CN101833611B

CN101833611B - 一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型及其构建方法

Info

Publication number: CN101833611B
Application number: CN 201010157907
Authority: CN
Inventors: 崔杰峰; 刘银坤; 唐建华; 陈荣新; 戴继灿; 郭坤; 陈军; 陈洁
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-04-27
Also published as: CN101833611A

Abstract

本发明提供了一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型及其构建方法。所述体外肝癌肝侵袭转移实验模型，其特征在于，由高转移人肝癌细胞MHCC97H和裸鼠肝组织块经三维旋转混合培养得到。所述构建方法，其特征在于，具体步骤为：第一步：将DMEM/F12培养液、胎牛血清和青链霉素溶液以体积比为100∶10∶1的比例混合得到混合培养液；第二步：将1×10⁷高转移人肝癌细胞MHCC97H混悬在混合培养液中，随后置入RWV生物反应器中，接着置入混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块，三维旋转混合培养。本发明可较好地模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成的全过程，且较动物模型更易获取各病理阶段组织标本以用于侵袭转移“过程”关键蛋白分子的筛查。

Description

一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型及其构建方法

技术领域

本发明提供了一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型及其构建方法，属于肿瘤侵袭转移体外实验模型及其构建方法技术领域。

背景技术

在全球恶性肿瘤死亡率排序中，肝癌是位居第三位的疾病，在我国则位居第二位，过去二十年，肝癌临床、基础研究均取得长足进步，但肝癌的总体预后并无显著改善，其总体术后5年复发率依然高达61.5％，即使是小肝癌术后5年复发率也高达43.5％，转移和复发成为进一步提高肝癌治疗效果与预后的最大障碍，而肝癌转移复发的发生与癌细胞的生物学行为(黏附、运动、增殖、侵袭)、细胞外基质、机体免疫、肿瘤血管生成及靶器官性质等许多因素有关，传统的转移性人肝癌细胞系、动物模型以及单因素、单基因相关性分析模式已经无法满足肝癌侵袭转移分子病理机制的实验解析，且目前报道的大量转移相关基因、蛋白多来源于转移瘤和原发瘤的比较、癌与癌旁组织的比较、以及转移潜能不同细胞系之间的比较等，这些“果”之间的比较，忽略了转移的起步阶段及靶器官特异选择后期阶段的“过程”关键调控蛋白的筛查，因此探索和建立新型体外侵袭转移模型或转移研究体系成为肝癌转移新理论、新机制发现的保证。

理想的体外转移模型既能较好地模拟肿瘤的生存转移环境，也应有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为的实验解析。在肝癌体外转移模型建立方面，复旦大学肝癌研究所进行了大量创造性的工作，先后建立了人肝癌裸小鼠移植模型(LTNM1-LTNM4)、人肝癌裸大鼠移植模型(LTNR1、LTNR2)，高转移人肝癌裸小鼠模型(LCI-D20)、转移潜能不同人肝癌细胞系(MHCC97L，MHCC97H，LM3，LM6)，上述转移模型被国内外学者大量研究应用，对肝癌转移复发分子机制的阐明起到积极的推动。但从肿瘤细胞生物特性来看，体外多次传代的二维贴壁培养易改变或丢失肿瘤细胞的某些表型特征、生物特性，我们的前期工作也显示三维状态下的肝癌细胞在形态结构、基因表达、蛋白分泌、成瘤转移等方面明显不同于两维的人肝癌细胞系，高转移人肝癌细胞MHCC97H置于RWV生物反应器与生物支架PLGA相结合的三维旋转培养体系中培养可形成转移性肝癌类组织体，其在组织形态结构、特征基因表达、蛋白分泌情况、动物成瘤及转移能力等方面具有更接近体内转移性肝癌实体瘤生长病理特征(专利申请号CN200910048099.1，专利公开号CN101508973)，优于目前常用的转移性人肝癌细胞模型，新型三维肝癌类组织模型建立无疑对肝癌转移研究观念更新带来可能。三维微重力体外旋转培养获得类组织模型与实体瘤生长特性更为接近，可再现肿瘤细胞自然状态和生存环境，而在三维状态下，将高转移MHCC97H细胞与靶器官肝组织块旋转混合培养，能理想地模拟出癌细胞从黏附、浸润、到镜下癌巢形成的全过程，且较动物模型更易获取各病理阶段组织标本以用于转移前期及后期关键蛋白分子的筛查，也更易在体外通过抑制剂或促进剂控制黏附、侵袭、转移的条件而不受动物个体差异带来的干扰，同时在临床抗转移药物的筛选与评估中也有更直接的意义。

临床大量实践表明，肝内播散与肺转移是肝癌转移最常见的两种形式，为构建宜于直接检测、观察肝癌肝侵袭转移过程的体外研究模型，本发明应用组织工程领域RWV生物反应器系统，利用其低剪切、微重力体外三维培养环境，将高转移潜能人肝癌细胞系与裸鼠肝组织块共同旋转培养，模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成全过程，构建肝癌肝侵袭转移体外研究模型，用于肝癌肝侵袭转移过程病理改变分析及“过程”关键蛋白筛查，此类体外实验模型目前国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是构建一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型，该模型可较好模拟癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成的病理全过程，解决三维状态下缺少理想肝癌侵袭转移实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题，有助于深入解析三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制。

为了达到上述目的，本发明的技术方案提供一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型，其特征在于，由高转移人肝癌细胞MHCC97H和裸鼠肝组织块经三维旋转混合培养得到。

本发明还提供了上述体外肝癌肝侵袭转移实验模型的构建方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将DMEM/F12培养液、胎牛血清和青链霉素溶液以体积比为100∶10∶1的比例混合得到混合培养液；

第二步：将1×10⁷高转移人肝癌细胞MHCC97H混悬在10ml第一步获得的混合培养液中，随后置入10ml的RWV生物反应器中，接着置入混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块，先静止10min再以速度7rpm/min～8rpm/min旋转培养10～15min，重复三次，然后静止30分钟，后以速度7rpm/min～8rpm/min旋转培养过夜，次日根据细胞团块的大小调节旋转培养速度，以悬浮在一个水平位置且不触及RWV反应器壁为宜，每36小时更换一次培养液，培养第7天后，旋转培养速度达到18rpm/min，每24小时更换一次培养液，到第15天，三维旋转混合培养结束。

所述的青链霉素溶液是将青霉素和链霉素溶于0.85g/100ml氯化钠溶液中得到，所述的青霉素的浓度是10000单位/ml，所述的链霉素的浓度是10000单位/ml。

所述裸鼠肝组织块的长、宽和高分别为2～3mm、2～3mm和2～3mm。

所述的混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块由以下方法得到：采用颈椎脱臼方法处死裸鼠后，手术获取裸鼠肝脏，用生理盐水冲洗直至无血液，将裸鼠肝脏组织切割为所需尺寸大小，浸泡在第一步获得混合培养液中进行预平衡。

本发明的原理如下：体外多次传代的二维贴壁培养易改变或丢失肿瘤细胞的某些表型特征、生物特性，也经常出现基因水平表达模式、药物筛查情况与临床标本不一致的情况。三维状态下的肝癌细胞在形态结构、基因表达、蛋白分泌、侵袭、成瘤转移等方面明显不同于两维的人肝癌细胞系，细胞的生物学特征与体内癌细胞真实的生理病理状况也更为接近。受技术和方法的限制，在体外肝癌侵袭转移实验模型建立方面，依然缺乏理想模型，RWV生物反应器旋转培养体系的发明在三维培养方法学进展中具有突破性的意义，该装置由一水平旋转并能通过底部硅树脂膜进行气体交换的壁式组织培养器皿和旋转控制器组成，通过对旋转速度的调节形成低剪切、微重力体外环境，增强培养细胞的组织样黏附与聚集，并对细胞的生长增殖，分化，细胞因子分泌及细胞间的相互作用产生影响，优于静止及其它高剪切的旋转三维培养技术，是三维细胞培养领域、组织再生领域有潜在临床应用前景的技术之一。本发明创造性地应用RWV生物反应器三维旋转培养体系，将高转移人肝癌细胞系MHCC97H与靶器官肝组织块旋转混合培养，通过对旋转速度的调节和不同时间的病理分析，模拟癌细胞从黏附、浸润、到镜下癌巢形成的全过程，且在整个病理改变过程中，肝癌肝侵袭转移关联基因表达水平变化呈现不同特点，提示该模型可用于体外肝癌肝侵袭转移实验研究。

本发明的优点如下：该新型肝癌肝侵袭转移体外模型较好地模拟出肝癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成的全过程，且较动物模型更易获取各病理阶段组织标本以用于侵袭转移“过程”关键蛋白分子的筛查，也更易在体外通过抑制剂或促进剂控制黏附、侵袭、转移的条件而不受动物个体差异带来的干扰，同时在临床抗转移药物的筛选与评估中也有更直接的意义。同时有助于肝癌细胞的恶性生物学行为的实验解析，解决体外研究肝癌组织细胞病理特征缺少理想实验模型问题及肝癌临床药物治疗缺少理想体外实验评估体系问题，该发明应用也相对简单易行。

附图说明

图1为高转移性人肝癌细胞和肝组织块三维混合培养形成混合类组织体大体观图；

图2为肝癌肝侵袭转移模型形成中不同时间点混合类组织体的组织病理分析结果图；

图3为肝癌侵袭转移关联基因在肝癌肝侵袭转移模型形成过程中不同时间的表达情况分析图a；

图4为肝癌侵袭转移关联基因在肝癌肝侵袭转移模型形成过程中不同时间的表达情况分析图b；

图5为肝癌侵袭转移关联基因在肝癌肝侵袭转移模型形成过程中不同时间的表达情况分析图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型由高转移人肝癌细胞MHCC97H和裸鼠肝组织块经三维旋转混合培养得到。该模型较好地模拟癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成的病理全过程，解决三维状态下缺少理想肝癌侵袭转移实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程”关键蛋白筛查缺少理想标本实验体系问题，有助于深入解析三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分子机制。

上述体外肝癌肝侵袭转移实验模型的构建方法，具体步骤为：

第一步：将DMEM/F12培养液1X(GIBICO公司生产)、胎牛血清(FBS，Biointernational公司)和青链霉素溶液(将10000单位/ml青霉素和10000单位/ml链霉素溶于0.85g/100ml氯化钠溶液中得到)以体积比为100∶10∶1的比例混合得到混合培养液；

第二步：将1×10⁷高转移人肝癌细胞MHCC97H混悬在10ml第一步获得的混合培养液中，随后置入10ml的RWV生物反应器(Synthecon公司，美国)中，接着置入混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块(长、宽和高分别为3mm、3mm和3mm，由以下方法得到：采用颈椎脱臼方法处死裸鼠后，手术获取裸鼠肝脏，用生理盐水冲洗直至无血液，将裸鼠肝脏组织切割为所需尺寸大小，浸泡在第一步获得混合培养液中进行预平衡)，先静止10min再以速度7rpm/min旋转培养10min，重复三次，然后静止30分钟，后以速度7rpm/min旋转培养过夜，次日根据细胞团块的大小调节旋转培养速度，以悬浮在一个水平位置且不触及RWV反应器壁为宜，每36小时更换一次培养液，培养第7天后，旋转培养速度达到18rpm/min，每24小时更换一次培养液，到第15天，三维旋转混合培养结束。如图1所示，为高转移性人肝癌细胞和肝组织块三维混合培养形成混合类组织体大体观图。

实施例2

第二步：将1×10⁷高转移人肝癌细胞MHCC97H混悬在10ml第一步获得的混合培养液中，随后置入10ml的RWV生物反应器(Synthecon公司，美国)中，接着置入混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块(长、宽和高分别为2mm、2mm和2mm，由以下方法得到：采用颈椎脱臼方法处死裸鼠后，手术获取裸鼠肝脏，用生理盐水冲洗直至无血液，将裸鼠肝脏组织切割为所需尺寸大小，浸泡在第一步获得混合培养液中进行预平衡)，先静止10min再以速度8rpm/min旋转培养15min，重复三次，然后静止30分钟，后以速度8rpm/min旋转培养过夜，次日根据细胞团块的大小调节旋转培养速度，以悬浮在一个水平位置且不触及RWV反应器壁为宜，每36小时更换一次培养液，培养第7天后，旋转培养速度达到18rpm/min，每24小时更换一次培养液，到第15天，三维旋转混合培养结束。

实施例3

第二步：将1×10⁷高转移人肝癌细胞MHCC97H混悬在10ml第一步获得的混合培养液中，随后置入10ml的RWV生物反应器(Synthecon公司，美国)中，接着置入混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块(长、宽和高分别为2.5mm、2.5mm和2.5mm，由以下方法得到：采用颈椎脱臼方法处死裸鼠后，手术获取裸鼠肝脏，用生理盐水冲洗直至无血液，将裸鼠肝脏组织切割为所需尺寸大小，浸泡在第一步获得混合培养液中进行预平衡)，先静止10min再以速度7.5rpm/min旋转培养10min，重复三次，然后静止30分钟，后以速度7.5rpm/min旋转培养过夜，次日根据细胞团块的大小调节旋转培养速度，以悬浮在一个水平位置且不触及RWV反应器壁为宜，每36小时更换一次培养液，培养第7天后，旋转培养速度达到18rpm/min，每24小时更换一次培养液，到第15天，三维旋转混合培养结束。

由于细胞三维培养的周期一般较长15天到30天，且形成的球形混合类组织体结构使得内部细胞对营养要求较高，选择与基础DMEM培养液成分接近且营养条件优于其的DMEM/F12培养液1X(GIBICO公司生产)，对MHCC97H细胞进行三维培养有利于培养周期的延长。定期及时更换新鲜培养液是球形混合类组织体形成及肿瘤细胞生长的关键环节，平均培养36小时更换新鲜的DMEM/F12培养液，培养第7天后，每24小时更换一次培养液可获得较理想的培养结果。最大限度地形成体积较大的混合类组织体有利于下游基因、蛋白表达的体外分析及动物移植等方面的研究。

本发明技术方案中肝癌肝侵袭转移模型形成的重要时间节点为5天，10天和15天，重要时间点的界定主要来自组织病理分析，及肝癌侵袭转移关联基因表达状况。如图2所示，为肝癌肝侵袭转移模型形成中不同时间点混合类组织体的组织病理分析结果图，高转移人肝癌细胞MHCC97H与肝组织块在低剪切、微重力的RWV三维旋转环境中混合培养，在培养初期，通过保持低旋转速度7～10rpm/min，实现MHCC97H细胞聚集粘附于肝组织块周围，到第5天，组织病理分析显示，癌细胞已经粘附聚集于肝组织块周围并有轻微肝组织浸润侵袭，随后提高旋转速度至14rpm/min继续培养，到第7天和第10天，组织病理观察发现癌细胞肝组织的侵入变得越来越明显，再进一步提高旋转速度至18rpm/min继续培养，到第15天，组织病理观察发现癌细胞已进入肝组织并形成许多小的癌巢。如图3、图4所示，为肝癌侵袭转移关联基因在肝癌肝侵袭转移模型形成过程中不同时间的表达情况分析图a和b，肝癌侵袭转移关联基因的表达模式是评价形成的混合类组织体能否成为体外肝癌肝侵袭转移模型的关键，分别收集的0天，5天，10天和15天的混合培养物，对其侵袭转移关联基因表达状况进行分析，结果发现与DAY 0天表达水平比较，基质金属蛋白酶9(MMP9)在后3个时间点的表达明显升高，且侵袭初期(DAY5)升高最明显，随后回落；基质金属蛋白酶7(MMP7)在侵袭初期(DAY5)也升高明显，随后逐级回落；而基质金属蛋白酶2(MMP2)在侵入肝组织的中期表达升高最明显，到DAY15表达回落；趋化因子12(CXCL12)在整个侵袭转移过程中的表达则明显递增，而相应趋化因子受体(CXCR4)也呈现逐级增高的趋势，只是升高的幅度没有CXCL12明显；CD44的表达模式与MMP7接近，在侵袭初期(DAY5)也升高明显，随后逐级回落；骨桥蛋白SPP1在侵入肝组织的初、中期表达均升高明显，到DAY15表达回落；如图5所示，为肝癌侵袭转移关联基因在肝癌肝侵袭转移模型形成过程中不同时间的表达情况分析图，钙粘蛋白(CDH1)在肝侵袭初期(DAY5)下降更加明显，而到侵入肝组织中期及癌巢形成则表达呈明显递增性升高。上述侵袭转移关联基因的表达模式充分提示，肝癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成的过程中，部分侵袭转移关联基因在侵袭转移初期起到主要作用，部分的侵袭转移关联基因在侵袭转移初、中期发挥作用，而部分侵袭转移关联基因则在整个侵袭转移过程中均呈现高表达递增趋势，体现出侵袭转移过程变化的不同特点，可作为一种新型的体外肝癌肝侵袭转移实验模型。

本发明形成的体外肝癌肝侵袭转移实验模型，再现肝癌细胞从黏附、侵袭到肝内癌巢形成的病理全过程，且在整个病理改变过程中，肝癌肝侵袭转移关联基因表达水平变化呈现不同特点，提示该模型可成为三维状态下肝癌肝侵袭转移研究较理想体外实验模型。

本发明的使用方法如下：

1、该发明的应用简单易行，肝癌肝侵袭转移模型形成过程中，分别获取不同时间点的混合类组织标本，进行肝侵袭转移“过程”关联蛋白、“过程”关联基因的筛查及动态分子病理、动态蛋白质组、动态基因组分析等。

2、在肝癌肝侵袭转移模型形成过程中，将与粘附、侵袭转移关联的待评价药物依据不同剂量，直接溶入或加入培养液中混匀，通过对不同时程混合类组织体生长及病理特征评估变化来对药物的疗效进行体外组织水平实验评估。

3、作为一种新型肝癌肝侵袭转移实验模型，可用于三维状态下肝癌细胞侵袭、转移恶性生物学行为的分子机制解析，及肝癌组织水平的体外基础实验研究。

Claims

1.一种体外肝癌肝侵袭转移实验模型，其特征在于，由高转移人肝癌细胞MHCC97H和裸鼠肝组织块经三维旋转混合培养得到，其构建方法为：

第二步：将1x10⁷高转移人肝癌细胞MHCC97H混悬在10ml第一步获得的混合培养液中，随后置入10ml的RWV生物反应器中，接着置入混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块，先静止10min再以速度7rpm～8rpm旋转培养10～15min，重复三次，然后静止30分钟，后以速度7rpm～8rpm旋转培养过夜，次日根据细胞团块的大小调节旋转培养速度，以悬浮在一个水平位置且不触及RWV反应器壁为宜，每36小时更换一次培养液，培养第7天后，旋转培养速度达到18rpm，每24小时更换一次培养液，到第15天，三维旋转混合培养结束。

2.如权利要求1所述的体外肝癌肝侵袭转移实验模型，其特征在于，所述的青链霉素溶液是将青霉素和链霉素溶于0.85g/100ml氯化钠溶液中得到，所述的青霉素的浓度是10000单位/ml，所述的链霉素的浓度是10000单位/ml。

3.如权利要求1所述的体外肝癌肝侵袭转移实验模型，其特征在于，所述裸鼠肝组织块的长、宽和高分别为2～3mm、2～3mm和2～3mm。

4.如权利要求1所述的体外肝癌肝侵袭转移实验模型，其特征在于，所述的混合培养液预平衡的裸鼠肝组织块由以下方法得到：采用颈椎脱臼方法处死裸鼠后，手术获取裸鼠肝脏，用生理盐水冲洗直至无血液，将裸鼠肝脏组织切割为所需尺寸大小，浸泡在第一步获得混合培养液中进行预平衡。