。

在另一优选例中，所述的“Treg细胞含量高”指在所述对象的胸腔积液中，Treg细胞的数量(分子项)与胸腔漏出液中的Treg细胞的数量(分母项)的比值≥1.2，较佳地≥1.8，更佳地≥2.5。

在另一优选例中，所述的治疗和/或缓解是指胸膜肿瘤体积减小，胸水量减少。

在另一优选例中，所述的胸水量减少是指所述对象的胸腔积液的恢复至正常胸腔液含量(即没有胸水)。

在另一优选例中，所述的对象的胸腔积液中γδT细胞、Th1细胞和Th17细胞含量低，同时Treg细胞含量高。

在另一优选例中，所述的治疗和/或缓解是指对象胸腔灌洗液中γδT细胞、Th1细胞和/或Th17细胞含量分别相比于治疗前升高了≥50％；较佳地，≥100％。

在另一优选例中，所述的治疗和/或缓解是指对象胸腔灌洗液中Treg细胞含量为治疗前胸腔灌洗液中Treg细胞含量的80％；较佳地，50％。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括包括(a)作为第一活性成分的重组蛋白CCL11或编码蛋白CCL11的核酸分子；和(b)作为第二活性成分的免疫促进剂；以及(c)任选地药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的免疫促进剂选自下组：白介素-2、免疫检查点抑制剂、CAR-T细胞，或其组合。

在另一优选例中，所述的免疫检查点抑制剂选自下组CTLA4、PD-1、PD-L1、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为胸腔内给药的剂型。

在本发明的第三方面，提供了本发明第二方面所述的药物组合物在制备治疗和/或缓解MPE的药物中的用途。

在另一优选例中，所述的药物为注射剂。

在另一优选例中，所述的药物为胸腔内给药的剂型。

在本发明的第四方面，提供了一种预防和/或治疗和/或缓解MPE的方法，向有需要的对象施用治疗有效量的重组蛋白CCL11或编码蛋白CCL11的核酸分子。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断非治疗性的。

在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物；较佳地为小鼠、大鼠、兔、猴子或人。

在另一优选例中国，所述的对象的胸腔积液中CD3+T细胞上Ki67的表达量低；和/或所述的对象的胸腔积液中CD3+T细胞上CD69的表达量低。

在另一优选例中，所述的对象的嗜酸性粒细胞功能受损或受到抑制。

在另一优选例中，所述的对象的胸腔积液中γδT细胞、Th1细胞、和Th17细胞含量低。

在另一优选例中，所述的对象的胸腔积液中Treg细胞含量高。

在另一优选例中，所述的对象的胸腔积液中γδT细胞、Th1细胞、和Th17细胞含量低，同时Treg细胞含量高。

在另一优选例中，所述的治疗和/或缓解是指对象胸腔灌洗液中γδT细胞、Th1细胞和Th17细胞含量分别相比于治疗前升高了≥50％；较佳地，≥100％。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了LLC造模后，胸腔灌洗液中嗜酸性粒细胞的情况。其中，

A图为第3天胸腔灌洗液中嗜酸性粒细胞的代表性共聚焦显微镜图片，染色为DAPI和EPX；比例尺：20微米。

B图为小鼠嗜酸性粒细胞的流式细胞术圈门策略，嗜酸性粒细胞标记为DAPI-CD45+Gr1-/lowCD11c-CD11b+F4/80+SiglecF+SSChi；

C图为胸腔注射LLC后不同时间点的胸腔灌洗液中嗜酸性粒细胞的代表性流式细胞图；

D图为胸腔注射LLC后不同时间点白细胞比例图。

图2显示了MPE小鼠胸腔灌洗液(pleural lavage fluid)中的细胞因子特征。其中，A图为细胞因子芯片差异结果热图，Eos-null组:n＝3，WT组:n＝3；B图为小鼠外周血PB和小鼠胸腔灌洗液中CCL11的浓度，n＝3-7。A采用limma R包对数据进行差异表达分析，B采用two way ANOVA进行统计学分析，P<0.05表示有统计学差异，n.s.表示无统计学差异。图中，pleural lavage fluid表示胸腔灌洗液。C图显示了胸腔灌洗液中的嗜酸性粒细胞的转录特征。

图3显示了rmCCL11促进嗜酸性粒细胞募集并缓解MPE。A图为体内实验设计图；B图为嗜酸性粒细胞FC代表性图片；C图为嗜酸性粒细胞/总细胞百分比统计图，实验分组如下：WT小鼠+PBS组:n＝3、WT小鼠+rmCCL11组:n＝3、LLC-MPE小鼠+PBS组:n＝3、LLC-MPE小鼠+rmCCL11组:n＝3；D图为LLC-MPE小鼠的活体成像代表性图片，生物发光的单位为光子数/秒/平方厘米/球面度(photons/second/cm²/steradian)；其中，Eos-null表示嗜酸性粒细胞缺失的转基因小鼠。E图为小动物活体成像的统计图，分组情况如下：LLC-MP小鼠+PBS组:n＝5、LLC-MPE小鼠+rmCCL11组:n＝4、LLC-MPE Eos-null小鼠+PBS组:n＝5、LLC-MPE Eos-null小鼠+rmCCL11组:n＝3；F图为胸水量的统计图，分组同E；G图为小鼠生存时间统计图，分组情况如下：LLC-MPE小鼠+PBS组:n＝8、LLC-MPE小鼠+rmCCL11组:n＝11、LLC-MPE Eos-null小鼠+PBS组:n＝8、LLC-MPE Eos-null小鼠+rmCCL11组:n＝12。其中，图C、E、F采用twoway ANOVA进行统计学分析，生存分析采用Kaplan-Meier方法进行分析，P<0.05表示有统计学差异，n.s.表示无统计学差异。

图4显示了，在MPE裸鼠中，回输嗜酸性粒细胞不影响胸膜肿瘤生长和胸水形成。其中，A图为LLC-MPE裸鼠第2天胸腔灌洗液中嗜酸性粒细胞的FC代表性图片；B图为LLC-MPE模型胸腔中不同时间点嗜酸性粒细胞绝对值的统计图，每个时间点的裸鼠n＝3；C图为LLC-MPE裸鼠的活体成像代表性图片，生物发光的单位为光子数/秒/平方厘米/球面度(photons/second/cm2/steradian)；D图为小动物活体成像的统计图，PBS组:n＝9，嗜酸性粒细胞组:n＝9；E图为胸水量的统计图，分组同D；F图为LLC-MPE裸鼠的活体成像代表性图片，生物发光的单位为光子数/秒/平方厘米/球面度(photons/second/cm2/steradian)；G图为小动物活体成像的统计图，PBS组:n＝5，rmCCL11组:n＝8；H图为胸水量的统计图，分组同G。其中，图D、E、G、H采用非配对t检验进行统计学分析，P<0.05表示有统计学差异，n.s.表示无统计学差异。

图5显示了MPE小鼠胸腔中CD4+T细胞和CD8+T细胞随时间的变化图，其中，A为CD4+T细胞和CD8+T细胞的FC代表性图片；B为LLC-MPE小鼠胸腔中CD4+T细胞的绝对值的变化，n＝3；C为LLC-MPE小鼠胸腔中CD8+T细胞绝对值的变化，n＝3；d.p.i.表示胸腔内注射后天数(days post intrapleural injection)。

图6显示了WT小鼠和Eos-null小鼠在胸腔注射LLC后胸腔微环境中的免疫细胞表型分析。A图为WT和Eos-null小鼠胸腔中CD45+细胞的tSNE图；B图为免疫细胞亚群分组的频率图；C图为WT和Eos-null小鼠胸腔中CD3+T细胞的tSNE图；D图为T细胞亚群的频率图；E图为两组CD3+T细胞上Ki67和CD69的表达量。数据显示为平均值±标准误差。

图7显示了嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞和肿瘤组织的影响。其中，图A-D显示了嗜酸性粒细胞杀伤肿瘤细胞的评估结果。图A显示了LLC、4T1和MC38肿瘤细胞的DAPI代表性流式直方图，肿瘤细胞与嗜酸性粒细胞不同比例非接触共培养。图B显示了LLC、4T1和MC38肿瘤细胞在非接触共培养系统中的存活率。图C显示了接触共培养系统的圈门策略(上图)。LLC、4T1和MC38肿瘤细胞在接触共培养中的7-AAD代表性流式直方图(下图)。图D显示了LLC、4T1和MC38肿瘤细胞在接触共培养系统中的存活率。图E-G显示了WT和Eos-null小鼠的LLC-MPE模型中的胸膜肿瘤组织，使用免疫组化染色分析cleaved-caspase 3和Ki-67的结果。图E显示了胸膜肿瘤中cleaved-caspase 3和Ki-67的代表性IHC图像。比例尺：100微米。图F显示了每平方毫米cleaved-caspase 3+细胞数。图G每平方毫米Ki-67+细胞数。数据表示为平均值±标准误差。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现重组蛋白CCL11(或相应的制剂)可用于治疗恶性胸腔积液(MPE)。试验表明，施用外源CCL11蛋白后，CCL11会招募嗜酸性粒细胞，同时被招募嗜酸性粒细胞和T细胞共同作用，有效地通过改善肿瘤微环境等途径，从而有效地治疗和/或缓解MPE。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

如本文所用，术语“本发明的活性成分”指重组蛋白CCL11、编码所述重组蛋白CCL11的核酸分子(如mRNA、核酸载体)、或其组合。

如本文所用，术语“本发明的组合物”指含有本发明活性成分的组合物，尤其是药物组合物。

如本文所用，术语“MPE”与“MPE并发症”互换使用，是指原发于胸膜腔的恶性胸膜间皮瘤或来自肺、胃肠道、乳腺等其他部位的肿瘤转移至胸膜腔引起的胸腔积液。

如本文所用，术语“胸腔漏出液”是指由心衰等引起的不同于恶性胸腔积液的胸水，可作为恶性胸腔积液的阴性对照。

重组蛋白CCL11或其编码序列

CCL11是一种人体内重要的趋化因子，它属于CC趋化因子家族(CC chemokines)中的一员。CCL11可与嗜酸性粒细胞表面表达的趋化因子受体CCR3结合。

在本发明中，优选的CCL11蛋白来自于哺乳动物，例如来自于人、啮齿动物、或非人灵长动物，例如如鼠源、兔源、猴源、猪源或人源的CCL11蛋白。本发明的CCL11蛋白包括野生型和突变型的CCL11蛋白，只要该突变蛋白保留招募嗜酸性粒细胞的功能。

此外，本发明的重组CCL11还包括CCL11蛋白的活性片段或融合蛋白，只要该活性片段或融合蛋白保留招募嗜酸性粒细胞的功能。在本发明中，所述的保留招募嗜酸性粒细胞的功能指具有≥50％，较佳地≥70％，≥90％(如50-300％，或70-150％)野生型CCL11蛋白的招募嗜酸性粒细胞功能。

重组蛋白CCL11治疗和/或缓解MPE

本发明人首创性地提出了重组蛋白CCL11用于治疗和/或缓解MPE并发症的用途。具体地，本发明人通过试验证实，重组CCL11通过招募嗜酸性粒细胞，重塑MPE免疫微环境，进而实现对MPE的治疗或缓解。

一方面，嗜酸性粒细胞在胸腔积液中升高的同时CCL11在MPE小鼠胸腔积液中的浓度也升高，且在WT组和Eos-null组存在差异，提示CCL11在此过程中参与了嗜酸性粒细胞的募集。

另一方面，在MPE模型小鼠的胸腔内注射rmCCL11后的结果表明，重组CCL11蛋白可高效地招募嗜酸性粒细胞，从而在有嗜酸性粒细胞的条件下发挥缓解MPE的作用。此外，如果嗜酸性粒细胞缺失，则CCL11蛋白对MPE的缓解作用会减弱，这说明CCL11蛋白是通过嗜酸性粒细胞来缓解MPE并发症的。

因此，在本发明中，可以通过施用重组CCL11蛋白，使其到达胸腔，从而在胸腔或周围组织中招募嗜酸性粒细胞，重塑MPE免疫微环境，进而实现对MPE并发症的治疗或缓解。

药物组合物和应用

本发明还提供了含有重组蛋白CCL11的药物组合物，所述药物组合物可用于治疗和/或缓解MPE。

优选地，本发明的药物组合物可以进一步包括其他活性成分，例如额外的免疫促进剂、抗癌药、或其组合。

通常，本发明的药物组合物包括(a)作为活性成分的重组蛋白CCL11或编码所述重组蛋白CCL11的核酸分子；和(b)药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常，药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

在本发明中，代表性的给药方式包括(但并不限于)：胸腔内给药,如胸腔内注射。

典型地，当以胸腔内或静脉内给予方式给本发明的药物组合物时，一个60kg体重的对象(人)，日平均剂量通常为1-1000mg，较佳地5-500mg，更佳地10-250mg。所述日剂量可以分一次、二次或多次给予，也可以间隔1、2、3、4、5、6天给药一次。

此外，也可根据恶性胸腔积液的体积进行给药。当以胸腔内或静脉内给予方式给本发明的药物组合物时，通常的给予的日剂量为0.1-10mgCCL11蛋白/100mL,较佳地0.5-5mgCCL11蛋白的/100mL。所述日剂量可以分一次、二次或多次给予，也可以间隔1、2、3、4、5、6天给药一次。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

与现有技术相比，本发明的主要优点包括：

(a)首次发现了在MPE并发症中，CCL11蛋白的表达与嗜酸性粒细胞的浸润及嗜酸性粒细胞改善MPE显著相关。

(b)本发明首次提出并验证了，通过胸腔内注射重组CCL11蛋白，可显著而快速地缓解了MPE，并且这一过程主要通过嗜酸性粒细胞实现。

(c)本发明证实了，在给予重组CCL11蛋白的情况下，嗜酸性粒细胞主要通过重塑MPE免疫微环境等多方面的作用，从而有效治疗或缓解MPE。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非特别说明，实施例中的试验试剂(如rmCCL11蛋白)和试剂盒均为市售获得。

通用实验方法

I.MPE模型小鼠的造模

取拟构建MPE的小鼠，腹膜内注射1％戊巴比妥钠溶液进行全身麻醉，当小鼠进入深度麻醉状态后，将其固定在实验台上，用剃毛器将小鼠右胸部的毛剃除，用75％酒精消毒皮肤。

用微量注射器吸50μL含有1.5×10⁵个肿瘤细胞(LLC细胞、MC38细胞、4T1细胞)的PBS单细胞悬液，在小鼠剑突水平右前外侧胸壁做一切口，暴露助骨，在直视状态下通过肋间隙将单细胞悬液注入小鼠胸膜腔中。取出注射器后消毒注射点，用手术线缝合肌肉层和表皮层，将小鼠放在温暖的鼠笼中，命名为LLC-MPE模型小鼠。正常对照组中注射液为50μLPBS溶液，其他操作与LLC-MPE模型组相同。

对于小鼠，MPE并发症的判断标准如下：当小鼠的胸腔积液的体积≥100μL时，则认为小鼠存在MPE(可进行液体抽吸)；当小鼠的胸腔积液的体积＜100μL时，则认为小鼠不存在MPE(可进行胸膜腔灌洗)。

II.小鼠处理方法

第14天，腹膜内注射0.2mL 1.5％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠，用麻醉方式处死小鼠。于小鼠眼眶后静脉抽取静脉血，置于肝素抗凝管中。将小鼠固定在实验台上，用75％酒精消毒小鼠的胸部和腹部，在不破坏胸腔完整性的前提下，于腹中线行“T”型切口，暴露膈肌。

若小鼠还未形成胸腔积液，则将1mL PBS从膈肌注射进入胸腔，静置30秒至1分钟后，回抽PBS置于无菌的1.5mL EP管中，待后续实验检测使用。若通过膈肌可以看见血性的胸腔积液，用1mL的注射器抽吸胸腔积液，置于无菌的1.5mL EP管中，用微量移液器精准地测量其体积并记录数据。用直剪将胸骨剪断，打开胸腔，用手术镊剥离位于小鼠胸腔中的肿瘤组织，置于4％甲醛组织固定液中(固定液至少为20倍肿瘤组织的体积)。

III.胸膜渗透性检测

取MPE模型小鼠，尾静脉注射0.1mL Evans Blue工作液(10mg/mL)，30分钟后安乐死小鼠，取出胸腔灌洗液或者胸腔积液、对应外周血(PB)，400g、10分钟、4℃离心后，取上清，稀释适当倍数后采用酶标仪在630nm波长下测定各标本的OD值，计算每只小鼠胸腔灌洗液或者胸腔积液上清OD值与对应PB上清OD值的比值。

IV.小动物活体成像

使用PerkinElmer IVIS Spectrum活体成像系统检测小鼠自发光信号，提前点击Living Imaging软件启动程序，并初始化IVIS系统。初始化时，IVIS Acquisition ControlPanel中的温度状态灯为红色，当温度状态灯绿色时方可进行成像。

给MPE小鼠腹腔注射D-荧光素钠盐(15mg/mL,100μL/只)后开始计时，6分钟时用异氟烷对小鼠进行气体麻醉(一般3分钟小鼠可完全进入麻醉状态)，10分钟时，将麻醉的小鼠放入Perkinelmer小动物活体成像仪的成像箱并关门。调整成像模式为Luminescent(生物发光)，调试出小鼠最佳曝光参数，同一批实验统一参数后，获取成像图片。获取图片后，进一步分析获取ROI区域的定量数值用于后续统计分析。

V.小鼠生存曲线绘制

将MPE模型小鼠进行编号，从胸腔内注射肿瘤细胞开始，每隔2天于同一时间观察小鼠生命体征，当小鼠呼吸心跳停止则认为发生死亡事件，记录死亡小鼠编号和时间，制作小鼠生存曲线。

VI.CCL11给药和治疗

将MPE模型小鼠，第4天开始胸腔内注射小鼠重组CCL11，剂量为0.5μg/只，将小鼠CCL11以100μL PBS稀释，通过胸腔注射至MPE小鼠，每隔2日注射一次。对照组小鼠给予100μL PBS胸注射。第7天监测小鼠胸腔内嗜酸性粒细胞数量；第14天检测小鼠胸膜肿瘤负荷、胸水量并监测小鼠生存时间(参见图3的A图)。

实施例1：测试MPE小鼠胸腔灌洗液的细胞因子特征

首先在WT小鼠中构建LLC-MPE模型，发现在MPE形成早期，嗜酸性粒细胞在胸腔中显著升高，结果如图1所示，说明嗜酸性粒细胞参与了MPE的发生和发展。

接下来，通过构建Eos-null和其同窝对照的WT小鼠的LLC-MPE模型，第2天获取胸腔灌洗液，进行Mouse Cytokine Array GS4000细胞因子芯片检测。如图2A和表1所示，CCL11在Eos-null中显著升高，而其他与嗜酸性粒细胞相关的因子如IL-4、IL-5、IL-13、IL-33及TSLP等均无显著变化。

表1.使用细胞因子阵列测量与嗜酸性粒细胞功能相关的细胞因子

如表1所示的蛋白芯片检测结果表明，在众多与嗜酸性粒细胞功能相关的细胞因子中，在胸腔灌洗液中的CCL11水平呈现极为显著的变化。

此外，ELISA检测也就进一步证实，胸腔灌洗液中的CCL11水平显著上升至少2倍(图2B)。此外，在外周血中，CCL11水平未呈现显著的变化。这表明，胸腔灌洗液中的CCL11水平可作为适合本发明疗法(给予CCL11蛋白)的MPE并发症的分型标志物。

此外，还对LLC-MPE模型小鼠的胸腔积液(给药前)中的嗜酸性粒细胞的RNA测序。结果表明：Cxcl13、Ccl3、Ccl4等标志物表达上调，S100a9、Ear1、Ear6等标志物表达下调。

实施例2：CCL11促进嗜酸性粒细胞募集、缓解MPE

为了检测嗜酸性粒细胞的作用，使用无嗜酸性粒细胞小鼠(通过转基因手段获得Eos-null小鼠)及其同窝对照WT小鼠，构建MPE模型。

参照图3A分别对WT小鼠和Eos-null小鼠进行MPE造模和给药。小鼠在第7天胸腔注射CCL11之后，于第8天使用流式细胞术，检测嗜酸性粒细胞数量。图3B为代表性流式示意图。如图3B所示，实验结果表明，相比于对照组rmCCL11，施加rmCCL11能够招募更多的嗜酸性粒细胞。特别地，在CCL11组中，嗜酸性粒细胞的数量提升了2倍以上。

本发明在WT和Eos-null小鼠中构建LLC-MPE模型，第4天开始胸腔内注射小鼠重组CCL11(0.5μg/只)，每隔2天追加一次，并与第14天处死小鼠，收集小鼠的胸腔积液以及肿瘤组织，并计算小鼠的生存期。如图3C-D所示，相较于对照组，实验组中嗜酸性粒细胞显著升高；如图3E-G，14天后发现WT小鼠治疗组的胸膜肿瘤负荷显著减小、胸水量显著下降和生存时间显著延长，而Eos-null治疗组中并未出现显著MPE缓解。这说明，rmCCL11在体内可促进嗜酸性粒细胞向胸腔内募集，并通过嗜酸性粒细胞抑制MPE的形成。

实施例3：MPE裸鼠回输嗜酸性粒细胞不影响胸膜肿瘤生长和胸水形成

既往研究显示，活化的嗜酸性粒细胞在TME中显著改善T细胞向肿瘤的浸润，增强肿瘤的排斥和存活。在没有T细胞的情况下，嗜酸性粒细胞没有表现出实质性的抗肿瘤活性。

首先检测了MPE小鼠胸膜微环境。结果如图4A-B，裸鼠胸腔经过LLC细胞刺激之后，胸腔内聚集大量嗜酸性粒细胞，说明T细胞缺失之后不影响嗜酸性粒细胞向胸腔的迁移。

对于裸鼠构建LLC-MPE模型(操作与LLC-MPE模型相同，给药剂量及时间同上)，在向LLC-MPE模型裸鼠尾静脉回输嗜酸性粒细胞后，如图4C-E所示，其胸膜肿瘤未减小、胸水量未减少。这表明，T细胞缺失之后不影响嗜酸性粒细胞向胸腔的迁移。然而，如图4F-H，在给裸鼠胸腔注射rmCCL11之后，其胸膜肿瘤未减小、胸水量未减少。

上述结果表明，T细胞的存在与否，不影响在CCL11对嗜酸性粒细胞招募，嗜酸性粒细胞仍会向胸腔部位迁移，但是单独的嗜酸性粒细胞无法起到缓解/治疗MPE的效果，表明嗜酸性粒细胞发生MPE治疗/缓解作用需要T细胞的参与。

实施例4：MPE小鼠胸腔中CD4+T细胞和CD8+T细胞随时间的变化

本实施例进一步分析了MPE胸腔微环境中适应性免疫细胞出现的时间。

操作与LLC-MPE模型相同，使用流式细胞术，分别于不同时间点检测胸腔中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的数目。

结果如图5B-C所示，CD4+T细胞和CD8+T细胞在第7天逐渐升高。

实施例5：CD45+细胞cyTOF结果

根据实施例4的结果，获取WT小鼠、Eos-null小鼠LLC-MPE模型第7天的胸腔灌洗液，体外用佛波酯(Phorbol ester,PMA)/离子霉素(lonomycin,Ion)/布雷非德菌素A(Brefeldin A,BFA)刺激4小时后，进行质谱流式检测。获取的数据使用Flowjo圈选单个、活的、完整的CD45+免疫细胞，并将CD45+细胞进行无偏移自动降维聚类分析，分析展示32个细胞亚群，并进行人工注释。通过合并同类细胞，统计各大类细胞在WT组和Eos-null组之间的差异。

结果如图6A-B，在Eos-null组嗜酸性粒细胞几乎检测不到嗜酸性粒细胞，B细胞、T细胞无差异，NK细胞、DC细胞和单核巨噬细胞显著下降。

进一步通过Flowjo将CD3+T细胞圈出来进行T细胞亚群分析。将CD3+T细胞进行无偏移自动降维聚类分析，展示8个亚群分布。

统计学分析结果如图6C-D所示，在Eos-null组γδT细胞、Th1细胞、Th17细胞显著下降，Treg细胞显著升高，上述结果与既往文献结果一致。既往文献中认为γδT细胞、Th1细胞、Th17细胞对于MPE具有保护作用，而Treg细胞对MPE的发生发展有促进作用。值得注意的是，该结果中并未检测到Th2细胞。

如图6E所示，在Eos-null组的CD3+T细胞上发现Ki67、CD69均表达下降，表明CD3+T细胞的增殖能力和活化能力均下降。

对WT小鼠和Eos-null小鼠在胸腔注射LLC后胸腔微环境中的免疫细胞表型进行分析，结果表明，嗜酸性粒细胞缺失后，会影响MPE小鼠胸腔微环境的免疫细胞构成和T细胞功能，进而促进MPE的发生和发展。

实施例6：嗜酸性粒细胞本身并不会影响肿瘤细胞或组织的增殖

在接触和不接触的条件下，分别将嗜酸性粒细胞与三种不同的肿瘤细胞按照不同的比例进行共培养，观察嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞和肿瘤组织的影响。

从Il5Tg小鼠外周血中提取酸性粒细胞：先使用percoll从Il5 Tg小鼠的外周血中分离粒细胞，后使用免疫磁珠分选实验分离嗜酸性粒细胞。免疫磁珠分选实验用的抗体有：生物素抗小鼠CD4、CD8a、B220、NK1.1、Ly6G、CD115、CD11c、Ter119抗体和抗生物素磁珠，分选后的嗜酸性粒细胞通过FC分析证实嗜酸性粒细胞纯度>95％。嗜酸性粒细胞与肿瘤细胞非接触培养体系：使用4μm小孔的Transwell小室，将500μL的5×10⁵/mL的LLC、4T1和MC38细胞接种在下室，将悬浮于400μL RPMI-1640培养基中的嗜酸性粒细胞按与肿瘤细胞的不同比例(0:1、1:1、2:1、5:1)接种在上室。孵育4小时后，使用DAPI检测肿瘤细胞死亡情况。

如图7A和图7B所示，在非接触共培养的条件下，嗜酸性粒细胞对三种肿瘤细胞(LLC细胞，MC38细胞和4T1细胞)均不会产生杀伤作用；

嗜酸性粒细胞与肿瘤细胞接触培养体系：LLC、4T1和MC38细胞根据说明书用CFSE预处理，随后接种在96孔板中，浓度为每孔1×10⁴/100μL细胞。后将嗜酸性粒细胞与LLC、4T1和MC38细胞按不同比例(0:1、1:1、2:1、5:1)共培养。共培养4小时后，使用7-AAD染色检测细胞死亡死细胞，流式分析的时候采用CFSE区分肿瘤细胞和嗜酸性粒细胞。

如图7C和图7D所示，在接触条件下共培养后，嗜酸性粒细胞对三种肿瘤细胞(LLC细胞，MC38细胞和4T1细胞)均不会产生杀伤作用，也不会抑制肿瘤细胞的增殖。

获取WT小鼠、Eos-null小鼠LLC-MPE模型第14天的胸膜肿瘤，使用免疫组化的方法，检测肿瘤组织中Cleaved-caspase3及Ki67的表达。

如图7E和图7F所示，嗜酸性粒细胞本身并不会影响肿瘤组织的增殖。

讨论

胸腔为脏层和壁层胸膜之间的一个潜在间隙，正常人胸膜腔内有5～15mL液体，在呼吸运动时起润滑作用。

MPE的形成一方面是由于肿瘤细胞阻塞淋巴管，使液体回流受阻，另一方面肿瘤细胞通过释放血管活性物质如血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)和血管生成素增加血管渗透性，使液体量产生增多。最新的证据表明，MPE的形成受肿瘤细胞、宿主血管和免疫系统之间的相互作用调节，进而引起血管高通透性、血管生成和炎症反应等。

MPE患者的肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)具有较强的免疫抑制作用，存在丰富的免疫抑制细胞及介质。MPE中的介质可将免疫细胞驱动到低功能状态，因此，将免疫细胞重编程或将免疫抑制细胞从TME中移除可增强MPE的免疫治疗效果。胸腔内注射抗程序性细胞死亡蛋白1(Programmed cell death protein1,PD-1)单克隆抗体和嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)，可控制胸腔积液的生成和胸膜肿瘤的生长，提示靶向局部免疫系统可能是治疗MPE较理想的策略，也是当前MPE研究的热点。

多种趋化因子可诱导嗜酸性粒细胞向肿瘤微环境(TME)中迁移，这些趋化因子受特定TME内动态变化的调节。IL-5、eotaxin-CCR3信号通路在正常黏膜组织、过敏性炎症和肿瘤中对嗜酸性粒细胞募集发挥重要作用；在坏死和缺氧的肿瘤类型里，损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs)如HMGB1和IL-33促进嗜酸性粒细胞的募集；微生物组也会影响TME中嗜酸性粒细胞的募集；TME中嗜酸性粒细胞募集的途径还包括CCL3、CCL5(CCR1配体)。

本发明人首次意外地发现重组蛋白CCL11(或相应的制剂)可用于治疗恶性胸腔积液(MPE)并发症。试验表明，施用外源CCL11蛋白后，CCL11会招募嗜酸性粒细胞，同时被招募嗜酸性粒细胞和免疫T细胞共同作用，有效地通过改善肿瘤微环境等途径，从而有效地治疗和/或缓解MPE并发症。

在本发明提及的所有文献都在本发明中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种重组蛋白CCL11或编码蛋白CCL11的核酸分子的用途，其特征在于，用于制备治疗和/或缓解对象恶性胸腔积液(MPE)的药物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的对象(subject)具有选自下组的一个或多个MPE分型特征：

(a)胸腔积液中，CCL11蛋白的数量显著上升；和/或

(b)胸腔积液中，嗜酸性粒细胞数量显著下降；和/或

(c)嗜酸性粒细胞中选自下组的标志物表达显著上调：Cxc113、Cc13、Cc14、或其组合；和/或

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的MPE是指由原位性肿瘤或转移性肿瘤导致的胸腔积液。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的对象的胸腔积液中CD3+T细胞上Ki67的表达量低；和/或所述的对象的胸腔积液中CD3+T细胞上CD69的表达量低。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的对象的胸腔积液中NK细胞、DC细胞和单核巨噬细胞含量低。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的对象的胸腔积液中γδT细胞、Thl细胞，和Th17细胞含量低。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的对象的胸腔积液中Treg细胞含量高。

8.一种药物组合物在制备治疗和/或缓解MPE的药物中的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括(a)作为第一活性成分的重组蛋白CCL11或编码蛋白CCL11的核酸分子；和(b)作为第二活性成分的免疫促进剂；以及(c)任选地药学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物为胸腔内给药的剂型。

10.一种预防和/或治疗和/或缓解MPE的方法，其特征在于，向有需要的对象施用治疗有效量的重组蛋白CCL11或编码蛋白CCL11的核酸分子。