CN105143883B - 基于细胞的药物筛选分析方法和其用途 - Google Patents

基于细胞的药物筛选分析方法和其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于细胞的药物筛选分析，其包括以下步骤：(i)在培养环境中培养细胞群体，(ii)依据所述细胞类型、所述细胞的生理特性、所形成组织的生理特性、原料药的作用方式和培养环境中的至少一种来界定至少两个监测时间点，(iii)至少在一个治疗时间点将原料药施加至培养细胞，(iv)至少在所述两个监测时间点监测所述原料药对细胞或所形成组织的影响。

Description

基于细胞的药物筛选分析方法和其用途
技术领域
本发明涉及基于根据独立权利要求1的前序部分培养在培养环境中的细胞的药物筛选方法。
背景技术
基于细胞的筛选方法代表着一种在临床前药物开发早期时，在决策过程中评估新化合物(例如，新抗癌药物)的作用方式(诸如疗效和毒性)的重要信息来源(Michelini,Cevenini等人，(2010)"基于细胞的分析：加油药物发现(Cell-based assays:fuellingdrug discovery)."Anal Bioanal Chem 398(1):227-238.；An和Tolliday(2010),"用于高通量筛选的基于细胞的分析(Cell-based assays for high-throughput screening)."Mol Biotechnol 45(2):180-186；Sharma,Haber等人，(2010)“基于细胞系的平台以评估候选抗癌药物的治疗功效(Cell line-based platforms to evaluate the therapeuticefficacy of candidate anticancer agents).”Nature Reviews Cancer 10:241-253.)。
鉴于它们在药物研发中的关键作用，过去十年中已针对研发更为生理相关的基于细胞的分析研究了大量新颖方法(Yamada和Cukierman(2007),"以3D建模组织形态发生和癌症(Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D)."Cell 130(4):601-610；Pampaloni,Reynaud等人(2007)；"第三维填补了细胞培养与活组织间的间隙(The thirddimension bridges the gap between cell culture and live tissue)."Nat Rev MolCell Biol 8(10):839-845)。例如，在癌细胞生物学和抗肿瘤药物研发中，越来越多的科学证据表明，与平坦塑胶表面上的常规培养相比，容许癌细胞以三维结构组织和生长的方法(三维培养模型)反映更为接近活体内中观察到的行为；特定而言，就细胞生长、细胞信号传递和基因表达方面而言(Abbott(2003)."细胞培养：生物学的新维度(Cell culture:Biology's new dimension)."Nature 424(6951):870-872；Kunz-Schughart,Freyer等人(2004),"使用用于高通量筛选的3-D培养物：多细胞球状体模型(The use of 3-Dcultures for high-throughput screening:the multicellular spheroid model)."JBiomol Screen 9(4):273-285；Bissell(2007),"建模乳腺癌和侵袭的分子机制：借鉴正常腺体(Modelling molecular mechanisms of breast cancer and invasion:lessonsfrom the normal gland)."Biochem Soc Trans 35(Pt 1):18-22.；Friedrich,Seidel等人(2009)."基于球状体的药物筛选：考虑和实用方法(Spheroid-based drug screen:considerations and practical approach)."Nat Protoc 4(3):309-324；Debnath andBrugge(2005),"在三维培养物中建模腺上皮癌(Modelling glandular epithelialcancers in three-dimensional cultures)."Nat Rev Cancer 5(9):675-688)。
已经采用几种技术生产这些更为贴近生理的三维结构培养模型来测试抗癌药物(Nyga 2011,Cheema等人(2011),“3D肿瘤模型：对癌症研究的新颖活体外方法(3D tumourmodels:novel in vitro approaches to cancer studies)”J.Cell Commun.Signal.5,239-248)。最常见的三维技术利用(i)天然凝胶基质(Weaver,Petersen等人(1997),"通过整合素阻断抗体逆转人乳腺癌细胞在三维培养和活体内的恶性表型(Reversion of themalignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and invivo by integrin blocking antibodies)."J Cell Biol 137(1):231-245.；Fiebig,Maier等人(2004),"用人肿瘤异种移植物建立的克隆形成分析：活体外对活体内活性的相关性作为抗癌药物发现的基础(Clonogenic assay with established human tumourxenografts:correlation of in vitro to in vivo activity as a basis foranticancer drug discovery)."Eur J Cancer 40(6):802-820；Krausz,de Hoogt等人(2013),"翻译模拟3D肿瘤生长的肿瘤微环境共同培养分析平台用以高含量筛选(Translation of a tumor microenvironment mimicking 3D tumor growth co-cultureassay platform to high-content screening)."J Biomol Screen 18(1):54-66)或合成凝胶基质(Loessner,Stok等人(2010)."生物工程3D平台以探讨上皮卵巢癌细胞的细胞-细胞外基质相互作用和耐药性(Bioengineered 3D platform to explore cell-ECMinteractions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells)."Biomaterials 31(32):8494-8506；Sieh,Taubenberger等人(2012),"培养在生物工程微环境中的前列腺癌LNCaP细胞的表型特征分析(Phenotypic characterization of prostatecancer LNCaP cells cultured within a bioengineered microenvironment)."PLoSOne 7(9):e40217.；Yang和Zhao(2011)."卵巢癌细胞系在肽纳米纤维支架上的3D模型，以探讨细胞-支架相互作用和抗癌药物的化疗耐药性(A3D model of ovarian cancer celllines on peptide nanofiber scaffold to explore the cell-scaffold interactionand chemotherapeutic resistance of anticancer drugs)."Int J Nanomedicine 6:303-310)来源用于细胞封装，(ii)刚性聚合三维支架(Fischbach,Chen等人(2007),"具有3D支架的工程改造肿瘤(Engineering tumors with 3D scaffolds)."Nat Methods 4(10):855-860；Knight,Murray等人(2011)."Alvetex(R)：用于常规三维细胞培养的聚苯乙烯支架技术(Alvetex(R):polystyrene scaffold technology for routine threedimensional cell culture)."Methods Mol Biol 695:323-340)用于细胞接种，或(iii)无基质细胞聚集方法(WO 2010/031194A1；(Friedrich,Seidel等人(2009),"基于球状体的药物筛选：考虑和实用方法(Spheroid-based drug screen:considerations andpractical approach)."Nat Protoc 4(3):309-324；Karlsson,Fryknas等人(2012)."癌症药物活性在结肠癌HCT-116细胞中在新3D球状体细胞培养系统中球状体形成期间的损失(Loss of cancer drug activity in colon cancer HCT-116cells during spheroidformation in a new 3-D spheroid cell culture system)."Exp Cell Res 318(13):1577-1585；Tung,Hsiao等人(2011)."高通量3D球状体培养以及用384悬滴阵列的药物测试(High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384hanging droparray)."Analyst 136(3):473-478；Lama,Zhang等人(2013)."用于抗癌药物测试的活体外多细胞三维癌球状体分析的开发、确认和前导筛选(Development,validation and pilotscreening of an in vitro multi-cellular three-dimensional cancer spheroidassay for anti-cancer drug testing)."Bioorg Med Chem 21(4):922-931)来生长三维癌细胞结构(例如，球状体、组织)。
未能考虑到疾病进展变化可增加选择候选假阳性药物(在人体中不起作用的药物)和抛弃候选假阴性药物(将在人体中起作用的药物)的可能性。
发明内容
因此，本发明的一个目标是避免已知药物筛选方法的劣势，并特地提供针对展示不同的关键生理学活体内疾病状态的谱化(profiled)细胞测试的药物活性数据。这个目标可用根据权利要求1所述的药物筛选方法解决。
根据本发明，基于细胞的药物筛选分析将细胞和它们随时间变化的生理变化和行为考虑在内来理解药物的作用方式。所述分析包括依据细胞类型、培养环境、细胞的生理特性、细胞群体的生理特性、所形成组织的生理特性或原料药种类(例如原料药的目标作用机制)确定至少两个监测时间点。至少在一个治疗时间点将原料药施加至培养细胞。至少在所述两个监测时间点监测药物类型对细胞生长动力学、行为和/或生理特性的影响。所述时间点可以是具体时刻，也可以是某一时间段。
培养环境包括生理相关微环境，其将具体物理学、生物学和生物化学特征考虑在内，这些特征包括具体细胞和/或所形成组织的细胞-细胞相互作用和细胞-基质相互作用。
至少在两个时间点(例如在“早期”和在“晚期”)监测细胞增殖可以容许比较两个时期期间细胞生长和/或发育的生理特征和/或药物治疗的影响。可能需要针对给定细胞类型或药物调节细胞生长环境和生理特征。因此，优选地选择监测时间点，以鉴于药物作用方式提供与(例如)癌症早期或晚期有关的信息；优选地在生理相关环境中培养后第4至第7天，特定癌症可视为“早期”，且优选地在生理相关环境中培养后的第14至第17天视为“晚期”。也可以通过不存在或存在特定生理特征特性(例如缺氧或细胞生长动力学或细胞组成变化)界定“晚期”。
可以在终止药物施加后继续监测细胞1到7天或更多天。必须针对特定细胞类型和药物确定无药物时间段的开始和结束。因为容许细胞从药物治疗中恢复，所以这个时期命名为“恢复期”。包括第一次和/或第二次施加药物后与恢复有关的时间点可能对于识别有效药物或对细胞没有即时效果的药物很有必要。
优选的实施方案可指(例如)一种包括如下的方法，在“早期”进行治疗并至少在两个相关时间点进行监测，有或无“恢复期”，或者在“晚期”进行治疗并至少在两个相关时间点进行监测，有或无“恢复期”，或者在“早期”和“晚期”进行治疗并在至少两个相关时间点进行监测，有或无“恢复期”。
细胞培养所用环境可包括模拟细胞微环境的底物基质或介质，优选地是由会促进聚合的结构化合物和连接子化合物组成的三维基质。结构化合物可以是含不饱和末端基团(优选乙烯基)的多分枝聚乙二醇。连接子化合物包括具有至少两个半胱氨酸或硫醇基的肽使得借助所述连接子化合物桥接的结构化合物可聚合。三维基质优选地包括如欧洲公开第2 561 005号中所述的基质组合物。
当接种于细胞培养所用的环境中时，所述环境可促进(i)单细胞的三维生长，以形成多细胞实体，或(ii)多细胞的三维生长，以形成多细胞实体。优选地，细胞生长形成细胞集落或细胞群体。例如，癌细胞的集落排列形成模拟肿瘤三维排列的球状体，其中外部细胞容易接近，且同时保护其核心的细胞。
为产生具有预定刚度的三维环境和具有适宜生理和生物特性的组合物，可使用接受者或标准细胞培养装置，优选384孔板。可将所述环境和细胞分配于具有细胞培养基的装置中，然后可将它放置在细胞培养箱中。可使用与接受者或装置相容的成像和传感设备(优选地是为自动化且最大限度增加输出监测数据的再现性的设备)测量细胞增殖和活性的监测。
用于在所述环境中培养的细胞可以是任何生物体的任何类型细胞、活体外培养的细胞或细胞系、衍生自生物体的分化细胞或干细胞以及生物体的癌细胞，优选结肠癌细胞、胰腺癌细胞和卵巢癌细胞，而且可以是生长受到促进的健康细胞。
施加至培养细胞的原料药可以是选自任何化学、天然或合成物质、已知药物筛选的任何物质和在作为抗癌药物前识别的物质的组的任何物质。原料药可以液体形式(其中所述液体可以是含原料药的有机溶剂或水性缓冲液)、作为粉末、作为丸剂或封装在载体(优选纳米颗粒)中施加。
监测细胞生长动力学和活性的分析读出模式(Assay readout modality)可优选地通过以下任一方式进行：(i)以下选定组：代谢活性(优选Alamar )、流式细胞术、脱氧核糖核酸(DNA)含量、蛋白质定量、细胞计数、基于图像的分析、基因表达水平、质谱分析、基于标记的测量(诸如报告子基因技术、共振能量转移、蛋白质片段或分离互补分析)或基于无标记的测量(诸如电生物传感器/阻抗系统、光学生物传感器系统、表面等离子共振系统、声学生物传感器系统和采用量热法、电活性变化的系统)或者(ii)上述监测分析法的任何组合。监测细胞增殖可提供关于药物诱导的对细胞形状和组成的效果的直接信息。
测定其它生理和生物特性(例如缺氧和/或血管生成标记物)的分析读出模式可优选地通过以下任一方式进行：(i)以下选定组：核糖核酸(RNA)水平、蛋白质表达水平、质谱分析、免疫组织化学、基于图像的分析、蛋白质组学方法或者(ii)上述监测分析法的任何组合。
可针对给定细胞和细胞类型确定所施加原料药的最大耐受剂量或浓度。当靶向病变细胞(优选癌细胞)时，确定细胞、细胞类型或组织的可接受药物剂量容许调整施加的药物剂量。
可针对给定细胞和细胞类型确定所施加原料药的最低有效剂量。当靶向病变细胞(优选癌细胞)时，确定细胞、细胞类型或组织的最低有效剂量容许调整施加药物剂量。
本发明的另一个目标是提供所述方法的用途，其用来监测以下：(i)通过药物治疗治愈或杀死病变细胞、支持健康细胞和诱导健康细胞进入疾病状态或者(ii)细胞的重编程和/或分化。
就所施加原料药而言的分化细胞的重编程得到干细胞或祖细胞可通过以下任一方式进行分析：(i)以下选定组：代谢活性(优选Alamar )、流式细胞术、脱氧核糖核酸(DNA)含量、蛋白质定量、细胞计数、基于图像的分析、基因表达水平、质谱分析、基于标记的测量(诸如报告子基因技术、共振能量转移、蛋白质片段或分离互补分析)或基于无标记的测量(诸如电生物传感器/阻抗系统、光学生物传感器系统、表面等离子共振系统、声学生物传感器系统和采用量热法、电活性变化的系统)或者(ii)上述监测分析法的任何组合。分化细胞可以是任何细胞、细胞类型或细胞培养衍生的细胞或衍生自特定组织的细胞。这里，所施加的原料药可触发重编程过程。
根据细胞细胞生长动力学和活性，所述方法可用于分析就所施加原料药而言的干细胞分化成分化细胞，其包括以下任一方式：(i)以下选定组：代谢活性(利用Alamar)、流式细胞术、缺氧和血管生成标记物、核糖核酸(RNA)水平、蛋白质表达水平、质谱分析、DNA含量、蛋白质定量、细胞计数、基于图像的分析和免疫组织化学或者(ii)上述监测分析法的任何组合。这里，所施加的原料药可触发分化过程。
附图简述
从下文给定的图示和实例，本发明的其它方面和细节将显而易见，其显示：
图1A-C：展示三维基质中的结肠癌细胞(HCT 116)的细胞集落谱(profiling)和缺氧状态的图表和图像；
图2：展示确定三维生理微环境和传统二维单层培养的药物治疗时间表的示意图；
图3A-B：利用图2中确定的药物治疗时间表比较以二维相对于三维方式筛选药物的图表；
图4A-B：展示确定“早期”和“晚期”治疗后的剂量依赖性药物疗效谱的图表和图像；
图5：比较治疗结束后立即和无药物期后测量的药物活性疗效的图表；
图6：概述5-氟尿嘧啶抗生长在三维环境和传统2D细胞培养模型中的HCT 116细胞集落的药物疗效的表格；
图7：展示结肠癌细胞(HCT 116)的二维生长的图表；
图8A-C：展示比较结肠癌细胞、胰腺癌细胞和卵巢癌细胞的缺氧标记物在三维环境中的各自生长和基因表达谱的图表和图像；
图9：展示具有独立治疗时间表的二维和三维细胞培养物的生长谱的图表；
图10：展示用吉西他滨(Gemcitabine)治疗的胰腺癌细胞的图表：比较在治疗结束后立即和4天与7天无药物恢复期后测量药物活性。
具体实施方式
图1A-C展示结肠癌细胞(HCT 116)在无药物治疗的三维生理微环境中的生长谱。在图1A)中，当以单细胞封装时，细胞生长成细胞集落或模拟迷你肿瘤的癌球状体。球状体尺寸随着时间推移而增加。左图展示基于图像的分析，其表示为量化不同时间点形成的球状体尺寸分布的柱状图。癌细胞的球状体直径大小从生长第4天的35μm增加到第21天的155μm。右图显示生长中的癌细胞基于荧光钙黄绿素的活性染色图像。图1B)中展示癌细胞球状体在三维基质中的生长动力学。所述图描绘了通过Alamar 得到的代谢活性和通过流式细胞术得到的细胞计数，两个都是在最优分析条件下进行，结果显示类似的细胞生长谱，它们的特征是细胞生长动力学起初快速，随后平缓。在图1C)中，针对活细胞用钙黄绿素(绿色)给细胞球状体染色，并针对缺氧条件下的细胞用hypoxisense(红色)进行染色。在这个癌细胞系中，从培养过程中的约第14天开始观察到以红色标识的缺氧(通常在细胞球状体的中央)。为在灰度形象化，染色呈红色的球状体以虚线圆注明。染色为红色的区域在球状体的中央最强。
在本发明中，癌细胞谱化是关键步骤，因为它允许识别並研究癌细胞球状体在不同生长时间点时的生理特性(例如，缺氧)。重要的是，这些特性强烈取决于肿瘤组织的起源(如图8A-C中所展示)。此外，药物对肿瘤的疗效强烈地取决于肿瘤生理特征(如图3A-B和4A-B中所示)。在本发明中，基于癌细胞球状体的谱化生理特性，随后可调整药物筛选的治疗时间点，以模拟肿瘤在活体内的不同阶段。图1A-C和8A-C中证实，凝胶基质中的球状体展示细胞增殖的不同阶段和生理特性(例如，缺氧状态)。
图2展示基于癌症的谱化细胞生长和生理特性确定药物治疗时间表和读出时间点。针对生长在三维基质中的细胞给出了一个实例，这个实例包括“早期”和“晚期”药物治疗。如图1A-C中，从谱分析识别、得出不同癌症阶段的状态，并相应确定药物筛选时间表。这里，将培养在三维基质中的细胞的不同癌症阶段确定为“早期”和“晚期”癌症治疗。
“早期”包括两个读出时间点。在第7天的第一时间点係在药物治疗结束时，而在第11天的第二时间点跟在无药物恢复期后。“晚期”包括两个读出时间点。在第17天的第一时间点是在第二(独立于“早期”)药物治疗期结束时。在第21天的第二时间点跟在无药物恢复期后。可以在开始治疗前和/或不同无药物恢复期后的其它时间点进行测量。
“早期”(第4天到第7天)展示直径为35μm、高度增殖的细胞(展示于图9中)且通过测量缺氧标记物表达或其它生物化学方式测得无缺氧状态的小型球状体(图1C)。相反，“晚期”说明存在直径为155μm、细胞增殖低下(展示于图9中)且存在缺氧状态的大型球状体(图1C)。在两种情况中，在治疗结束后立即读出，以测试即时药物疗效，并在4天无药物期后读出，以测试如吉西他滨所观察到的情况一样的“迷你肿瘤”生长重现和/或药效延迟(图10)。
对于参考二维分析，通常在第一天与第4天间的对数增殖期内用药物测试细胞(图9)。
图3A-B展示对结肠癌HCT 116细胞集落使用如图2中所述的治疗时间表的药物筛选活动。作为“命中(Hit)”产生的一个实例，使用一些从商用药物库(Prestwick)筛选的药物。在图3A)中，展示通过代谢读出测量六十种药物对癌细胞的影响。这些化合物是一式三份地以10μM浓度进行测试。这里展示平均值和标准偏差。只有药物的三份重复都高于命中阈值(平均值+/-阴性对照的三倍标准偏差。使用不含药物的DMSO媒介物作为阴性对照)，才将它视为“命中”。上图表展示生长在二维基质和埋在三维基质中的癌细胞的早期治疗的头对头(head to head)比较，下图表展示埋在三维基质中的细胞的“早期”治疗和“晚期”治疗的比较。其展示，通过“早期”和“晚期”治疗，有效避免确定假阳性药物，从而减少命中数量。
在图3B中，展示量化“早期”和“晚期”治疗后立即测量的细胞集落(具体而言是癌球状体)的直径大小分布的基于图像的分析，作为一些从图3A选择的药物浓度为10μM的药物的实例。填充曲线对应“命中”，未填充曲线是“未命中”，这是利用“早期”和“晚期”结束时的代谢读出确定(阳性对照：用硫酸铜治疗的细胞；阴性对照：用DMSO治疗的细胞)。
在图4A-B中，展示确定对结肠癌HCT 116细胞集落的半抑制浓度(IC50)，作为图2中选定“命中”的Alamar 读出，实例5-氟尿嘧啶(5-FU)。对三维基质中的细胞进行“早期”和“晚期”治疗后立即读出。图4A中展示剂量依赖性药物疗效。箭头展示从“早期”治疗转变为“晚期”治疗的更高IC50浓度。这表明，5-FU治疗晚期癌症的功效较小，且证实这种药物在如图3A-B中的“晚期”药物筛选中所获得的“未命中”。以二维参考分析获得的的IC50曲线通常类似于本发明的“早期”治疗状态(三维)。这也在通过图3A中的两种分析方法观察到的大多数“命中”的药物筛选相关性中得到证明(上图)。图6中给出不同重复实验中测得的IC50浓度的汇总。在图4B中，显示生长在三维基质中的癌细胞球状体在选定药物浓度(IC50和1mM)下进行“早期”和“晚期”治疗后的基于图像的分析。上图展示球状体尺寸分布，下图展示相应的基于钙黄绿素的荧光图像。5-FU在“早期”治疗而不是“晚期”治疗中强烈抑制球状体生长，如在代谢读出分析中观察到的一样(图3A和4A)。这些结果与5-FU的临床用途一致，诊所中不再使用5-FU作为治疗结肠癌的单一药剂。
图5展示药物在治疗结束后的即时疗效和在无药物期(称为“恢复”)后的疗效的比较。这里，对结肠癌细胞集落进行5-FU治疗是作为一个实例而给出。根据图2中所述治疗时间表，在4天无药物恢复期前后测量“早期”治疗时间表(左图)和“晚期治疗时间表(右图)”的剂量依赖性疗效谱。观察到无药物期前后的IC50曲线和浓度无显著差异(图6)。有趣的是，就另一种源自胰腺的癌细胞和药物吉西他滨而言，无药物恢复期是利用本发明检测药物疗效的关键(图10)。本发明甚至容许可在无药物期后检测到所施加药物的效果的情况下识别药物。
图6展示利用本发明和参考二维细胞培养物分析与结肠癌细胞测得的药物5-FU的IC50浓度汇总。展示了三个独立重复实验的结果。
癌细胞通常在如细胞供应商和科学出版物所述的组织培养塑胶上长成二维单层。
在图7中，展示了结肠癌HCT 116细胞在二维环境中的生长。当达到汇合(confluence)时，整个组织培养塑胶表面被细胞覆盖，细胞通常因为空间限制而停止生长。不利的是，活体外情况并未恰当地反映活体内生理状态(例如，二维方法中的细胞层对活体内或三维培养方法中的三维细胞聚集；活体外在二维中所有细胞暴露至营养物和氧气供应对活体内或三维培养方法中球状体内细胞的低营养物和低氧条件)。
在图8A-C中，来自不同癌症类型的细胞的集落生长和球状体形成展现显著差异，这反映了关键活体内生理特性，尤其是在三维环境中从单细胞生长的时候，这与其它基于细胞聚集的三维细胞培养方法不同，其中球状体尺寸和生长取决于聚集细胞的数量。左手边的细胞图像是第14天的。比较三种癌细胞系，结肠HCT 116癌细胞、胰腺Panc-1癌细胞和卵巢癌细胞。A)左边展示在第14天生长在三维基质中的球状体的基于钙黄绿素的荧光图像。在右边，展示表示为量化第14天时癌细胞所形成的球状体尺寸分布的柱状图的基于图像的分析。一般而言，从一系列受试癌细胞来看，卵巢癌细胞形成最大的癌细胞球状体，胰腺细胞形成最小的癌细胞球状体，这与活体内肿瘤生长相当。在B)中，利用Alamar代谢活性荧光读出测定不同癌细胞的球状体生长曲线。卵巢癌细胞和结肠癌细胞在第11天与第15天间达到生长停滞，胰腺癌细胞则是在第21天达到。与胰腺癌细胞相比，卵巢癌和结肠癌细胞集落形成的生长动力学起初更快，同时更早变平缓。
在图8C中，展示三种生长在本发明三维环境中的细胞系呈现为通常在缺氧条件下观察到的标记物的随时间推移的基因表达的比较。被比较的细胞系是结肠癌细胞(HCT116)、胰腺癌细胞(Panc-1)和卵巢癌细胞(A2780)。受试的缺氧标记物是HIF-1a(缺氧诱发因子1α；主控缺氧调节因子)；VEGFA(参与血管生成的血管内皮生长因子A；参与pH调节的CAIX(碳酸酐酶IX)；参与产生能量的GLUT-1(葡萄糖转运体1)；参与产生能量的LDHA(乳酸脱氢酶A)；参与细胞凋亡的BNIP3(BCL-2/腺病毒-EIB-19-kDa-相互作用蛋白3)。三种在基因水平上测试的癌细胞系(随时间推移的基因表达谱)显示显著不同的行为。HIF-1a基因表达在A2780和HCT 116细胞中随时间推移保持在基本水平，但在Panc-1细胞中随时间推移上调。VEGFA表达对A2780细胞而言是恒定的，且在HCT 116和Panc-1细胞中上调6倍。CAIX表达随时间推移而增加，但受试细胞系间的其表达幅度差异巨大。A2780细胞中观察到最强CAIX基因表达(增加约4000倍)，随后是HCT 116细胞中的表达(增加约400-500倍)和Panc-1细胞(增加约60-80倍)中的表达。BNIP3、GLUT-1和LDHA的基因表达谱共同具有随时间推移而基因表达渐增的倾向。癌细胞的基因表达谱允许识别并研究癌细胞球状体在不同生长时间点时的生理特性。图8A)、B)和C)说明这些生理特性强烈地取决于肿瘤细胞起源和/或细胞生长阶段。图8C)提供定量数据，这些数据支持识别癌细胞的早期和晚期阶段的重要性，以便在相关阶段进行如所呈现的药物筛选。
在图9中，展示本发明利用埋在三维生理环境中的细胞的癌细胞HCT 116生长谱内的治疗时间表(上图)。为进行比较，展示二维参考分析(下图)。二维参考分析只涵盖第1天与第4天间的初始生长期。如本发明中药物治疗的分割涵盖“三维早期治疗期”(第4天到第7天)和“三维晚期治疗期”(第14天到第17天)。前者的特征为球状体的初始生长期，其展示相对小型球状体、无缺氧状态和高增殖作用，且后者的特征为稳定期，其展示大型球状体尺寸、缺氧状态和细胞增殖受阻。这与活体内肿瘤生长一致。
图10展示用吉西他滨治疗的胰腺Panc-1癌细胞。根据4至7天无药物恢复期前后的Alamar读出，测量对三维基质中的胰腺癌细胞培养物用吉西他滨进行“后期”治疗的剂量依赖性疗效谱。根据治疗后立即测量的二维参考分析和三维分析的读出，结果显示吉西他滨并无活性。然而，当在无药物恢复期后进行测量时，观察到吉西他滨是生长在三维环境中的癌细胞的强效细胞生长抑制剂。诊所使用吉西他滨作为单一药剂来治疗胰腺癌。通过本发明确定了强效原料药，它们在某些情况(例如，缺氧条件或细胞增殖稳定)下是有效的，和/或它们对细胞展示延迟疗效。

Claims (21)

1.一种基于细胞的药物筛选分析的方法，其包括以下步骤：
-在培养环境中培养细胞群体，
-依据所述细胞类型、所述细胞的生理特性、所形成组织的生理特性、原料药的作用方式或培养环境来界定至少两个监测时间点，其中通过就细胞的随时间变化的生理变化和行为绘制细胞的谱来界定所述至少两个监测时间点，
-至少在一个处理时间点将原料药施加至培养的细胞，所述处理时间点基于绘制细胞的谱来界定，
-至少在所述两个监测时间点监测所述原料药对细胞或所形成组织的影响。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述监测时间点是选自由以下组成的组：
-与特定细胞早期有关的时间点，和
-后期的时间点，和
-通过不存在或存在特定生理特性界定的时间点，和
-无药物恢复期后与测量药物疗效有关的时间点。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述与特定细胞早期有关的时间点在所述环境中培养细胞后的第4天与第7天之间。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述后期的时间点在所述环境中培养细胞后的第14天到第17天。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述特定生理特性为缺氧或细胞生长动力学变化。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在终止药物施加后继续监测细胞增殖1到7天或更多天。
7.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞培养在三维环境中，所述三维环境包括结构化合物和连接子化合物，以使得可聚合得到三维基质。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述结构化合物和连接子化合物包含具有乙烯砜末端基团的多分枝聚乙二醇和含至少两个半胱氨酸或通常硫醇基的肽。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述三维环境促进包封的细胞的三维生长。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述三维环境促进包封的细胞的球状体生长。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述三维环境是浇铸在接受器中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述接受器是凝胶浇铸装置或标准细胞培养装置。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述接受器是384孔板。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是选自任何类型的分化细胞和癌细胞的组。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述癌细胞选自结肠癌细胞、胰腺癌细胞和卵巢癌细胞。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是生长受到所述药物处理促进的细胞。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述原料药是选自以下的组：
(i)任何化学、天然或合成物质和已知药物筛选的任何物质；或
(ii)根据i)的物质的任何组合；
(iii)根据i)或ii)的任何物质，在溶液中或与任何载体、纳米颗粒或递送装置组合。
18.根据权利要求1所述的方法，其中监测细胞特性是通过以下进行分析：
代谢活性，
和/或流式细胞术，
和/或DNA含量，
和/或蛋白质定量，
和/或细胞计数，
和/或基于图像的分析，
和/或缺氧和血管生成标记物水平，
和/或核糖核酸(RNA)水平，
和/或基因表达水平，
和/或质谱分析，
和/或免疫组织化学。
19.根据权利要求1所述的方法，其中针对给定类型的细胞确定原料药的最大耐受剂量。
20.根据权利要求1所述的方法，其中针对给定类型的细胞确定原料药的最低有效剂量。
21.一种根据权利要求1至20中任一项所述的方法的用途，其用于评估以下：
(i)就所施加物质而言的分化细胞的重编程和
(ii)就所施加物质而言的干细胞的分化。
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