ES2729341T3 - Método para un ensayo de selección de fármacos basado en células y uso del mismo - Google Patents

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Abstract

Método para un ensayo de selección de fármacos basado en células que comprende las etapas de: - cultivar una población celular en un entorno de cultivo, - definir al menos dos puntos de monitorización en el tiempo dependiendo de al menos uno de los tipos celulares, las características fisiológicas de las células, las características fisiológicas del tejido formado, el modo de acción de una sustancia farmacológica y el entorno de cultivo, - aplicar sustancias farmacológicas a las células cultivadas al menos en un punto de tratamiento en el tiempo, - monitorizar el efecto de dicha sustancia farmacológica sobre las células o los tejidos formados al menos en dichos dos puntos de monitorización en el tiempo.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para un ensayo de selección de fármacos basado en células y uso del mismo
La presente invención se refiere a un método de selección de fármacos en células cultivadas en un entorno de cultivo según el preámbulo de la reivindicación independiente 1.
Los métodos de selección basados en células representan una fuente de información crucial en el proceso de toma de decisiones para evaluar el modo de acción, tal como la eficacia y la toxicidad, de nuevos compuestos, por ejemplo nuevos fármacos anticancerosos, en las fases tempranas del desarrollo preclínico de fármacos (Michelini, Cevenini et al., (2010) “Cell-based assays: fuelling drug discovery”. Anal Bioanal Chem 398(1): 227-238.; An y Tolliday (2010), “Cell-based assays for high-throughput screening”. Mol Biotechnol 45(2): 180-186; Sharma, Haber et al., (2010) “Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents”. Nature Reviews Cancer 10: 241-253.).
Dado su papel clave en el desarrollo de fármacos, en la última década se investigaron un gran número de enfoques novedosos hacia el desarrollo de ensayos basados en células fisiológicamente más relevantes (Yamada y Cukierman (2007), “Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D”. Cell 130(4): 601-610; Pampaloni, Reynaud et al. (2007); “The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue”. Nat Rev Mol Cell Biol 8(10): 839-845). Por ejemplo, en la biología de las células cancerosas y el desarrollo de fármacos antitumorales, un conjunto creciente de pruebas científicas sugiere que los métodos que permiten que las células cancerosas se organicen y crezcan en estructuras tridimensionales (modelos de cultivo tridimensional), en comparación con los cultivos convencionales sobre superficies de plástico planas (modelos de cultivo bidimensionales), reflejan comportamientos observados más estrechamente in vivo; en particular, con respecto al crecimiento celular, la señalización celular y la expresión génica (Abbott (2003). “Cell culture: Biology's new dimension”. Nature 424(6951): 870-872, Kunz-Schughart, Freyer et al. (2004), “The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model”. J Biomol Screen 9(4): 273-285; Bissell (2007), “Modelling molecular mechanisms of breast cancer and invasion: lessons from the normal gland”. Biochem Soc Trans 35 (Pt 1): 18-22.; Friedrich, Seidel et al. (2009). “Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach”. Nat Protoc 4(3): 309-324; Debnath y Brugge (2005), “Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures”. Nat Rev Cancer 5(9): 675-688).
Se han empleado varias técnicas para producir estos modelos de cultivo tridimensional más fisiológicos para someter a prueba fármacos anticancerosos (Nyga 2011, Cheema et al. (2011), “3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies” J. Cell Commun. Signal. 5, 239-248). Las técnicas tridimensionales más comunes usan o bien (i) matrices de gel de origen natural (Weaver, Petersen et al. (1997), “Reversion of the malignant fenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies”. J Cell Biol 137(1): 231-245.; Fiebig, Maier et al. (2004), “Clonogenic assay with established human tumour xenografts: correlation of in vitro to in vivo activity as a basis for anticancer drug discovery”. Eur J Cancer 40(6): 802-820; Krausz, de Hoogt et al. (2013), “Translation of a tumor microenvironment mimicking 3D tumor growth co-culture assay platform to high-content screening”. J Biomol Screen 18(1) : 54-66) o sintético (Loessner, Stok et al. (2010). “Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cell”. Biomaterials 31(32): 8494-8506; Sieh, Taubenberger et al. (2012), “Fenotypic characterization of prostate cancer LNCaP cells cultured within a bioengineered microenvironment”. PLoS One 7(9): e40217.; Yang y Zhao (2011). “A 3D model of ovarian cancer cell line on peptide nanofiber scaffold to explore the cell-scaffold interaction and chemotherapeutic resistance of anticancer drugs”. Int J Nanomedicine 6: 303-310) para encapsulación celular, (ii) soportes tridimensionales poliméricos rígidos (Fischbach, Chen et al. (2007), “Engineering tumors with 3D scaffolds”. Nat Methods 4(10): 855-860; Knight, Murray et al. (2011). “Alvetex(R): polistyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture”. Methods Mol Biol 695: 323-340) para siembra de células, o bien (iii) procedimientos de agregación celular sin matriz (documento WO 2010/031194 A1; (Friedrich, Seidel et al. (2009), “Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach”. Nat Protoc 4(3): 309-324; Karlsson, Fryknas et al. (2012). “Loss of cancer drug activity in colon cancer HCT-116 cells during spheroid formation in a new 3-D spheroid cell culture system”. Exp Cell Res 318(13): 1577-1585; Tung, Hsiao et al. (2011). “High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array”. Analyst 136(3): 473-478; Lama, Zhang et al. (2013). “Development, validation and pilot screening of an in vitro multi-cellular three-dimensional cancer spheroid assay for anti-cancer drug testing”. Bioorg Med Chem 21(4): 922-931) para hacer crecer estructuras tridimensionales de células cancerosas (por ejemplo esferoides, tejido).
No tener en cuenta la variación en la progresión de la enfermedad puede aumentar la probabilidad de seleccionar posibles fármacos falsos positivos (fármacos que no funcionarán en seres humanos) y desechar posibles fármacos falsos negativos (fármacos que habrían funcionado en seres humanos).
El documento US 2010/120070 A1 aborda el problema de que los ensayos de selección de fármacos disponibles anteriormente sólo proporcionan resultados generalizados, es decir, resultados que no están relacionados específicamente con un paciente individual. El documento US-2010/120070 A1 sugiere por tanto recoger una muestra de tejido de un paciente (o de otras partes del cuerpo). A partir de dicha muestra se obtiene un cultivo celular, que posteriormente se somete a un ensayo de selección de fármacos. Dicho documento no da a conocer ni sugiere ninguna etapa de método que proporcione un resultado en cuanto a si un determinado agente químico mostró eficacia con respecto a un medio de cultivo en dos momentos de monitorización diferentes, es decir cuando la célula se somete cambio en su comportamiento fisiológico en el tiempo.
En el documento US2011/0004414 A1, se aplica una sustancia sobre un cultivo de célula específicas, y después de un periodo de tiempo determinado, se evalúa si la administración de la sustancia ha provocado algún efecto. En el caso evaluado en ese documento, se monitoriza la expresión de genes marcadores específicos. En una etapa posterior, se realiza un análisis informático con el fin de predecir una posible toxicidad de la sustancia administrada, basándose en el efecto observado. No se da a conocer que el punto de tratamiento en el tiempo se haya elegido específicamente basándose en una etapa anterior de obtención de perfil. Por consiguiente, con este ensayo todavía existe el riesgo de que no se detectaran sustancias realmente eficaces, puesto que se administran en el punto en el tiempo equivocado.
El documento EP-2380920 A1 da a conocer la fabricación de un hidrogel a partir de un precursor. En él no se da a conocer ni se sugiere ningún ensayo específico en el que se haya elegido específicamente un punto de tratamiento en el tiempo basándose en una etapa anterior de obtención de perfil.
En un artículo de Loessner et al. (Biomaterials 2010, Vol. 31, págs. 8494-8506) se presenta y se comenta un ensayo tridimensional. Sin embargo, dicho artículo no da a conocer ni sugiere un ensayo que requiera una etapa de obtención de perfil para determinar un comportamiento o cambio fisiológico adecuado de una célula, que posteriormente se usa para la selección apropiada de los posibles fármacos.
Kunz-Schughart et al. (J. Biomol. Screnning, 2004, vol. 9, n.° 4, 273-285) revisa el desarrollo de modelos de esferoides multicelulares en el campo de la selección de alto rendimiento. Sin embargo, dicho artículo no da a conocer ni sugiere un ensayo que requiera una etapa de obtención de perfil para determinar un comportamiento o cambio fisiológico adecuado de una célula, que posteriormente se usa para la selección apropiada de posibles fármacos.
Marques-Gallego et al. (BMC Biotechnology 2010, vol. 10, n.° 1, 43) se refiere a evaluar la precisión de un ensayo de citotoxicidad basado en imágenes para células cultivadas en comparación con el ensayo de MTT. La obtención de imágenes y el análisis del crecimiento celular tiene lugar 24 h, 48 h y 72 h después del tratamiento con un sistema de obtención de imágenes CloneSelect. Dicho artículo no da a conocer un ensayo de selección de fármacos basado en células, sino que se refiere a la evaluación de la precisión de los ensayos de citotoxicidad basados en imágenes. Se refiere al examen de la precisión de una prueba basándose en el fármaco cisplatino, cuyo modo de acción se conoce bien. Además, el artículo carece de la etapa de definir activamente al menos dos puntos de monitorización en el tiempo dependiendo de los tipos celulares.
Smout et al. (PLOS neglected tropical diseases 2010, vol. 4 n.° 11, pág. E885) se refiere a la medición de la movilidad de los parásitos en tiempo real de una forma de rendimiento automatizado. Se aplica un fármaco a diferentes estadios de desarrollo del parásito, es decir huevo, larva, adulto, y se somete a prueba su movilidad. La movilidad se usó para determinar el valor de CI50 del fármaco. Se usó el ensayo de células en tiempo real (RTCA) para determinar la resistencia o la sensibilidad hacia fármacos antihelmínticos. Se midió en puntos de tiempo fijos que fueron los mismos para todas las variedades y estadios de desarrollo. Por tanto, no hay ninguna etapa de definición de al menos dos puntos de tiempo de monitorización en el tiempo dependiendo del tipo celular, las características fisiológicas de las células, las características fisiológicas del tejido formado, el modo de acción de la sustancia farmacológica y el entorno de cultivo.
Ebert et al. (J. Cardiovasc. Pharmacol. 2012, vol. 60, n.° 4, 408-416) es una revisión científica sobre los desarrollos en la aplicación de células madre pluripotentes inducidas para medicina regenerativa, modelado de enfermedad y selección de fármacos. No se proporciona ningún detalle sobre los métodos de cultivo celular.
Hwang et al (Advanced drug delivery review 2007, vol. 60, n.° 2, 199-214) se centra en modelos de diferenciación de células madre embrionarias humanas. El documento facilita un resumen de varios factores de diferenciación y biomateriales que proporcionan un microentorno apropiado para la asignación y diferenciación de células madre. El documento no da a conocer un método de selección de fármacos basado en células.
Por tanto, un objetivo de la presente invención es evitar las desventajas de los métodos de selección de fármacos conocidos y específicamente proporcionar datos sobre las actividades de fármaco sometidas a prueba en células de las que se ha obtenido perfil que presentan diferentes estados fisiológicos clave in vivo. Este objetivo se resuelve con el método de selección de fármacos según la reivindicación 1.
Según la presente innovación, el ensayo de selección de fármacos basado en células tiene en cuenta las células así como su comportamiento y cambios fisiológicos a lo largo del tiempo para entender el modo de acción de los fármacos. Comprende determinar al menos dos puntos de monitorización en el tiempo dependiendo del tipo celular, el entorno de cultivo, las características fisiológicas de las células, las características fisiológicas de las poblaciones celulares, las características fisiológicas del tejido formado, o la clase de sustancia farmacológica, por ejemplo el mecanismo de acción dirigido de una sustancia farmacológica. Las sustancias farmacológicas se aplican a las células cultivadas al menos en un punto de tratamiento en el tiempo. El efecto de un tipo de fármaco sobre la cinética de crecimiento celular, el comportamiento y/o las características fisiológicas se monitorizan al menos en dichos dos puntos de monitorización en el tiempo. Los puntos en el tiempo pueden ser un momento específico, pero también un periodo de tiempo determinado.
El entorno de cultivo incluye microentornos relevantes fisiológicos que tienen en cuenta las características físicas, biológicas y bioquímicas específicas, incluyendo interacciones célula-célula y célula-matriz para células específicas y/o tejidos formados.
La monitorización de la proliferación celular al menos en dos puntos en el tiempo, por ejemplo en un “estadio temprano” y en un “estadio tardío”, puede permitir la comparación de dos estadios durante el crecimiento celular y/o el desarrollo de las características fisiológicas y/o el efecto del tratamiento farmacológico. Puede ser necesario ajustar el entorno de crecimiento celular y las características fisiológicas para un tipo de célula o fármacos dados. Por tanto, el punto en el tiempo de la monitorización se elige preferiblemente tal como para proporcionar información relevante en vista del modo de acción de un fármaco para, por ejemplo los estadios temprano o tardío de cáncer; un cáncer específico puede considerarse “estadio temprano” preferiblemente de cuatro a siete días después de cultivar en un entorno fisiológicamente relevante, y “estadio tardío” preferiblemente de catorce a diecisiete días después de cultivar en un entorno fisiológicamente relevante. “Estadio tardío” también puede definirse por la ausencia o presencia de una característica fisiológica específica de rasgo distintivo, por ejemplo hipoxia o cambios en la cinética de crecimiento celular o constitución de células.
La monitorización células puede continuar de uno a siete o más días después de la terminación de la aplicación del fármaco. Tiene que determinarse el comienzo y el final del periodo libre de fármaco para un tipo de célula y fármaco específicos. Cuando se permite que las células se recuperen del tratamiento farmacológico, este periodo se denomina “fase de recuperación”. Incluir puntos en el tiempo relevantes para una recuperación después de una primera y/o una segundo aplicación del fármaco puede ser esencial para la identificación de fármacos eficaces o fármacos que no tienen un efecto inmediato sobre las células.
Las realizaciones preferidas pueden referirse por ejemplo a un procedimiento que incluye tratamiento en un “estadio temprano” y monitorización al menos en dos puntos relacionados en el tiempo con o sin una “fase de recuperación”, o tratamiento en un “estadio tardío” y monitorización al menos en dos puntos relacionados en el tiempo con o sin una “fase de recuperación”, o tratamientos en un “estadio temprano” y un “estadio tardío” y monitorización al menos en dos puntos relacionados en el tiempo con o sin una “fase de recuperación”.
El entorno usado para el cultivo celular puede comprender una matriz de sustrato o medio que imita el microentorno celular, preferiblemente una matriz tridimensional que consiste en un compuesto estructural y un compuesto de unión para facilitar la polimerización. El compuesto estructural puede ser polietilenglicol multirramificado que comprende grupos finales insaturados, preferiblemente grupos vinilo. El compuesto de unión comprende un péptido con al menos dos cisteínas o grupos tiol que permiten la polimerización del compuesto estructural en puente por medio del compuesto de unión. La matriz tridimensional comprende preferiblemente una composición de matriz tal como se describe en la publicación europea número 2561 005.
El entorno usado para el cultivo celular puede promover el crecimiento tridimensional (i) de una sola célula para formar una entidad multicelular o (ii) de múltiples células para formar una entidad multicelular, cuando se siembran en dicho entorno. Preferentemente, las células crecen para formar una colonia de células o una población celular. Por ejemplo, las disposiciones de colonias de células cancerosas forman esferoides que imitan la disposición tridimensional de los tumores donde las células exteriores son fácilmente accesibles y al mismo tiempo protegen las células en su núcleo.
Con el fin de producir un entorno tridimensional con una rigidez definida y una composición con características fisiológicas y biológicas apropiadas, puede usarse un elemento receptor o un dispositivo de cultivo celular convencional, preferiblemente una placa de 384 pocillos. Dicho entorno y las células pueden dispensarse al dispositivo con los medios de cultivo celular que entonces pueden colocarse en una estufa de incubación de cultivo celular. La monitorización de la proliferación y las actividades celulares pueden medirse usando equipos sensoriales y de obtención de imágenes que son compatibles con el elemento receptor o el dispositivo, preferiblemente equipos que son automatizados y maximizan la reproducibilidad de los datos de monitorización de salida.
Las células usadas para el cultivo en dicho entorno pueden ser cualquier tipo de célula de cualquier organismo, una célula o línea celular cultivada in vitro, una célula diferenciada o célula madre derivada de un organismo y una célula cancerosa de un organismo, preferentemente una célula de cáncer de colon, páncreas y ovario, pero también células sanas de las que se promueve el crecimiento.
Las sustancias farmacológicas aplicadas a las células cultivadas pueden ser cualquier sustancia seleccionada del grupo de cualquier sustancia química, natural o sintética, cualquier sustancia de selecciones de fármacos conocidos y sustancias reconocidas antes como fármacos anticanceroso. Las sustancias farmacológicas pueden aplicarse en forma líquida, en la que el líquido puede ser un disolvente orgánico o un tampón acuoso que comprende la sustancia farmacológica, como polvo, como pastilla o encapsulado en un portador, preferiblemente una nanopartícula.
La modalidad de lectura de ensayo para monitorizar la cinética de crecimiento celular y la actividad puede llevarse a cabo preferiblemente mediante cualquiera (i) del grupo seleccionado de actividad metabólica, preferiblemente ensayo Alamar Blue®, citometría de flujo, contenido de ácido desoxirribonucleico (ADN), cuantificación de proteínas, recuento celular, análisis basado en imágenes, niveles de expresión génica, espectrometría de masas, mediciones basadas en marcador (tal como tecnología de gen indicador, transferencia de energía de resonancia, ensayos de complementación de división o fragmentos de proteínas), o mediciones sin marcador (tales como sistemas de impedancia/biosensor eléctrico; sistemas de biosensor óptico, sistemas de resonancia de plasmón superficial, sistemas de biosensor acústico y sistemas que se aprovechan de la calorimetría, el cambio en la actividad eléctrica o mediante (ii) cualquier combinación de los ensayos de monitorización mencionados anteriormente. La monitorización de la proliferación celular da información directa sobre el efecto inducido por fármacos sobre la forma y la constitución celular.
La modalidad de lectura de ensayo para determinar otras características fisiológicas y biológicas (por ejemplo marcadores hipóxicos y/o angiogénicos) puede llevarse a cabo preferiblemente mediante cualquiera (i) del grupo seleccionado de niveles de ácido ribonucleico (ARN), niveles de expresión de proteínas, espectrometría de masas, inmunohistoquímica, análisis basado en imágenes, métodos proteómicos o mediante (ii) cualquier combinación de los ensayos de monitorización mencionados anteriormente.
Puede determinarse la concentración o dosis máxima tolerada de una sustancia farmacológica aplicada para una célula y tipo celular dados. La determinación de la dosis de fármaco aceptada de una célula, tipo celular o tejido permite el ajuste de las dosis de fármaco aplicadas cuando se seleccionan como diana células enfermas, preferiblemente células cancerosas.
Puede determinarse la menor dosis eficaz de una sustancia farmacológica aplicada para una célula y tipo celular dados. La determinación de la menor dosis eficaz de una célula, tipo celular o tejido permite el ajuste de las dosis de fármaco aplicadas, cuando se seleccionan como diana células enfermas, preferiblemente células cancerosas.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar el uso del método para monitorizar (i) el curado o la eliminación de células enfermas, el mantenimiento de las células sanas y la inducción de las células sanas a entrar en un estado de enfermedad por el tratamiento farmacológico o (ii) la reprogramación y/o diferenciación de células.
La reprogramación de células diferenciadas para dar células madre o células progenitoras con respecto a una sustancia farmacológica aplicada puede someterse a ensayo mediante cualquiera (i) del grupo seleccionado de actividad metabólica, preferiblemente ensayo Alamar Blue®, citometría de flujo, contenido de ácido desoxirribonucleico (ADN), cuantificación de proteínas, recuento celular, análisis basado en imágenes, niveles de expresión génica, espectrometría de masas, mediciones basadas en marcador (tal como tecnología de gen indicador, transferencia de energía de resonancia, ensayos de complementación de división o fragmentos de proteínas), o mediciones sin marcador (tales como sistemas de impedancia/biosensor eléctrico, sistemas de biosensor óptico, sistemas de resonancia de plasmón superficial, sistemas de biosensor acústico, y sistemas que se aprovechan de la calorimetría, el cambio en la actividad eléctrica o mediante (ii) cualquier combinación de los ensayos de monitorización mencionados anteriormente. La célula diferenciada puede ser cualquier célula, tipo celular, célula derivada de cultivo celular o célula derivada de un tejido específico. En el presente documento, la sustancia farmacológica aplicada puede desencadenar el proceso de reprogramación.
El método puede usarse para analizar la diferenciación de células madre para dar una célula diferenciada con respecto a una sustancia farmacológica aplicada según cinética de crecimiento celular y la actividad de la célula incluyendo cualquiera (i) del grupo seleccionado de actividad metabólica usando el ensayo Alamar Blue®, citometría de flujo, marcadores hipóxicos y angiogénicos, niveles de ácido ribonucleico (ARN), niveles de expresión de proteínas, espectrometría de masas, contenido de ADN, cuantificación de proteínas, recuento celular, análisis basado en imágenes, e inmunohistoquímica o mediante (ii) cualquier combinación de los ensayos de monitorización mencionados anteriormente. En el presente documento, la sustancia farmacológica aplicada puede desencadenar el proceso de diferenciación.
Aspectos y detalles adicionales de la presente invención resultarán evidentes a partir de las figuras y los ejemplos facilitados a continuación, que muestran:
Figura 1: Gráficos e imágenes que muestran el perfil de colonias de células y las condiciones hipóxicas de células de cáncer de colon (HCT 116) en una matriz tridimensional;
Figura 2: Representación esquemática que muestra la determinación de un programa de tratamiento farmacológico en un microentorno fisiológico tridimensional así como para cultivo de monocapa bidimensional convencional;
Figura 3: Gráfico que compara la selección de fármacos bidimensional frente a tridimensional usando el programa de tratamiento farmacológico determinado en la figura 2;
Figura 4: Gráficos e imágenes que muestran la determinación de perfiles de eficacia del fármaco dependiente de la dosis después del tratamiento de “estado temprano” y “estadio tardío”;
Figura 5: Gráfico que compara la eficacia de actividades de fármaco medidas inmediatamente después del final del tratamiento y después de un periodo libre de fármaco;
Figura 6: Tabla para resumir la eficacia del fármaco 5-fluorouracilo contra la colonia de células HCT 116 crecidas en un entorno tridimensional y en modelos celulares de cultivo 2D convencionales;
Figura 7: Gráfico que muestra el crecimiento bidimensional de células de cáncer de colon (HCT 116);
Figura 8: Gráficos e imágenes que muestran una comparación de los perfiles de expresión génica y crecimiento respectivos de marcadores hipóxicos en entornos tridimensionales de células de cáncer de colon, páncreas y ovarios;
Figura 9: Gráficos que muestran perfiles de crecimiento para cultivos bidimensionales y tridimensionales con programas de tratamiento independientes;
Figura 10: Gráfico que muestra células cancerosas pancreáticas tratadas con gemcitabina: Comparación de medir la actividad del fármaco inmediatamente después del final del tratamiento y después de cuatro y siete días de un periodo de recuperación libre de fármaco.
La figura 1 muestra el perfil de crecimiento de células de cáncer de colon (HCT 116) en un microentorno fisiológico tridimensional sin tratamiento farmacológico. En A), las células crecen como una colonia de células o esferoides de cáncer que imitan minitumores, cuando se encapsulan como células individuales. El tamaño del esferoide aumenta a lo largo del tiempo. El panel izquierdo muestra el análisis basado en imágenes representado como histogramas que cuantifican la distribución de tamaños de esferoides formados en diferentes puntos de tiempo. El tamaño de diámetro del esferoide de las células cancerosas aumenta desde 35 |im en el día cuatro hasta 155 |im en el día veintiuno de crecimiento. El panel derecho muestra imágenes de tinción en vivo basada en calceína de células cancerosas en crecimiento. En B), se muestra la cinética de crecimiento de los esferoides de células cancerosas en una matriz tridimensional. Se representan la actividad metabólica mediante el ensayo Alamar Blue® y el recuento celular mediante citometría de flujo, ambos realizados en condiciones de ensayo optimizadas que muestran perfiles de crecimiento celular similares caracterizados por cinética de crecimiento celular inicialmente rápida y que posteriormente se aplana. En C), los esferoides celulares se tiñeron con calceína (verde) para las células vivas y con HypoxiSense (rojo) para células en condiciones hipóxicas. En esta línea celular de cáncer, se observó hipoxia identificada en rojo (normalmente en el centro de los esferoides celulares) desde aproximadamente el día 14 en cultivo. Para la visualización en escala de grises, los esferoides que muestran tinción en rojo se indican con círculos en líneas discontinuas. La tinción en rojo es lo más intensa en el centro del esferoide.
La obtención del perfil de células cancerosas es una etapa clave en la presente invención, ya que permite identificar e investigar las características fisiológicas (por ejemplo hipoxia) de los esferoides de células cancerosas en diferentes puntos de tiempo de crecimiento. Cabe destacar que estas características dependen fuertemente del origen del tejido tumoral (tal como se muestra en la figura 8). Además, la eficacia del fármaco sobre los tumores depende fuertemente de características de fisiología del tumor (tal como se muestra en las figuras 3 y 4). Basándose en las características fisiológicas perfiladas de los esferoides de células cancerosas en la presente invención, pueden adaptarse después los puntos de tiempo del tratamiento para la selección de fármacos para imitar los diferentes estadios de los tumores in vivo. Los esferoides en la matriz de gel que presentan diferentes estadios de proliferación celular y características fisiológicas (por ejemplo, condiciones hipóxicas) se demuestran en las figuras 1 y 8.
La figura 2 muestra la determinación de un programa de tratamiento farmacológico y los puntos de tiempo de lectura basándose en el crecimiento de células perfiladas y en las características fisiológicas del cáncer. Se facilita un ejemplo que comprende un tratamiento farmacológico de “estadio temprano” y de “estadio tardío” para células crecidas en matrices tridimensionales. Se identifican las condiciones de diferentes estadios de cáncer, derivadas de ensayos de obtención de perfil, como en la figura 1, y se determinan programas para la selección de fármacos en consecuencia. En el presente documento, los diferentes estadios de cáncer para células cultivadas en matrices tridimensionales se determinan como tratamiento de cáncer de “estadio temprano” y “estadio tardío”.
El “estadio temprano” comprende dos puntos de tiempo para lectura. El primer punto de tiempo en el día siete es al final del tratamiento farmacológico, mientras que el segundo punto en el tiempo en el día once sigue a una fase de recuperación libre de fármaco. El “estadio tardío” comprende dos puntos de tiempo para lectura. El primer punto en el tiempo en el día diecisiete es al final de una segunda fase de tratamiento farmacológico (independente del “estadio temprano”). El segundo punto en el tiempo en el día veintiuno sigue a una fase de recuperación libre de fármaco. Pueden realizarse mediciones en puntos adicionales en el tiempo antes del comienzo del tratamiento y/o después de diferentes fases de recuperación libres de fármaco.
El “estadio temprano”, del día cuatro al siete, muestra pequeños esferoides con un diámetro de 35 |im, células altamente proliferativas (mostradas en la figura 9) y condiciones no hipóxicas determinadas con mediciones de la expresión del marcador hipóxico u otros medios bioquímicos (figura 1C). Por el contrario, el “estadio tardío” ilustra la existencia de esferoides más grandes con un diámetro de 155 |im, baja proliferación celular (mostrada en la figura 9), y presencia de condición hipóxica (figura 1C). En ambos casos, las lecturas se realizan inmediatamente después del final del tratamiento para someter a prueba la eficacia inmediata del fármaco, después de un periodo libre de fármaco de cuatro días para someter a prueba la recurrencia de crecimiento de “minitumores” y/o los efectos retardados del fármaco como en el caso observado con gemcitabina (figura 10).
Como referencia a los ensayos bidimensionales, las células normalmente se someten a prueba con fármacos dentro de la fase de proliferaciones logarítmicas entre el día uno y el cuatro (figura 9).
La figura 3 muestra una campaña de selección de fármacos usando un programa de tratamiento tal como se describe en la figura 2 en colonias de células de cáncer de colon HCT 116. Como ejemplo para la generación de “resultado positivo” se usa una selección de fármacos de una biblioteca de fármacos disponible comercialmente (Prestwick). En A) se muestra el efecto de sesenta fármacos sobre células cancerosas medido mediante lectura metabólica (ensayo AlamarBlue®). Los compuestos se someten a prueba por triplicado a una concentración de 10 |iM. Se muestran aquí las medias y las desviaciones estándar. Se considera que un fármaco es un “resultado positivo” sólo si sus tres repeticiones están por encima del umbral de resultado positivo (media /- tres veces las desviaciones estándar del control negativo. Se usan condiciones con vehículo de DMSO que carece del fármaco como controles negativos). El diagrama superior muestra una comparación directa de tratamiento temprano de células cancerosas crecidas en dos dimensiones e incorporadas en una matriz tridimensional, siendo el diagrama inferior una comparación del tratamiento de “estadio temprano” y “estadio tardío” de células incorporadas en una matriz tridimensional. Muestra que con el tratamiento de “estadio temprano” y “estadio tardío” se evita eficazmente la identificación de fármacos falso positivos que reducen el número de resultados positivos.
En la figura 3 B se muestra un análisis basado en imágenes que cuantifica la distribución de tamaños de diámetro de colonias de células, específicamente de esferoides de cáncer medidos inmediatamente después del tratamiento de “estadio temprano” y “estadio tardío” como ejemplo de una selección de fármacos de la figura 3 A a una concentración de fármaco de 10 |iM. Las curvas rellenas corresponden a “resultados positivos” y las curvas no rellenas son “ausencia de resultado positivo” tal como se determina usando lecturas metabólicas a las finalizaciones del “estadio temprano” y el “estadio tardío” (Control positivo: células tratadas con sulfato de cobre; control negativo: células tratadas con DMSO).
En la figura 4 se muestra la determinación de la mitad de la concentración inhibidora máxima (CI50) como una lectura del ensayo Alamar Blue® de “resultados positivos” seleccionados en la figura 2, por ejemplo el 5-fluorouracilo (5-FU), sobre colonias de células de cáncer de colon HCT 116. La lectura se realizó inmediatamente después de los tratamientos de “estadio temprano” y “estadio tardío” de las células en una matriz tridimensional. La eficacia del fármaco dependiente de la dosis se muestra en la figura 4 A. La flecha muestra un cambio hacia concentraciones CI 50 superiores desde el tratamiento de “estadio temprano” hasta el de “estadio tardío”. Esto indica que el 5-FU es menos potente en el tratamiento de cánceres de estadio tardío, y confirma la “ausencia de resultado positivo” obtenida para este fármaco en la selección de fármacos de “estadio tardío” como en la figura3. Las curvas de CI50 obtenidas con los ensayos de referencia bidimensionales a menudo son similares a las condiciones de tratamiento de “estadio temprano” de la presente invención (tridimensional). Esto también se muestra en la correlación de selección de fármacos de la mayor parte de “resultados positivos” observados con los dos métodos de ensayo en la figura 3 A (panel superior). En la figura 6 se muestra un resumen de las concentraciones CI50 determinadas en diferentes experimentos repetidos. En la figura 4 B se muestran un análisis basado en imágenes de esferoides de células cancerosas crecidas en una matriz tridimensional después del tratamiento de “estadio temprano” y “estadio tardío” a concentraciones de fármaco seleccionadas, CI50 y 1 mM. El panel superior muestra la distribución de tamaño de esferoides, correspondiendo el panel inferior a imágenes fluorescentes basadas en calceína. El 5-FU mostró una fuerte inhibición de crecimiento de esferoides en el tratamiento de “estadio temprano”, pero no en el de “estadio tardío” tal como se observa también en el análisis de lectura metabólica (figuras 3A y 4A). Estos resultados están en línea con el uso clínico del 5-FU, que ya no se emplea como agente único para curar el cáncer de colon en las clínicas.
La figura 5 muestra una comparación de la eficacia del fármaco inmediatamente después del final del tratamiento y después de un periodo libre de fármaco, denominado “recuperación”. En este caso, se da como ejemplo el tratamiento con 5-FU en colonias de células de cáncer de colon. Se midieron los perfiles de eficacia dependientes de la dosis para el programa de tratamiento de “estadio temprano” (panel izquierdo) y “estadio tardío” (panel derecho) antes y después del periodo de recuperación libre de fármaco de cuatro días según el programa de tratamiento descrito en la figura 2. No se observaron diferencias significativas antes y después del periodo libre de fármaco en las concentraciones y las curvas de CI50 (figura 6). Resulta interesante que con otra célula cancerosa derivada de páncreas y el fármaco gemcitabina, el periodo de recuperación libre de fármaco fue clave para la detección de la eficacia del fármaco usando la presente invención (figura 10). La presente invención permite la identificación de fármacos incluso cuando el efecto del fármaco aplicado es detectable después de un periodo libre de fármaco.
La figura 6 muestra un resumen de las concentraciones CI50 del fármaco 5-FU determinadas usando la presente invención y ensayos de cultivo celular bidimensional de referencia con células de cáncer de colon. Se muestran los resultados de tres experimentos repetidos independientes.
Las células de cáncer normalmente crecen como una monocapa bidimensional en plástico de cultivo tisular tal como describen proveedores de células y publicaciones científicas.
En la figura 7 se muestra el crecimiento en un entorno bidimensional de células de cáncer de colon HCT 116. Tras alcanzar la confluencia, toda la superficie de plástico del cultivo tisular está cubierta por células, dejando las células de crecer normalmente debido a limitaciones de espacio. De manera desventajosa, la situación in vitro no refleja apropiadamente el estado fisiológico in vivo (por ejemplo, capa de células en métodos bidimensionales frente a la aglomeración celular tridimensional in vivo o en los métodos de cultivo tridimensional; todas las células expuestas a suministro de nutrientes y oxígeno en dos dimensiones in vitro frente bajas condiciones de nutrientes y oxígeno para células dentro de esferoides in vivo o en métodos de cultivo tridimensional).
En la figura 8, células de diferentes tipos de cáncer muestran diferencias significativas en el crecimiento de colonias y la formación de esferoides, lo que refleja características fisiológicas clave in vivo, en particular cuándo crecen a partir de células individuales en entornos tridimensionales, en contraposición a otros métodos de cultivo celular tridimensional basados en agregación celular, en los que el tamaño del esferoide y el crecimiento dependen del número de células agregadas. Las imágenes de células de la izquierda son en el día catorce. Se compararon tres líneas celulares de cáncer, células de cáncer de colon HCT 116, páncreas Panc-1 y ovario. En el lado izquierdo de A) se muestran imágenes fluorescentes basadas en calceína de esferoides crecidos en matriz tridimensional en el día catorce. A la derecha, se muestra el análisis basado en imágenes representado como histogramas que cuantifican la distribución de tamaños de esferoide, formados por células cancerosas en el día catorce. En general, las células de cáncer de ovario formaron esferoides de células cancerosas más grandes, y las células de páncreas esferoides de células cancerosas más pequeños a partir del conjunto de células cancerosas sometido a prueba, que es comparable con el crecimiento tumoral in vivo. En B), se determinaron curvas de crecimiento de esferoides de diferentes células cancerosas usando la lectura de fluorescencia de la actividad metabólica en el ensayo Alamar Blue®. Las células de cáncer de ovario y de colon alcanzaron su meseta de crecimiento entre el día once y el quince, las células de cáncer de páncreas en el día veintiuno. La formación de colonias de células de cáncer de ovario y colon mostró cinéticas de crecimiento inicial más rápidas con aplanamiento más temprano en comparación con las células de cáncer de páncreas.
En la figura 8 C) se muestra una comparación de tres líneas celulares crecidas en entornos tridimensionales de la invención tal como se presenta en la expresión génica a lo largo del tiempo para marcadores que se observan normalmente en condiciones hipóxicas. Las líneas celulares comparadas son células de cáncer de colon (HCT 116), células de cáncer de páncreas (Panc-1) y células de cáncer de ovario (A2780). Los marcadores hipóxicos sometidos a prueba son HIF-1a (factor inducible por hipoxia 1 alfa; regulador de hipoxia maestro); VEGFA (factor de crecimiento endotelial vascular A, que está implicado en angiogénesis; CAIX (anhidrasa carbónica IX), que está implicada en la regulación del pH; GLUT-1 (transportador de glucosa 1), que está implicado en la producción de energía; LDHA (lactato deshidrogenasa A), que está implicada en la producción de energía; BNIP3 (proteína que interacciona con BCL-2/-EIB-19 kDa de adenovirus, 3), que está implicada en apoptosis. Las tres líneas de células de cáncer sometidas a prueba a nivel génico (perfiles de expresión génica a lo largo del tiempo) mostraron comportamientos significativamente diferentes. La expresión del gen de HIF-1a se mantiene a un nivel básico en las células A2780 y HCT 116 a lo largo del tiempo, pero se regula por incremento en las células Panc-1 a lo largo del tiempo. La expresión de VEGFA es constante para las células A2780 y está regulada por incremento hasta seis veces en las células HCT 116 y Panc-1. La expresión de CAIX aumenta a lo largo del tiempo, pero la magnitud de su expresión difiere drásticamente entre las líneas celulares sometidas a prueba. Se observa la expresión más fuerte del gen de CAIX en las células A2780 (aumento de aproximadamente 4000 veces), seguido por la expresión en las células HCT 116 (aumento de aproximadamente 400-500 veces) y Panc-1 (aumento de aproximadamente 60-80 veces). Los perfiles de expresión génica de BNIP3, GLUT-1 y LDHA comparten la tendencia de aumentar la expresión génica a lo largo del tiempo. La obtención del perfil de la expresión génica de las células cancerosas permite la identificación e investigación de las características fisiológicas de los esferoides de células cancerosas en diferentes puntos en el tiempo de crecimiento. Las figuras 8 A), B) y C) ilustran que esas características fisiológicas dependen fuertemente del origen de las células tumorales y/o del estadio del crecimiento celular. La figura 8 C) proporciona datos cuantitativos, que apoyan la importancia de identificar el estadio temprano y las fases de estadio tardío de las células cancerosas con el fin de realizar la selección de fármacos tal como se presenta en estadios relevantes.
En la figura 9 se muestra un programa de tratamiento dentro del perfil de crecimiento de células cancerosas HCT 116 para la presente invención usando células incorporadas en un entorno fisiológico tridimensional (panel superior). Para comparación, se muestra un ensayo de referencia bidimensional (panel inferior). El ensayo de referencia bidimensional sólo cubre la fase de crecimiento inicial entre el día uno y el día cuatro. La división del tratamiento farmacológico como en la presente invención cubre un “periodo de tratamiento temprano tridimensional” (día cuatro a siete) y un “periodo de tratamiento tardío tridimensional” (día catorce a diecisiete). El primero se caracteriza por una fase de crecimiento inicial de esferoides que muestran esferoides relativamente pequeños, condiciones no hipóxicas y alta proliferación, y el segundo por una fase estacionaria que muestra tamaño de esferoides grandes, condiciones hipóxicas y proliferación celular detenida. Esto está en línea con el crecimiento tumoral in vivo.
La figura 10 muestra células de cáncer de páncreas Panc-1 tratadas con gemcitabina. Se midieron los perfiles de eficacia dependientes de la dosis para el tratamiento de “estadio tardío” con gemcitabina en cultivo de células de cáncer de páncreas en matrices tridimensionales según la lectura del ensayo Alamar Blue® antes y después del periodo de recuperación libre de fármaco de cuatro a siete días. Según las lecturas de los ensayos de referencia bidimensionales y los ensayos tridimensionales medidos inmediatamente después del tratamiento, la gemcitabina no mostró ser activa. Sin embargo, cuando las mediciones se realizaron después de un periodo de recuperación libre de fármaco, se observó que la gemcitabina era un potente inhibidor del crecimiento celular de células cancerosas crecidas en un entorno tridimensional. La gemcitabina se usa como agente individual en clínica para curar el cáncer de páncreas. Con la presente invención se identifican sustancias farmacológicas potentes que son eficaces en determinadas circunstancias, por ejemplo condiciones hipóxicas o proliferación celular estacionaria, y/o que muestran eficacia retardada sobre las células.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Método para un ensayo de selección de fármacos basado en células que comprende las etapas de:
- cultivar una población celular en un entorno de cultivo,
- definir al menos dos puntos de monitorización en el tiempo dependiendo de al menos uno de los tipos celulares, las características fisiológicas de las células, las características fisiológicas del tejido formado, el modo de acción de una sustancia farmacológica y el entorno de cultivo,
- aplicar sustancias farmacológicas a las células cultivadas al menos en un punto de tratamiento en el tiempo, - monitorizar el efecto de dicha sustancia farmacológica sobre las células o los tejidos formados al menos en dichos dos puntos de monitorización en el tiempo.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dichos puntos de monitorización en el tiempo se seleccionan del grupo que consiste en
- un punto de tiempo relevante para un estadio temprano de una célula específica, preferiblemente entre cuatro y siete días después de cultivar las células en el entorno, y
- un punto de tiempo para un estadio tardío, preferiblemente de catorce a diecisiete días después de cultivar las células en el entorno, y
en un punto en el tiempo definido por la ausencia o presencia de una característica fisiológica específica por ejemplo hipoxia o cambio en la cinética de crecimiento celular, y
- un punto de tiempo relevante para medir la eficacia del fármaco después de una fase de recuperación libre de fármaco.
3. Método según la reivindicación 1 y 2, en el que la monitorización de la proliferación celular continúa de uno a siete o más días después de la terminación de la aplicación del fármaco.
4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que las células se cultivan en un entorno, que comprende un compuesto estructural y un compuesto de unión, preferentemente que comprende un polietilenglicol multirramificado con grupos terminales de vinilsulfona y un péptido que comprende al menos dos cisteínas o, generalmente grupos tiol que permiten la polimerización a una matriz tridimensional.
5. Método según la reivindicación 4, en el que dicha matriz tridimensional promueve el crecimiento tridimensional de las células encapsuladas, preferentemente el crecimiento de esferoides.
6. Método según las reivindicaciones 4 y 5, en el que dicha matriz tridimensional se cuela en un elemento receptor tal como un dispositivo de colada en gel o un dispositivo de cultivo celular convencional, preferiblemente una placa de 384 pocillos.
7. Método según la reivindicación 1 a 6, en el que dichas células se seleccionan del grupo de cualquier tipo de célula, línea celular, célula diferenciada y célula cancerosa tal como célula de cáncer de colon, páncreas y ovario.
8. Método según la reivindicación 1 a 6, en el que dichas células son células de las que se promueve el crecimiento por el tratamiento farmacológico.
9. Método según la reivindicación 1 a 8, en el que dichas sustancias farmacológicas se seleccionan del grupo de (i) cualquier sustancia química, natural o sintética y cualquier sustancia de selecciones de fármacos conocidos; o (ii) cualquier combinación de sustancias según i);
(iii) cualquier sustancia(s) según i) o ii), o bien en disolución o bien combinada(s) con cualquier portador, nanopartícula o dispositivo de administración.
10. Método según la reivindicación 1 a 9, en el que la monitorización de las características celulares se somete a ensayo mediante
actividad metabólica
y/o citometría de flujo,
y/o contenido de ADN,
y/o cuantificación de proteínas,
y/o recuento celular,
y/o análisis basado en imágenes,
y/o niveles de marcadores hipóxicos y angiogénicos,
y/o niveles de ácido ribonucleico (ARN),
y/o niveles de expresión de proteínas,
y/o espectrometría de masas,
y/o inmunohistoquímica.
11. Método según la reivindicación 1 a 10, en el que se determina la dosis máxima tolerada de una sustancia farmacológica para un tipo de célula dado.
12. Método según la reivindicación 1 a 11, en el que se determina la menor dosis eficaz de una sustancia farmacológica para un tipo de célula dado.
13. Uso del método según la reivindicación 1 a 12 para evaluar
(i) la reprogramación de células diferenciadas con respecto a una sustancia aplicada y
(ii) la diferenciación de células madre con respecto a una sustancia aplicada.
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