CN1843515A

CN1843515A - 纳米羟基磷灰石/丝素蛋白－壳聚糖复合支架及其制备方法

Info

Publication number: CN1843515A
Application number: CN 200610009993
Authority: CN
Inventors: 王静; 温广武; 孟庆昌; 李慕勤; 孟祥才
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2006-04-29
Filing date: 2006-04-29
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2026-04-29
Also published as: CN100563727C

Abstract

纳米羟基磷灰石/丝素蛋白－壳聚糖复合支架及其制备方法，属于组织工程技术领域。为了解决现有制备支架的方法引进了有毒的有机溶剂损害了材料的生物活性，材料内部结构气孔尺寸小气孔率低，气孔连通性不好，不利于骨细胞的粘附分化增殖生长等缺点，本发明的复合支架的材质由无机材料和有机材料复合而成，无机材料为纳米羟基磷灰石，有机材料为丝素蛋白和壳聚糖，无机材料和有机材料的重量比为50～70∶30～50，丝素蛋白和壳聚糖的重量比为1∶1～2，采用冷冻干燥方法制备上述支架。本发明细胞支架气孔率在75％～90％之间。气孔尺寸为150～500μm，气孔连通性良好，抗压强度为0.85～1.85Mpa之间。

Description

米羟基磷灰石/丝素蛋白—壳聚糖复合支架及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，涉及一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白—壳聚糖复合支架及冷冻干燥制备该复合支架的方法。

背景技术

人体组织器官受损以后，最理想的治疗方法就是采用与之完全相同的器官代之。基于此，近十年来发展出了组织工程技术。采用组织工程技术修复组织器官缺陷的过程，是将组织细胞吸附于生物相容性好，并被人体逐步降解吸收的框架材料上，同时细胞(在生长因子的控制下)逐步繁殖出人体的组织。该支架材料为细胞提供一个生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，使细胞能够在预先设计的三维形状支架上生长。支架不仅起支撑作用还起模板作用，为细胞提供赖以寄宿、生长、分化、增殖的场所，从而引导受损组织的再生。支架材料的选择和制备是组织工程技术成功应用的基础。

理想的仿生骨基质材料应具有良好的生物学功能、力学性能、多孔性、细胞亲和性、骨诱导性，以及材料降解消失与组织再生的时空匹配性。对于骨组织工程支架，多孔性、细胞的亲和性、时空匹配性至关重要。但目前没有理想的支架。

如何选择材料增加细胞的亲和性和设计支架的结构以利于细胞在其上粘附、繁殖、生长，制备满足骨组织工程要求的细胞支架，形成与人体骨相同的器官，具有重要理论价值、应用价值和广阔的应用前景。

众所周知：天然骨基质是由无机物矿物和生物大分子排列所组成的复合体，前者主要为纳米级羟基磷灰石(HA)，后者主要为胶原蛋白和少量多糖，两者极为均匀一致、有序结合在一起。

选择合适的材料通过材料自身因素的优化设计如何制备满足骨组织工程要求的细胞支架，赋予其诱导骨再生的生物功能支架充分发挥再生的潜力，是目前组织工程研究的主要内容。设计细胞支架采用复合手段解决理想支架问题可能是一种有效方法，也是一个重要的发展方向。

羟基磷灰石因具有优良的骨传导性、生物相容性被广泛应用于骨修复领域，但它的固有脆性、极低的降解速率限制了其在骨组织工程中的应用。为克服此缺点，从仿生学角度出发，期望与有机物复合利用二者的不同特性取长补短，通过材料自身因素的优化设计，合理的采用加工制备技术赋予支架骨再生的功能。

目前在组织工程中使用的合成高分子材料，聚乳酸等脂肪族聚酯材料据主导地位。因其安全性经住几十年的临床考验得到确认；材料的基本性能(力学、体内降解)良好。在日前阶段一定程度上满足了研究开发的需要。但是，随着研究的深入，聚交酯类材料的一些弱点也渐渐显露出来，从降解速率的可控性而言。聚交酯材料用于组织再生或创伤愈合时，其降解行为往往是很不理想的。组织构筑所需力学性能和降解特性两者不能协调。欲确保支撑强度就要提高结晶度，导致长久残留较大量的未降解物，以至妨碍组织的持续再生；反之，为了避免这种物质继续残留就要加快降解速度，必然会过早地失去材料对细胞和组织的支撑作用。聚交酯材料的体内降解行为中另一个问题，高结晶度的聚交酯材料在体内容易形成针状结晶产物，长时间残留往往会刺激细胞引起炎症。

合成高分子在生物相容性和细胞粘附能力方面远不如天然高分子。因此选用天然高分子材料作为支架材料便成为理想的途径之一。

目前报道制备支架的方法主要有溶液浇铸/粒子沥滤，熔融成型，气体发泡，相分离/乳化等方法，这些方法中不是引进了有毒的有机溶剂损害了材料的生物活性，就是材料内部结构气孔尺寸小、气孔率低、气孔连通性不好，不利于骨细胞的粘附、分化、增殖生长等缺点。

发明内容

为了解决现有制备支架的方法引进了有毒的有机溶剂损害了材料的生物活性，材料内部结构气孔尺寸小气孔率低，气孔连通性不好，不利于骨细胞的粘附分化增殖生长等缺点，本发明提供一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白—壳聚糖复合支架及其制备方法。

本发明的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白—壳聚糖复合支架的材质由无机材料和有机材料复合而成，所述无机材料为纳米羟基磷灰石，有机材料为丝素蛋白和壳聚糖，无机材料和有机材料的重量比为50～70∶30～50，丝素蛋白和壳聚糖的重量比为1∶1～2。

本发明按照如下方法制备纳米羟基磷灰石/丝素蛋白—壳聚糖复合支架：a、首先在80～100℃下将丝素溶于氯化钙/乙醇/水三元溶液中裂解10～60min，；b、将壳聚糖溶解于乙酸溶液后加入到丝素/氯化钙溶液中，然后加蒸馏水稀释为0.1～0.5mol/l的溶液，充分搅拌得混合共溶液，其中丝素与壳聚糖的重量比为1∶1～2；c、将磷酸氢二铵溶液逐滴加入到混合共溶液中，预先设计先驱体羟基磷灰石中Ca/P摩尔比为1.67，加入氨水调节反应液的PH值为7～11，机械搅拌下室温反应1～5h，静止陈化10～30h，离心、真空干燥，得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/壳聚糖复合复合粉末；d、将上述复合粉末加入蒸馏水中，然后加入乙酸，使有机物的重量体积浓度介于2.5～10％之间，超声分散20～50min，4℃放置2～8小时使其凝胶化，预冷、冷冻干燥，制得复合支架。

丝素蛋白是一种在体内可被缓慢降解吸收的天然高分子蛋白质，有丰富的营养价值，有十八种氨基酸组成，具有防止疾病的功效，蛋白质对人体具有安全性、亲和性、无过敏反应等优点，且具有独特的性能：细胞亲和性、柔韧性、吸湿性、通透性，结构上有晶区和非晶区混合结构，生物相容性好，非晶区有许多碱性氨基酸对细胞有吸附作用，维持细胞正常形态和功能是良好的天然支架材料，又其支链有生长和粘附因素，可设计为组织工程支架在体外可支持骨和韧带的形成，在组织工程中具有广泛的应用前景。研究已证明：丝素蛋白具有与胶原蛋白相同的生物相容性，但与胶原蛋白比较其价格便宜，容易大量获得且不存在免疫原性的问题，是理想的胶原蛋白的代替材料。

壳聚糖是一种唯一带正电的碱性多糖，其结构与细胞外基质糖胺聚糖相似，在体内可被较快的降解吸收，研究表明壳聚糖可有效增强骨前体组织的分化并促进骨形成过程，但壳聚糖单独用于硬组织修复有强度不足的缺陷。

本发明选用以上降解速率不同的要素材料取长补短，设计仿生骨基质材料(细胞支架)就是从成骨原理出发，以利于成骨为手段，以成骨为目的，复合过程中兼顾材料学与生物学特性，采用合理的加工方法技术从而设计一种可降解多元混构体系解决时空匹配问题，提高细胞的亲和性，采用冷冻干燥技术改善内部气孔分布有利于细胞粘附、生长、分化和血管的长入。

有文献报道制备丝素基复合材料时为增加丝素与无机物之间的接触点提高二者的结合强度，丝素经碱预处理后，采用氢氧化钙和磷酸中和的方法制备羟基磷灰石/丝素蛋白粉体。此方法采用强碱氢氧化钠引进了杂质离子钠，而且对丝素蛋白造成了损害影响其生物活性。丝素的预处理耗时长，延长了制备周期，酸碱中和法制备的羟基磷灰石/丝素蛋白粉体中羟基磷灰石尺寸较大，为亚微米级颗粒。本发明利用丝素蛋白溶于中性盐溶液的特性，采用氯化钙和磷酸氢二铵作为羟基磷灰石的先驱体制备纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/壳聚糖复合粉体，解决了以往制备丝素基复合材料时的弊端。

本发明的冷冻干燥技术以纯水冻结后的冰晶为孔隙源，不引入有机溶剂，最大限度的保持物料的生物活性、营养成份和物理状态，具有清洁安全、支架内部气孔连通性良好、气孔率高的特点。将以上性能、降解参数不同的要素材料采用冷冻干燥技术以特定方式排列形成多元混构体系，可赋予支架良好骨再生功能，使其发展成为一种较为理想的骨组织工程材料，给与我们解决理想支架难题的希望。

本发明的纳米羟基磷灰石/丝素—壳聚糖复合粉体，材料间存在强烈的化学键合和分子间作用力，无机物均匀分布于有机基体中，二者结合紧密。冷冻干燥制备的细胞支架气孔率在75％-90％之间。气孔尺寸为150～500μm，气孔连通性良好，抗压强度为0.85～1.85Mpa之间。支架材料的内部组织结构和力学强度能同时满足骨组织工程的要求。

附图说明

图1为本发明纳米羟基磷灰石/丝素蛋白—壳聚糖复合支架制备方法的工艺流程图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式中的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白—壳聚糖复合支架的材质由无机材料和有机材料复合而成，所述无机材料为纳米羟基磷灰石，有机材料为丝素蛋白和壳聚糖，无机材料和有机材料的重量比为50～70∶30～50，丝素蛋白和壳聚糖的重量比为1∶1～2。

本实施方式中，所述纳米羟基磷灰石为弱晶态，其直径为4～6nm，长为20～40nm。所述复合支架的气孔率为75％～90％，气孔尺寸为150～500μm。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，无机材料和有机材料的重量比为50∶50。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一、二不同的是，无机材料和有机材料的重量比为70∶30。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二、三不同的是，丝素蛋白和壳聚糖的重量比为1∶1。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一、二、三、四不同的是，丝素蛋白和壳聚糖的重量比为1∶2。

具体实施方式六：如图1所示，本实施方式按照如下步骤制备纳米羟基磷灰石/丝素蛋白—壳聚糖复合支架：a、首先在80～100℃下将丝素溶于氯化钙/乙醇/水三元溶液中裂解10～60min，b、将壳聚糖溶解于乙酸溶液后加入到丝素/氯化钙溶液中，充分搅拌得混合共溶液，然后加蒸馏水稀释为0.1～0.5mol/l的溶液；其中丝素与壳聚糖的重量比为1∶1～2；c、将磷酸氢二铵溶液逐滴加入到混合共溶液中，预先设计先驱体羟基磷灰石中Ca/P摩尔比为1.67，加入氨水调节反应液的PH值为7～11，机械搅拌下室温反应1～5h，静止陈化10～30h，离心、真空干燥，得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/壳聚糖(HA/SF-CS)复合粉末；d、将上述复合粉末加入蒸馏水中，然后加入乙酸，使有机物的重量体积浓度介于2.5～10％之间，超声分散20～50min，4℃放置2～8小时使其凝胶化，预冷、冷冻干燥，制得复合支架。

具体实施方式七：本实施方式以氯化钙、磷酸氢二铵作为羟基磷灰石的先驱体，制备纳米羟基磷灰石/丝素蛋白—壳聚糖复合材料，Ca/P比设为1.67，等于羟基磷灰石的化学计量比。无机、有机材料的重量比7∶3和5∶5。适量丝素溶于氯化钙/乙醇/水(摩尔比率1∶2∶8)三元溶液中80℃裂解30min，稀释为0.2M的溶液。壳聚糖溶于1％(W/V)乙酸溶液中(壳聚糖∶丝素为1∶1)后，与丝素/氯化钙共溶液混合，搅拌均匀，0.2M磷酸氢二铵溶液滴入以上溶液，氨水调节反应液的PH值为7.4。室温下机械搅拌反应2小时，静置陈化20h，离心沉淀，用蒸馏水和乙醇清洗，循环三次，真空干燥，得到纳米级弱结晶度的HA/SF-CS复合粉末。羟基磷灰石的尺寸直径为4～6nm，长为20～40nm。

HA/SF-CS复合粉末加入蒸馏水，然后加入适量乙酸，使有机物的浓度介于2.5～10％(W/V)之间，超声分散30min，4℃放置2小时使其凝胶化，分别于-20℃预冷10～48h、-80℃预冷10～48h、液氮(-196℃)中淬冷，然后冷冻干燥30h，制得气孔率在75～90％，气孔尺寸150～500μm，良好抗压强度为0.85～1.85Mpa，内部气孔连通性的细胞支架。

Claims

1、纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架，其特征在于所述复合支架的材质由无机材料和有机材料复合而成，无机材料为纳米羟基磷灰石，有机材料为丝素蛋白和壳聚糖，无机材料和有机材料的重量比为50～70∶30～50，丝素蛋白和壳聚糖的重量比为1∶1～2。

2、根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架，其特征在于所述纳米羟基磷灰石的直径为4～6nm，长为20～40nm。

3、根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架，其特征在于所述复合支架的气孔率为75％～90％，气孔尺寸为150～500μm。

4、权利要求1所述纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架的制备方法，其特征在于所述方法为：a、首先在80～100℃下将丝素溶于氯化钙/乙醇/水三元溶液中裂解10～60min；b、将壳聚糖溶解于乙酸溶液后加入到丝素/氯化钙溶液中，然后加蒸馏水稀释为0.1～0.5mol/l的溶液，充分搅拌得混合共溶液，其中丝素与壳聚糖的重量比为1∶1～2；c、将磷酸氢二铵溶液逐滴加入到混合共溶液中，预先设计先驱体羟基磷灰石中Ca/P摩尔比为1.67，加入氨水调节反应液的PH值为7～11，机械搅拌下室温反应1～5h，静止陈化10～30h，离心、真空干燥，得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/壳聚糖复合复合粉末；d、将上述复合粉末加入蒸馏水中，然后加入乙酸，使有机物的重量体积浓度介于2.5～10％之间，超声分散20～50min，4℃放置2～8小时使其凝胶化，预冷、冷冻干燥，制得复合支架。

5、根据权利要求4所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架的制备方法，其特征在于所述氯化钙/乙醇/水的摩尔比率为1∶2∶8。

6、根据权利要求4所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架的制备方法，其特征在于所述乙酸溶液的重量体积浓度为1％。

7、根据权利要求4所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架的制备方法，其特征在于所述磷酸氢二铵溶液的浓度为0.2mol/l。

8、根据权利要求4所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架的制备方法，其特征在于所述纳米羟基磷灰石的直径为4～6nm，长为20～40nm。

9、根据权利要求4所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架的制备方法，其特征在于所述复合支架的气孔率为75～90％，气孔尺寸为150～500μm。