CN102677226B

CN102677226B - 一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法

Info

Publication number: CN102677226B
Application number: CN201210181568.9A
Authority: CN
Inventors: 史向阳; 郑付印; 王世革; 沈明武
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2012-06-05
Filing date: 2012-06-05
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2032-06-05
Also published as: CN102677226A

Abstract

本发明涉及一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，包括：（1）将模型DOX加入超声分散均匀的n-HA悬浊液中，通过表面物理吸附的方法，使DOX药物分子负载在n-HA表面；（2）将DOX/n-HA粉末均匀分散在THF和DMF的混合溶剂中，超声分散均匀；（3）向上述DOX/n-HA的THF/DMF分散溶液中，加入PLGA，搅拌使其溶解均匀，制备成静电纺丝溶液；（4）通过静电纺丝的方法制备n-HA和PLGA双载体的药物控释体系。本发明制备工艺简单，载药纤维具有药物持续缓释、生物相容性好、抗癌活性明显等优点。

Description

一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法

技术领域

本发明属于纳米载药纤维的制备领域，特别涉及一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法。

背景技术

近年来，随着纳米技术的兴起和各种生物相容性高分子材料的优越性逐渐凸显，基于无机纳米粒子及高分子材料的纳米级药物释放体系引起了研究者们的广泛青睐，开发具有持续释放效果的实用型药物控释体系逐步成为研究者们努力攻克的关键领域。静电纺丝技术作为一种新型纳米材料的加工方法，具有加工工艺参数可调、原料利用率高、纤维收集方式多样化、实验重复性高和易于产业化等优点；制备的聚合物纳米纤维具有尺寸可控、比表面积大、孔隙率高和三维网状结构并可以很好的模拟天然细胞外基质（ECM）等特点。这些优点使得静电纺丝技术及其产品在很多领域内得到了广泛应用。通过高分子的共聚、共混等方法及不同的收集方式，制备出性能和结构多样化的超细功能纤维并应用于组织工程和药物缓释等方面，具有重要科学价值和巨大的应用前景。

2001年，Ignatious和Baldoni两人最早用静电纺技术设计出分别具有快速、即时、延时、缓慢、持续及阶段性等不同释药特性的复合药剂。随后，研究者们用浸药法、共混静电纺、乳液静电纺和同轴静电纺等方法制备了不同的纳米纤维载药系统。由于溶剂的可选择性及制备条件温和，上述制备方法的载药系统能够有效控制药物的释放速度，改变药物的代谢动力学和体内分布状况，从而提高药效并降低毒副作用。

纳米羟基磷灰石（Nano hydroxyapatite，n-HA，Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂）是构成人体硬组织如骨骼和牙齿的主要无机成分之一，具有良好的生物活性和生物相容性，被广泛用于生物医用材料领域，如硬组织修复材料，药物载体等。棒状n-HA具有较大的比表面积和很强的表面吸附能力，能吸附和传递多种药物和生物活性分子，可以作为一种优良的生物化学吸附载体；同时，棒状n-HA的力学性能使其在复合材料增强体领域具有广泛的应用前景。因此，采用棒状n-HA负载抗癌药物，并将之填充于高分子聚合物基质中，可望得到一种能够长期、缓慢地释放抗癌药物，并具有较好机械强度的纤维支架材料。

研究表明，传统的基于纯静电纺纳米纤维或纯无机纳米材料的药物载体均存在着药物突释现象；此外，聚合物纳米纤维还存在机械强度低，无机纳米材料也存在容易团聚等现象。这些瓶颈严重限制了纯静电纺纳米纤维或纯无机纳米材料在药物载体领域的应用。因此，利用静电纺丝技术制备载药率高，机械性能好，缓释效果明显的有机/无机复合纳米纤维载药体系是开发新的药物剂型的一条可行的途径。

在前期的研究中，首次提出了将埃洛石纳米管(halloysite nanotubes,HNTs)载药与静电纺丝技术相结合，制备静电纺纳米管/高聚物双载体纳米纤维药物缓释系统的研究思路。我们将抗生素类药物（TCH，盐酸四环素）首先负载于HNTs内，得到HNTs/TCH载药纳米管，然后将HNTs/TCH分散于PLGA纺丝液中，制得了PLGA/HNTs/TCH复合载药纳米纤维。掺杂的HNTs可以显著提高PLGA纳米纤维的机械性能，且此双重载药纳米纤维可以有效的控制TCH的释放（Qi et al.J.Mater.Chem.2010,20(47):10622-10629）。截止目前，尚没有文献或专利报道以静电纺丝技术制备PLGA/n-HA/DOX复合纳米纤维载药体系的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，该方法简单，易于操作，所用的PLGA及n-HA具有很好的生物相容性，适合于大批量生产；制备的n-HA/PLGA的双载体载药系统具有很好的药物持续释放效果。

本发明的一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，包括：

（1）绘制盐酸阿霉素DOX水溶液的浓度-吸光度标准曲线；

（2）将n-HA分散在去离子水中得到n-HA悬浊液并超声分散均匀；

（3）向上述n-HA悬浊液中加入DOX，避光条件下磁力搅拌，通过表面物理吸附的方法使DOX药物分子负载在n-HA表面；

（4）离心分离上述负载有DOX的悬浊液，并用去离子水洗涤沉淀，收集上清液并与洗涤液混合，测量混合液在490nm处的吸光值，根据步骤（1）中的标准曲线计算载药量；

（5）冷冻干燥步骤（4）中负载有DOX的n-HA，得到DOX/n-HA粉末，研磨均匀，并用筛网过滤；

（6）将上述DOX/n-HA超声分散在THF与DMF的混合溶剂中，再加入PLGA配成DOX/n-HA/PLGA静电纺丝溶液，纺丝溶液中PLGA与混合溶剂的质量体积比为1g:4~5mL，DOX与PLGA的质量比为1:100，采用静电纺丝即得有机无机杂化静电纺纳米载药纤维。

所述步骤（1）中的绘制标准曲线的具体步骤为：将DOX溶于水中，制备n组不同浓度的DOX水溶液，其中n≥5；然后测量n组不同浓度的DOX水溶液的吸光值，绘制浓度-吸光度标准曲线。

所述步骤（2）中的n-HA的终浓度为0.5mg/mL。

所述步骤（2）中的超声分散时间为30~50min。

所述步骤（3）中的DOX的终浓度为0.5mg/mL。

所述步骤（3）中的磁力搅拌时间为18~24h，转速使悬浊液不沉淀即可。

所述步骤（4）中离心的速度为4000~6000rpm，离心的时间为3~5min，沉淀的洗涤次数为2~3次。

所述步骤（5）中的筛网为325目筛。

所述步骤（6）中的混合溶剂中THF与DMF的体积比为3：1，超声分散时间为3~5min。

所述步骤（6）中的静电纺丝的工艺条件为：接收距离为10~20cm，电压为15kV-25kV，流速为0.8~1mL/h。

本发明使用扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、激光共聚焦显微镜（CLSM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和机械性能测试等表征了制备的杂化纳米纤维及其载药性能，并对药物控释体系的缓释动力学和体外抗癌活性等进行了评价。具体测试结果如下：

（1）n-HA负载药物DOX条件优化结果

由图1可以看出，当n-HA浓度为1mg/mL或2mg/mL时，药物负载效率随着药物浓度升高而变大，随载体浓度升高而降低，可能是因为当n-HA浓度为1mg/mL或2mg/mL时，n-HA粒子分散不好而导致相对接触面积变小的原因；当n-HA浓度为0.5mg/mL时，药物负载效率先增加后减小；当DOX和n-HA的浓度均为0.5mg/mL时，载药率达到最大，为14.05%。

（2）傅里叶变换红外光谱（FTIR）的测试结果

由图2可以看出，DOX的特征峰在1434cm^-1和1621cm^-1处。载药后，n-HA在1429cm^-1处的羰基峰和1385cm^-1处的羟基的弯曲振动峰消失，而在1464cm^-1和1412cm^-1处出现两个新的吸收峰。我们认为是DOX药物分子已经成功负载到n-HA表面，从而引起了峰型的变化。

（3）X射线衍射（XRD）的测试结果

图3所示为DOX和负载DOX前后n-HA的X射线衍射峰。从附图3可以看出，DOX/n-HA的谱图和n-HA的图谱（JCPD 09-0432）一致，各晶面位置吻合，表明本发明报道的负载DOX的方法不会改变n-HA的晶体结构。

（4）透射电子显微镜（TEM）及激光共焦显微镜（CLSM）表征结果

由图4可以看出，DOX/n-HA仍为棒状结构（附图4a），通过对比纯PLGA纳米纤维（附图4c）可以看出，DOX/n-HA被均匀地包裹于静电纺PLGA纳米纤维中（附图4b）。纳米纤维的CLSM表征结果显示本发明制备的DOX/PLGA（如附图4d）的红色荧光均匀分布在纤维内部，而DOX/n-HA/PLGA（如附图4e）在纤维内部有多处荧光增强点，即很好的说明DOX/PLGA分布在纤维内部。

（5）扫描电子显微镜（SEM）的测试结果

图5（a），（b），（c）和（d）为本发明制备的PLGA、n-HA/PLGA、DOX/PLGA和DOX/n-HA/PLGA的复合纳米纤维的SEM图。可以看出，各组纤维表面形貌光滑均匀，纤维之间无明显粘连，并且均具有较大的孔隙结构。各组纳米纤维的平均直径分别为656±161nm、634±152nm、338±70nm和577±133nm，孔隙率分别为71.5%、71.4%、69.1%和72.5%。很明显，当掺杂少量n-HA后，纤维毡的孔隙率变化不大，直径轻微变小。主要原因是由于n-HA表面羟基存在，高压静电场作用下带电射流的表面电荷密度增加，纤维受到的拉伸作用增强，纤维的直径变小。而DOX/PLGA纳米纤维的直径明显降低，主要是因为DOX的加入引起PLGA纺丝液性质（如电导率、粘度等）变化所致。

（6）静电纺DOX/n-HA/PLGA复合纳米纤维载药体系的应力-应变曲线

图6所示为PLGA、n-HA/PLGA和DOX/n-HA/PLGA纳米纤维毡的应力-应变曲线。从应力-应变曲线可以看出，n-HA/PLGA和DOX/n-HA/PLGA复合纳米纤维毡的断裂强度因n-HA的加入而提高，杨氏模量也显著提高，这充分说明n-HA可作为纤维增强体，显著提高复合材料载体的机械性能。

（7）静电纺DOX/n-HA/PLGA复合纳米纤维载药体系的药物释放动力学

图7所示为在pH分别为7.4和5.4条件下，DOX/n-HA/PLGA复合纳米纤维载药体系对DOX的释放动力学结果。通过与DOX/n-HA载药粉末和DOX/PLGA载药纳米纤维对比发现，在不同pH条件下，DOX/n-HA/PLGA复合纳米纤维载体载药体系均没有明显的“突释”现象，且药物能够持续地释放。

（8）静电纺DOX/n-HA/PLGA复合纳米纤维载药体系的体外抗癌活性

图8所示为不同DOX浓度时，DOX/n-HA/PLGA复合纳米纤维载药体系的抗癌活性测试结果，并与相同DOX浓度时DOX/PLGA纳米纤维、DOX/n-HA纳米粉末进行了对比。相对于对照组（TCP），在DOX浓度为100μg/mL时，所有材料均表现出了抗癌活性；而当DOX的浓度低于100μg/mL时，DOX/n-HA/PLGA纳米纤维的显示了较弱的抗癌活性，主要是因为此时DOX从DOX/n-HA/PLGA纳米纤维中的释放速度较慢的缘故。

有益效果

（1）本发明的制备方法简单，易于操作，所用的PLGA及n-HA具有很好的生物相容性，适合于大批量生产；

（2）本发明制备的含n-HA的纤维毡，其机械强力得到了明显的提高；

（3）本发明制备的n-HA/PLGA的双载体载药系统具有很好的药物持续释放效果。

附图说明

图1为本发明中的n-HA对DOX的负载率随n-HA和DOX浓度变化曲线；

图2为本发明中的（a）DOX粉末、（b）n-HA粉末和（c）DOX/n-HA载药粉末的FTIR图谱；

图3为本发明中的（a）n-HA粉末、（b）DOX/n-HA载药粉末和（c）DOX粉末的X射线衍射图谱；

图4为本发明中的（a）DOX/n-HA载药粉末、（b）DOX/n-HA/PLGA和（c）PLGA纳米纤维的TEM图及（d）DOX/PLGA和（e）DOX/n-HA/PLGA纳米纤维的CLSM图；

图5为本发明中的（a）PLGA、（b）n-HA/PLGA、（c）DOX/PLGA和（d）DOX/n-HA/PLGA纳米纤维的SEM及其直径分布图；

图6为本发明中的（a）PLGA、（b）n-HA/PLGA和（c）DOX/n-HA/PLGA纳米纤维的应力-应变曲线；

图7为本发明中的DOX/n-HA纳米粉末、DOX/PLGA和DOX/n-HA/PLGA纳米纤维分别在pH为5.4和7.4的药物释放动力学曲线；

图8为本发明中的DOX/n-HA/PLGA纳米纤维的体外抗癌活性评价结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

取n-HA分散在去离子水中，并将n-HA悬浊液超声分散30min；

取DOX溶解在n-HA悬浊液中，并在避光条件下持续搅拌18h，转速使悬浊液不沉淀即可；

将所得混合液转移到离心管中，在3000rpm的条件下离心3min，取出上清液；用去离子水清洗载有DOX的n-HA沉淀3次，上清液与洗涤液混合待用；将DOX/n-HA沉淀避光低温干燥18h，干燥后的粉末用玛瑙研钵研磨待用。

实施例2

将实施例1中离心得到的上清液和洗涤液稀释20倍，利用Lambda 25紫外-可见分光光度计（美国珀金埃尔默仪器公司）测试DOX溶液在490nm处的吸光度，根据事先用DOX溶液标定的浓度-吸光度关系曲线，即可算出n-HA载药后溶液中剩余DOX的量，算出平均载药率（载药率（%）=n-HA负载DOX的质量/（n-HA的质量+n-HA负载DOX的质量））。

根据附图1结果，选取DOX的浓度为0.5mg/mL，n-HA的浓度为0.5mg/mL，制备了载药率为14.05%的DOX/n-HA纳米粉体。DOX在HA上的负载进一步通过FTIR（附图2）和XRD（附图3）得到表征和证明。

实施例3

将35.58mg的实施例1得到的载药率为14.05%的n-HA粉末加入到2mL的THF/DMF（体积比3：1）溶剂中，超声分散3~5min，搅拌30~50min，将0.5g的PLGA溶解在上述混合液中，搅拌8h，配制成质量百分比浓度为1%（DOX相对PLGA为1wt%）的均一静电纺丝液。然后按照常规静电纺丝的方法制备纳米纤维毡；其中，接收距离为15cm，电压为20kV，流速为0.8mL/h，制备的复合纳米纤维毡在真空干燥箱内避光干燥48h以除去残留的溶剂，待用。TEM表征结果显示DOX/n-HA仍为棒状晶体结构（如附图4a所示），DOX/n-HA被很好地包裹于静电纺PLGA纳米纤维中（如附图4b所示）。CLSM表征结果也说明DOX/n-HA分布在纤维内部（如附图4e所示）。SEM图片显示（如附图5所示），DOX/n-HA/PLGA纳米纤维表面形貌光滑均匀，纤维之间无明显粘连，并且均具有较大的孔隙结构，纤维的平均直径为577±133nm，孔隙率为72.5%。

实施例4

将对比例1制备的静电纺PLGA（25%，w/v）、对比例2制备的静电纺n-HA/PLGA及实施例3制备的DOX/n-HA/PLGA纳米纤维毡剪成10×50的长条，每个样品有5个平行样，并用千分尺测量每条纤维毡的五个不同的位置的厚度，求其平均值。用万能材料测试机测试纤维毡的机械性能，得出应力-应变曲线、断裂强度和断裂伸长。从附图6可以看出，n-HA/PLGA和DOX/n-HA/PLGA复合纳米纤维毡的断裂强度因n-HA的加入而提高，杨氏模量也显著提高，这充分说明n-HA可作为纤维增强体，显著提高复合材料载体的机械性能。

实施例5

分别取100mg的实施例3中得到的静电纺DOX/n-HA/PLGA复合纳米纤维毡，置于装有10mL的pH=7.4的PBS缓冲液和pH=5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液的试剂瓶中，用于做缓释实验。同样方法取对比例3中制备的100mg DOX/PLGA复合纳米纤维毡和实施例2中制备的7.12mg DOX/n-HA纳米粉末作为对照。

将试剂瓶置于37℃的摇床中震荡，在不同的时间点，从试剂瓶中取出1.5mL溶液，再分别用1.5mL的pH=7.4的PBS缓冲液和pH=5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液补充。取出的缓释液用紫外分光光度计测试浓度，借助DOX在pH=7.4的PBS缓冲液和pH=5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液中的浓度-吸光度标定曲线，计算不同时间点的缓释百分率，分析n-HA/PLGA双载体载药系统的药物释放动力学特征。从附图7可以看出，与DOX/n-HA粉末和DOX/PLGA混纺的纳米纤维载药系统相比，在两种不同的pH的缓释液中静电纺DOX/n-HA/PLGA纳米纤维载药系统没有明显的“突释”现象，并且药物能够持续地释放。

实施例6

分别取80mg实施例3中得到的静电纺DOX/n-HA/PLGA复合纳米纤维毡，5.70mg实施例2制备的AMX/n-HA纳米粉体，80mg对比例3中得到的静电纺DOX/PLGA复合纳米纤维毡和0.8mg的纯DOX药物置于装有4mL的新鲜DMEM高糖培养基的六孔细胞培养板中，置于37℃细胞培养箱中缓释24h后用于细胞培养。取96孔培养板，KB细胞的种植密度为2×10⁴个/孔，并分别加入10μL、20μL、50μL和100μL不同的药物缓释培养液，再将培养基补充为200μL，放置在培养箱中，37℃、5%CO₂条件下培养24h，通过MTT比色法分析不同药物缓释液对癌细胞的杀伤能力。从附图8可以看出，相对于对照组（TCP），在DOX浓度为100μg/mL时，所有材料均表现出了抗癌活性；而当DOX的浓度低于100μg/mL时，DOX/n-HA/PLGA纳米纤维的仅显示了较弱的抗癌活性，主要是因为DOX从DOX/n-HA/PLGA纳米纤维中的释放速度较慢的缘故。

对比例1

将0.5g的PLGA溶解在2mL的THF/DMF（3：1）溶剂中，配制成质量百分比浓度为25%的溶液，静置过夜，制备成均一透明静电纺丝溶液，然后按照常规静电纺丝的方法制备纳米纤维毡，其中纺丝条件与实施例3中保持一致，制备的PLGA纳米纤维毡在真空干燥箱内干燥48h以除去残留的溶剂，待用。从附图5a可以看出，本发明制备的PLGA纳米纤维形貌规则、表面规整，具有较大的孔隙结构，孔隙率为71.5%，纤维直径为656±161nm。

对比例2

将25mg n-HA纳米粉末加入到2mL的THF/DMF（3：1）溶剂中，超声分散30~60min，将0.5g的PLGA溶解在上述混合液中，搅拌8h，配制成质量百分比浓度为5%（n-HA相对PLGA为5wt%）的均一静电纺丝液，然后按照常规静电纺丝的方法制备纳米纤维毡，其中纺丝条件与实施例3中保持一致。制备的n-HA/PLGA复合纳米纤维毡在真空干燥箱内干燥48h以除去残留的溶剂，待用。从附图5b可以看出，本发明制备的n-HA/PLGA纳米纤维形貌规则、表面规整，具有较大的孔隙结构，孔隙率为71.4%，纤维直径为634±152nm。

对比例3

将5mg DOX溶解在2mL的THF/DMF（3：1）溶剂中，将0.5g的PLGA溶解在上述溶液中，搅拌8h，配制成质量百分比浓度为1%（DOX相对PLGA为1wt%）的均一静电纺丝液，然后按照常规静电纺丝的方法制备纳米纤维毡，其中纺丝条件与实施例3中保持一致，制备的AMX/PLGA复合纳米纤维毡在真空干燥箱内避光干燥48h以除去残留的溶剂，待用。从附图5c可以看出，本发明制备的DOX/PLGA纳米纤维直径明显变小，但不影响其孔隙结构和纤维形貌，孔隙率为69.1%，纤维直径为338±70nm。

Claims

1.一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，包括：

（1）绘制盐酸阿霉素DOX水溶液的浓度-吸光度标准曲线；

（5）冷冻干燥步骤（4）中负载有DOX的n-HA，得到DOX/n-HA粉末，研磨均匀，并用筛网过滤；其中，DOX/n-HA为棒状结构；

（6）将上述DOX/n-HA超声分散在THF与DMF的混合溶剂中，再加入PLGA配成DOX/n-HA/PLGA静电纺丝溶液，纺丝溶液中PLGA与混合溶剂的质量体积比为1g:4～5mL，DOX与PLGA的质量比为1：100，采用静电纺丝即得有机无机杂化静电纺纳米载药纤维。

2.根据权利要求1所述的一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的绘制标准曲线的具体步骤为：将DOX溶于水中，制备n组不同浓度的DOX水溶液，其中n≥5；然后测量n组不同浓度的DOX水溶液的吸光值，绘制浓度-吸光度标准曲线。

3.根据权利要求1所述的一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的n-HA的终浓度为0.5mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的超声分散时间为30～50min。

5.根据权利要求1所述的一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的DOX的终浓度为0.5mg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的磁力搅拌时间为18～24h。

7.根据权利要求1所述的一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中离心的速度为4000～6000rpm，离心的时间为3～5min，沉淀的洗涤次数为2～3次。

8.根据权利要求1所述的一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中的筛网为325目筛。

9.根据权利要求1所述的一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中的混合溶剂中THF与DMF的体积比为3：1，超声分散时间为3～5min。

10.根据权利要求1所述的一种有机无机杂化静电纺纳米载药纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中的静电纺丝的工艺条件为：接收距离为10～20cm，电压为15kV-25kV，流速为0.8～1mL/h。