CN103741467A - 应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法 - Google Patents

应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法 Download PDF

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CN103741467A CN201310732584.7A CN201310732584A CN103741467A CN 103741467 A CN103741467 A CN 103741467A CN 201310732584 A CN201310732584 A CN 201310732584A CN 103741467 A CN103741467 A CN 103741467A
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Abstract

本发明涉及一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，包括：（1）以水为溶剂配置PVA/PEI纺丝液，然后进行静电纺丝，干燥后在含有戊二醛溶液的干燥器中真空交联处理，得到水稳定性良好的PVA/PEI纳米纤维；（2）将活化好的透明质酸加入到水稳定性良好的PVA/PEI纳米纤维中，摇床上反应得到透明质酸功能化修饰的静电纺PVA/PEI纳米纤维；再加入三乙胺及乙酸酐将PEI/PVA纳米纤维膜表面剩余的氨基全部进行乙酰化处理，最后洗涤、干燥，即可。本发明原料价格低廉、制备工艺简单，制备的透明质酸功能化静电纺纳米纤维具有良好的形貌及结构稳定性、生物相容性和血液相容性，应用前景广阔。

Description

应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法
技术领域
本发明属于靶向捕获癌细胞纳米材料的制备领域，特别涉及一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法。
背景技术
纳米纤维材料是一种新型材料，是纳米科学领域中的前沿技术。其中，高分子纳米纤维是一个重要的研究方向，有着广泛的应用价值。尤其通过一些表面修饰作用，使高分子纳米纤维材料具有双重性质，这更是得到了科学工作者的广泛关注，也将在未来有着广泛的应用前景。
静电纺丝技术在制备纳米纤维方法中，有着明显的优势。运用静电纺丝技术可以降低成本，并且制造过程简单方便。且制备的纳米纤维的比表面积大、孔隙率高。通过该方法制备的纤维尺寸在十几纳米到几个微米之间。受到细胞表面组分和细胞外基质支架的纳米特征的启发，人们对活细胞和纳米结构材料的相互作用进行了大量研究，发现纳米材料在实际应用中可以影响细胞的行为，如粘附、生存力、迁移、分化以及形态等。目前静电纺纳米纤维在药物缓释、基因治疗、组织工程、创伤敷料、纺织材料、生物传感器和环境等方面都有着广泛的应用。
除了制备一些具有不同的溶解性和熔融性的聚合物之外，还可以通过后续修饰得到具有一定功能的纳米纤维材料。Chan等人在静电纺胶原蛋白纳米纤维表面固定能特异性识别CD29及CD49a的抗体，结果证明在30min内可捕获55%的骨髓间充质干细胞。Zhang等人首先在TiO2纳米纤维表面用硅烷偶联剂γ-巯丙基三甲氧基硅处理30min，然后经N-羟基琥珀酰亚胺酸处理1h，抗生蛋白链菌素反应30min，最后将肿瘤细胞抗体接枝到其表面。结果显示，其可以大大提高癌细胞捕获的效果，且细胞含有很多丝状伪足，与纤维表面紧密接触，具有较大的粘附力。
透明质酸是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的线性天然高分子，在细胞外基质及正常组织中均有存在。除了具有良好的生物相容性及非免疫性外，其表面上的羧基很容易与其他物质共价结合。大量的研究报道了HA与表面表达CD44的癌细胞之间的相互作用，目前已广泛采用HA来靶向过度表达CD44的癌细胞。其中，CD44在许多种癌细胞如上皮癌、淋巴癌、乳腺癌及肺癌中均有表达。
Ma等人将HA接枝到介孔二氧化硅纳米粒子表面并用于药物载体，细胞试验表明MSNs-HA能够选择性的靶向到过度表达CD44蛋白的癌细胞上，且对该癌细胞具有较强的细胞毒性。El-Dakdouki等人制备了透明质酸/磁性氧化铁纳米颗粒用于MRI成像对比剂，且证明其能够有效地靶向到肿瘤组织中。
聚乙烯醇（PVA）由于具有优异的生物可降解性、生物相容性，在外科用缝合线、体内植入材料、药物载体及组织工程支架方面有着广泛的应用。聚乙烯亚胺（PEI）表面含有大量氨基，表面易修饰，且与PVA混纺可提高其水稳定性，目前正受到越来越广泛的关注。Fang等[Fang,H.,et al.,Facile immobilization of gold nanoparticles into electrospunpolyethyleneimine/polyvinyl alcohol nanofibers for catalytic applications.Journal of MaterialsChemistry,2011.21(12):p.4493-4501.]通过原位还原法制备得到含有金纳米颗粒的PVA/PEI纳米纤维应用于4-硝基酚的催化性能研究。结果显示纤维膜的催化性能可以达到97%以上，且在不添加任何助剂的情况下进行第二次，第三次催化实验，催化性能仍然可以达到和第一次催化实验相似的效果。但是，目前关于PVA/PEI纳米纤维应用于生物领域，尤其是靶向捕获癌细胞鲜有报道。
纳米纤维可作为癌细胞的有效载体，使得癌细胞的有效捕获及早期检测成为可能。因此，将静电纺纳米纤维与细胞捕捉靶向基团进行连接，有望制备一种短时间内即具有增强的靶向特异性捕获癌细胞的材料，实现血液中癌细胞的分离与癌症早期检测。
检索国内外相关文献和专利结果表明：应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，该方法的原料价格低廉、制备工艺简单，制备的透明质酸功能化纳米纤维具有良好的形貌及结构稳定性、生物相容性和血液相容性，短时间内即具有增强的靶向特异性捕获癌细胞的效果，具有潜在的血液中癌细胞分离与癌症早期检测的应用前景。
本发明的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，包括：
（1）以水为溶剂配置PVA/PEI纺丝液，其中PVA与PEI的质量比为3:1；采用所述的PVA/PEI纺丝液进行静电纺丝制备纳米纤维，干燥后在含有戊二醛溶液的干燥器中真空交联处理，得到水稳定性良好的PVA/PEI纳米纤维；
（2）将透明质酸溶于水中，采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺活化，然后将活化好的透明质酸加入到步骤（1）得到的水稳定性良好的PVA/PEI纳米纤维中，摇床上反应3d，得到透明质酸功能化修饰的静电纺PVA/PEI纳米纤维；再加入三乙胺及乙酸酐将PEI/PVA纳米纤维表面剩余的氨基全部进行乙酰化处理，最后洗涤、干燥，即得透明质酸功能化纳米纤维HA-PVA/PEI-Ac。
所述步骤（1）中PVA的Mn为88,000；PEI的Mn为25,000，且137.5935g PEI中含有伯胺（R-NH2）1.08mol、仲胺（R2-NH）1.49mol、叔胺（R3-N）1mol。
所述步骤（1）中纺丝液PVA/PEI的总质量百分比浓度为12wt%。
所述步骤（2）中HA的Mn为37,200。
所述步骤（2）中PVA/PEI纳米纤维膜中含有的伯胺和仲胺的摩尔数之和与HA的摩尔比为1:1。
所述步骤（2）中洗涤为用去离子水洗涤3-5次。
所述步骤（2）中干燥为真空干燥，干燥时间为12-24h。
所述步骤（2）中得到透明质酸功能化纳米纤维HA-PVA/PEI-Ac应用于制备表面表达CD44的癌细胞的特异性捕获药物。
本发明中HA与PVA/PEI纳米纤维反应过程：
称取PVA/PEI纳米纤维的质量为120.4mg，按照质量比PVA:PEI=3:1计算得知PEI的质量为30.1mg。根据每137.5935g的PEI中含有伯胺（R-NH2）1.08mol，仲胺（R2-NH）1.49mol，叔胺（R3-N）1mol，其中能参与酰胺化反应的，只有伯胺和仲胺。因此，经过计算120.4mg的纤维膜中，可以参与酰胺化反应的氨基为0.563mol。以摩尔比羧基：氨基=1：1计算，所需的HA为0.563mol，质量为213.94mg。以摩尔比HA:EDC:NHS=1:5:5计算，EDC的量为539.64mg，NHS的量为323.98mg，分别溶于10mL水中，缓慢逐滴加入到含有213.94mgHA的10mL水溶液中，从而以总体积为30mL的反应体系进行活化反应3h，将30mL的HA反应液加到PVA/PEI纳米纤维膜的培养皿中，摇床反应3d。
根据已经计算出的该纳米纤维含有0.563mol的氨基，以5倍过量进行乙酰化处理，三乙胺的浓度为0.727g/mL，计算所需的体积为391.82uL，反应30-60min，乙酸酐的浓度为1.08g/mL，计算所需的体积为266.10uL，继续反应12-24h。
本发明基于透明质酸功能化静电纺纳米纤维，通过培养表面表达CD44受体的人宫颈癌细胞（Hela）及表面不表达CD44受体的人恶性胶质母细胞瘤细胞（U87MG）在所制备材料及对照材料（不含有HA）上培养，对产品靶向捕获癌细胞性能进行评价。
通过扫描电镜（SEM）、傅里叶变换-红外光谱（FTIR）等技术对制备的材料进行相关结构性质的表征；通过MTT细胞活力实验及溶血、抗凝血实验对制备的材料进行生物相容性及血液相容性的评价；借助激光共聚焦显微镜及细胞计数器，研究材料对癌细胞的特异捕获性能。
和对照的未经透明质酸功能化修饰的静电纺PVA/PEI纳米纤维捕获癌细胞的效果相比，本发明制备的材料捕获Hela细胞的数量明显超过未经透明质酸修饰的对照材料，且Hela细胞在该材料上均伸出丝状伪足，紧紧粘附在纳米纤维膜上，而在对照材料上细胞呈现球形，粘附形态较差。因此本发明制备的透明质酸功能化纳米纤维能够作为新型材料用于癌细胞的特异性捕获。
纤维形貌及结构稳定性扫描电镜图（SEM）表征、傅里叶变换-红外光谱（FTIR）、MTT生物相容性、溶血及抗凝血性能研究、Hela细胞捕获的激光共聚焦显微镜（CLSM）定性试验、Hela细胞在纳米纤维上粘附形态扫描电镜表征、Hela细胞捕获特异性定量试验以及U87MG细胞捕获特异性定量试验结果分别如下：
（1）扫描电镜图（SEM）结果
SEM图用于表征纳米纤维的形貌和直径大小。参见说明书附图1，所得到的PVA/PEI纳米纤维外观呈现白色（附图1a），形貌规整，表面光滑，平均直径为459.7±36.1nm。
经戊二醛交联处理后，纤维外观呈现粉色（附图1b），这主要由于PEI上的氨基和戊二醛上的氨基形成的缩醛所致。将戊二醛交联处理后水稳定性良好的纳米纤维浸润在水溶液中7d后，纤维形貌保持良好，没有粘连现象，纤维平均直径增加到660.8±95.7nm，可能是因为纤维在水溶液中发生溶胀导致。
参见说明书附图2，将HA修饰到PVA/PEI纳米纤维表面后（附图2a），纤维仍然保持良好形貌与多孔结构，其平均直径与经戊二醛交联浸润在水溶液中7d后的纳米纤维接近，为654.8±92.2nm，对照材料未经HA修饰的PVA/PEI纳米纤维（附图2b）直径为694.5±70.0nm。
（2）傅里叶变换-红外光谱（FTIR）结果
FTIR结果表明，HA成功修饰到PVA/PEI纳米纤维表面。参见说明书附图3，从图上可以看出，2940cm-1是-CH2-的特征峰。位于1650cm-1处的氨基N-H键的特征峰则表明交联后PEI纳米纤维上面仍保留有部分氨基，有利于后续的纳米反应器进行表面功能化修饰的应用研究。HA在1600cm-1处存在振动吸收峰，同时，HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维表在1600cm-1处也存在振动吸收峰，这说明PVA/PEI纳米纤维表面有HA的存在，即HA成功修饰到纤维表面。
（3）MTT生物相容性结果
参见说明书附图4，在不同时间点，L929细胞在HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维表面的增殖活性明显优于其在对照组（盖玻片）表面的增殖活力。经过对MTT数据进行数学分析得知，培养3d后，L929细胞在HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维表面与盖玻片表面的活力存在显著的统计学差异，且培养7d后，L929细胞在HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维表面、PVA/PEI-Ac纳米纤维表面均与盖玻片表面的活力存在显著的统计学差异。这说明HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维的生物活性明显优于盖玻片。
（4）溶血性能结果
参见说明书附图5，当HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL时，血红细胞均可以在离心作用下完整的分离出来，亦即两种材料在不同浓度下均未使血红细胞涨破。为从定量角度进一步衡量材料的溶血性能，通过UV-Vis测量不同浓度条件下，两种材料处理后的PBS中血红蛋白的含量。由说明书附图5及附表1可知，人血红细胞与各实验浓度下的材料共培养2h并经离心后，上清液中血红蛋白的含量明显低于对照组（蒸馏水），且计算得知在实验浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL条件下，HA-PVA/PEI-Ac的溶血率分别为（0.19±0.03）%、（1.13±0.22）%、（2.05±0.59）%，PVA/PEI-Ac的溶血率分别为（0.44±0.03）%、（2.30±0.72）%、（3.68±0.81）%，其值均低于5%，表明在实验浓度范围内，HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维均不能使人血细胞产生溶血现象，具有良好的血液相容性。
（5）抗凝血性能结果
参见说明书附图6，在不同时间点，上清液中血红蛋白的含量均高于对照组（盖玻片），说明HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维的抗凝血性能优与盖玻片组。随着培养时间的增加，血红蛋白的含量均有所降低，这是因为在体外血红细胞会不可避免的发生凝固。经数据分析可以得知，在不同时间段，盖玻片组和纤维材料组血红蛋白的含量均存在明显的差异，这说明HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维均具有较好的抗凝血作用。
（6）Hela细胞捕获的激光共聚焦显微镜（CLSM）定性试验结果
以表面表达CD44受体的人宫颈癌细胞（Hela）为模型细胞来检验两种材料HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维捕获Hela细胞的效果。参见说明书附图7，试验结果表明，在不同的培养时间点（5min、20min、40min、60min、120min、240min），含有靶向分子HA的纳米纤维可以捕获更多的癌细胞。尤其在60min、120min、240min时，两种材料捕获癌细胞的数量相差最为明显。这主要是因为含有靶向分子的材料具备更强的特异性，但细胞的粘附需要一定的时间。
（7）Hela细胞在纳米纤维上粘附形态扫描电镜表征
SEM图用于表征细胞在纳米纤维上的微形貌，参见说明书附图8，Hela细胞在HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维两种材料上培养60min、120min、240min后，细胞在HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维表面均伸出丝状伪足，紧紧粘附在纳米纤维膜上，而在对照材料PVA/PEI-Ac纳米纤维上细胞呈现球形，粘附形态较差。这表明透明质酸具有一定的靶向作用，可在短时间内促进表面表达CD44受体的细胞在其表面粘附生长。
（8）Hela细胞捕获特异性定量试验结果
以表面表达CD44受体的人宫颈癌细胞（Hela）为模型细胞来检验两种材料HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维捕获Hela细胞的数量。参见说明书附图9，试验结果表明，经过40min、60min、120min、240min培养后，HA-PVA/PEI-Ac捕获癌细胞的数量远远高于PVA/PEI-Ac纳米纤维，且其捕获细胞的数量具有显著性差异。
（9）U87MG细胞捕获特异性定量试验结果
以表面不表达CD44受体的人恶性胶质母细胞瘤细胞（U87MG）为模型细胞来检验两种材料HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维捕获U87MG细胞的数量。参见说明书附图10，试验结果表明，经过10min、20min、40min、60min、120min、240min培养后，HA-PVA/PEI-Ac捕获癌细胞的数量与PVA/PEI-Ac纳米纤维几乎相同，没有显著性差异。这说明，这种靶向分子修饰的功能化纳米纤维仅对特定的细胞具有高效捕获作用。
本发明采用静电纺丝法制备PVA/PEI纳米纤维，充分利用纳米纤维与细胞表面成分（如微绒毛及丝状伪足）及细胞外基质具有相类似的结构，可促进细胞在其表面的粘附及增值；同时，纳米纤维比表面积大、孔隙率高，可提供足够的细胞接触位点；并且纳米纤维易于表面修饰的优势。结合靶向分子的与细胞间的特异结合能力，可达到短时间内靶向特异性捕获癌细胞的目的。
有益效果：
（1）本发明原料价格低廉、制备工艺简单，具有扩大规模生产的可能性；
（2）本发明制备的透明质酸功能化纳米纤维具有良好的形貌及结构稳定性、生物相容性和血液相容性；
（3）本发明制备得到的透明质酸功能化纳米纤维短时间内即具有增强的靶向特异性捕获癌细胞的效果，为应用于血液中癌细胞分离与癌症早期检测的纳米材料的开发打下了良好的实验基础。
附图说明
图1为本发明制备的PVA/PEI纳米纤维戊二醛交联前（a）、后（b）的扫描电镜图及直径分布；
图2为本发明制备的HA-PVA/PEI-Ac（a）与PVA/PEI-Ac（b）纳米纤维的扫描电镜图及直径分布；
图3为本发明制备PVA/PEI纳米纤维、戊二醛交联PVA/PEI、HA及HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维的红外图谱；
图4为本发明制备HA-PVA/PEI-Ac及PVA/PEI-Ac纳米纤维表面小鼠成纤维细胞增殖的细胞活力测试结果；
图5为本发明制备的HA-PVA/PEI-Ac及PVA/PEI-Ac纳米纤维处理2h后对人血细胞的溶血效应（插图为反应其溶血现象的数码照片）；
图6为本发明制备的HA-PVA/PEI-Ac及PVA/PEI-Ac纳米纤维的抗凝血行为；
图7为本发明制备的HA-PVA/PEI-Ac及PVA/PEI-Ac纳米纤维对Hela细胞捕获的共聚焦显微镜图片；
图8为Hela细胞在本发明制备的HA-PVA/PEI-Ac及PVA/PEI-Ac纳米纤维表面培养60min、120min、240min后的细胞形态；
图9为本发明制备的HA-PVA/PEI-Ac及PVA/PEI-Ac纳米纤维在不同时间内（10min、20min、40min、60min、120min、240min）捕获Hela细胞的数量；
图10为本发明制备的HA-PVA/PEI-Ac及PVA/PEI-Ac纳米纤维在不同时间内（10min、20min、40min、60min、120min、240min）捕获U87MG细胞的数量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
称取9.68732g PVA，将其溶解在71.04g超纯水中，用玻璃棒缓慢搅拌约30分钟直至PVA粉末完全溶胀，随后放置在磁力搅拌器上80℃水浴加热搅拌3h，得到均匀的浓度为12wt%的PVA溶液。
称取15g已配置好的12wt%的PVA纺丝液，其中PVA的量为1.8g，根据设定混合溶液中PVA与PEI固体的质量比为3:1，从而得出所需PEI的质量为0.6g，称取0.6gPEI加入到15g12wt%的PVA纺丝液中，继续加入4.4g水，涡旋混合仪混合后然后用超声30min使其分散均匀，磁力搅拌过夜，得到纺丝液PVA/PEI的总质量百分比浓度为12wt%。
所采用纺丝工艺条件为：纺丝的电压18.6kV，其中正压为13.6kV，负压为-5kV；流速0.3mL/h；接收距离为25cm；环境湿度40-50%。将纤维毡真空条件下干燥12-24h。
所得到的PVA/PEI纳米纤维外观呈现白色，SEM结果显示其形貌规整，表面光滑，平均直径为459.7±36.1nm（附图1a）。
实施例2
将实施例1制备的PVA/PEI纳米纤维毡套在盛有25%的戊二醛溶液的培养皿上方，将两者一起放入干燥器中，抽真空交联18h。所得到的PVA/PEI纳米纤维外观呈现粉色，将戊二醛交联处理后的纳米纤维浸润在水溶液中7d后，SEM结果显示纤维形貌保持良好，没有粘连现象，纤维平均直径增加到660.8±95.7nm（附图1b），表明纤维水稳定性良好。
实施例3
称取PVA/PEI纳米纤维的质量为120.4mg，按照质量比PVA:PEI=3:1计算得知PEI的质量为30.1mg。根据每137.5935g的PEI中含有伯胺（R-NH2）1.08mol，仲胺（R2-NH）1.49mol，叔胺（R3-N）1mol，其中能参与酰胺化反应的，只有伯胺和仲胺。因此，经过计算120.4mg的纤维膜中，可以参与酰胺化反应的氨基为0.563mol。以摩尔比羧基：氨基=1：1计算，所需的HA为0.563mol，质量为213.94mg。以摩尔比HA:EDC:NHS=1:5:5计算，EDC的量为539.64mg，NHS的量为323.98mg，分别溶于10mL水中，缓慢逐滴加入到含有213.94mgHA的10mL水溶液中，从而以总体积为30mL的反应体系进行活化反应3h，将30mL的HA反应液加到PVA/PEI纳米纤维膜的培养皿中，摇床反应3d。
根据已经计算出的该纳米纤维含有0.563mol的氨基，以5倍过量进行乙酰化处理，三乙胺的浓度为0.727g/mL，计算所需的体积为391.82uL，反应30-60min，乙酸酐的浓度为1.08g/mL，计算所需的体积为266.10uL，继续反应12-24h。去离子水洗涤3-5次，真空干燥，得到HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维。
SEM结果显示将HA修饰到PVA/PEI纳米纤维表面后（附图2a），纤维仍然保持良好形貌与多孔结构，其平均直径与经戊二醛交联浸润在水溶液中7d后的纳米纤维接近，为654.8±92.2nm。FTIR（附图3）表明HA已成功修饰到PVA/PEI纳米纤维表面。
实施例4
将实施例3制备的HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维与对比例1制备的PVA/PEI-Ac纳米纤维从铝箔上揭下，剪成圆形(Φ=14mm)，然后将样品放入24孔培养板，用钢环固定。另外，将只放玻片的孔和空白孔（TCP培养板）作为对照，对照孔同样加钢环。不同时间点的样品要放置在不同的培养板中，每个样品4个平行样。放好样品后，加入约1mL的75%酒精浸泡2小时，同时，开紫外灯杀菌。杀菌完毕后，吸出酒精，用PBS溶液浸泡漂洗3次，每次20分钟。最后用400μL纯的DMEM培养基浸泡，放入CO2培养箱过夜。
从培养箱取出24孔培养板，吸出之前加入的纯的培养基，按照1.5×104个/孔的密度接种，每孔体积400μL，然后将培养板盖好，“8”字形摇匀，放置在培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养1d、3d、7d，每2d更换一次培养基。
将培养到一定时间的细胞从培养箱取出，吸掉原来的培养基，用PBS溶液冲洗3次，然后每孔加细胞培养基360μL，MTT40μL，放入培养箱培养4h，使细胞与MTT充分反应。4h后，吸去培养基，每孔加入400μL DMSO，摇床慢速摇20分钟，使沉淀溶解，然后从每个孔移取100μL溶液加入96孔培养板中，用Mk3酶标仪（Thermo）测甲臜溶液在570nm处的吸光值。
MTT测试结果显示，培养3d后，L929细胞在HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维表面与盖玻片表面的活力存在显著的统计学差异，且培养7d后，L929细胞在HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维表面、PVA/PEI-Ac纳米纤维表面均与盖玻片表面的活力存在显著的统计学差异。这说明HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维的生物活性明显优于盖玻片（附图4）。
实施例5
取肝素锂稳定的健康成年人全血5mL，离心3min（转速为3000r/min），用PBS洗涤沉淀3次，得血红细胞。用PBS按照1：35的比例配置成人血红细胞悬浊液，于4℃冰箱中备用。对照组将0.2mL人血红细胞悬浊液分别溶于0.8mLPBS中和0.8mL蒸馏水中。然后，将所配置的人血红细胞悬浊液再稀释5倍，按照纤维毡质量：稀释5倍后人血红细胞悬浊液体积之比为2mg:1mL、4mg:1mL、6mg:1mL将实施例3制备的HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维与对比例1制备的PVA/PEI-Ac纳米纤维浸入稀释5倍后人血红细胞悬浊液中，同一浓度下HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维均取4个平行样，在37℃环境下孵育2h。然后，取出纤维毡，将两个对照组及浸泡过纤维毡的人血红细胞悬浊液离心1min（1000rpm），取上清液并用Lamada25型紫外分光光度计测试上清液在540nm处的吸光值。溶血试验结果表明，在实验浓度范围内，HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维均不能使人血细胞产生溶血现象，具有良好的血液相容性（附图5）。
表1HA-PVA/PEI-Ac及PVA/PEI-Ac纳米纤维处理2h后对人血细胞的溶血率
实施例6
将实施例3制备的HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维与对比例1制备的PVA/PEI-Ac纳米纤维从铝箔上揭下，剪成圆形(Φ=14mm)，放入12孔培养板，每个样品取4个平行样（对照组为：直径1.4cm的盖玻片）。然后，向每孔中纤维毡以及对照组盖玻片上滴加20μL肝素锂稳定的健康成年人全血，同时加10μL CaCl2溶液（0.2mol/L），置于37℃环境下孵育5min、10min、20min、40min、60min。在每个培养时间结束后，向每孔加5mL蒸馏水并37℃孵育5分钟，然后用Lamada25型紫外分光光度计测试溶液在540nm处的吸光值。抗凝血试验结果表明，HA-PVA/PEI-Ac与PVA/PEI-Ac纳米纤维的抗凝血性能均优于盖玻片组（附图6）。
实施例7
以表面表达CD44受体的人宫颈癌细胞（Hela）为模型细胞来检验将实施例3制备的HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维与对比例1制备的PVA/PEI-Ac纳米纤维特异性捕获Hela细胞的效果。将纳米纤维从铝箔上揭下，剪成圆形(Φ=14mm)，然后将样品放入24孔培养板，用钢环固定。不同时间点的样品要放置在不同的培养板中，每个样品4个平行样。放好样品后，加入约1mL的75%酒精浸泡2h，同时，开紫外灯杀菌。杀菌完毕后，吸出酒精，用PBS溶液浸泡漂洗3次，每次20分钟。最后用400μL纯的DMEM培养基浸泡，放入CO2培养箱过夜。
从培养箱取出24孔培养板，吸出之前加入的纯的培养基，按照5×104个/孔的密度接种，每孔体积400μL，然后将培养板盖好，“8”字形摇匀，放置在培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养不同时间后（5min、20min、40min、60min、120min、240min），吸取上清液，并且用PBS将纤维毡清洗三遍，收集PBS清洗液使之与上清液混合，离心5min，速度为1000rpm，并将其用一定体积培养液吹打均匀，用细胞计数器测定该培养液中剩余细胞的个数，计算得知纤维毡表面在不同时间内捕获Hela细胞的数量。激光共聚焦显微镜结果定性表明含有靶向分子HA的纳米纤维可以捕获更多的癌细胞（附图7）；SEM结果表明培养60min、120min、240min后，细胞在HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维表面均伸出丝状伪足，紧紧粘附在纳米纤维膜上，而在PVA/PEI-Ac纳米纤维上细胞呈现球形，粘附形态较差（附图8）；细胞计数结果表明，经过40min、60min、120min、240min培养后，HA-PVA/PEI-Ac捕获癌细胞的数量远远高于PVA/PEI-Ac纳米纤维，且两种材料捕获细胞的数量具有显著性差异（附图9）。
对比例1
称取PVA/PEI纳米纤维的质量为121.11mg，按照质量比PVA:PEI=3:1计算得知PEI的质量为30.28mg。根据每137.5935g的PEI中含有伯胺（R-NH2）1.08mol，仲胺（R2-NH）1.49mol，叔胺（R3-N）1mol，其中能参与酰胺化反应的，只有伯胺和仲胺。因此，经过计算121.11mg的纤维膜中，参与酰胺化反应的氨基为0.566mol,以5倍过量进行乙酰化处理，三乙胺的浓度为0.727g/mL，计算所需的体积为393.90uL，反应30-60min，乙酸酐的浓度为1.08g/mL，计算所需的体积为267.51uL，继续反应12-24h。去离子水洗涤3-5次，真空干燥，得到PVA/PEI-Ac纳米纤维。
SEM结果显示PVA/PEI-Ac纳米纤维仍然保持良好形貌与多孔结构，其平均直径为694.5±70.0nm（附图2b）。
对比例2
以表面不表达CD44受体的人恶性胶质母细胞瘤细胞（U87MG）为模型细胞来检验实施例3制备的HA-PVA/PEI-Ac纳米纤维及对比例1制备的PVA/PEI-Ac纳米纤维特异性捕获不表达CD44受体的U87MG细胞的效果。材料处理方法同实施例7。细胞计数结果表明，经过10min、20min、40min、60min、120min、240min培养后，HA-PVA/PEI-Ac捕获癌细胞的数量与PVA/PEI-Ac纳米纤维几乎相同，没有显著性差异（附图10）。

Claims (8)

1.一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，包括：
（1）以水为溶剂配置PVA/PEI纺丝液，其中PVA与PEI的质量比为3:1；采用所述的PVA/PEI纺丝液进行静电纺丝制备纳米纤维，干燥后在含有戊二醛溶液的干燥器中真空交联处理，得到水稳定性良好的PVA/PEI纳米纤维；
（2）将透明质酸溶于水中，采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺活化，然后将活化好的透明质酸加入到步骤（1）得到的水稳定性良好的PVA/PEI纳米纤维中，摇床上反应3d，得到透明质酸功能化修饰的静电纺PVA/PEI纳米纤维；再加入三乙胺及乙酸酐将PEI/PVA纳米纤维表面剩余的氨基全部进行乙酰化处理，最后洗涤、干燥，即得透明质酸功能化纳米纤维HA-PVA/PEI-Ac。
2.根据权利要求1所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中PVA的Mn为88000；PEI的Mn为25000，且137.5935g PEI中含有伯胺1.08mol、仲胺1.49mol、叔胺1mol。
3.根据权利要求1所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中纺丝液PVA/PEI的总质量百分比浓度为12wt%。
4.根据权利要求1所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中HA的Mn为37200。
5.根据权利要求1所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中PVA/PEI纳米纤维膜中含有的伯胺和仲胺的摩尔数之和与HA的摩尔比为1:1。
6.根据权利要求1所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中洗涤为用去离子水洗涤3-5次。
7.根据权利要求1所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中干燥为真空干燥，干燥时间为12-24h。
8.根据权利要求1所述的一种应用于靶向捕获癌细胞的透明质酸功能化纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中得到透明质酸功能化纳米纤维HA-PVA/PEI-Ac应用于制备表面表达CD44的癌细胞的特异性捕获药物。
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