KR20160003761A - 세포 기반 약물 스크리닝 분석 방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, (i) 배양 환경에서 세포 집단을 배양하는 단계, (ii) 세포 유형, 세포의 생리학적 특징, 형성된 조직의 생리학적 특징, 약물 물질의 작용 방식 및 배양 환경 중 적어도 하나에 의존적으로 적어도 2개의 모니터링 시점을 한정하는 단계, (iii) 적어도 1개의 처리 시점에서 약물 물질을 배양된 세포에 적용하는 단계, (iv) 적어도 상기 2개의 모니터링 시점에서 세포 또는 형성된 조직에 대한 상기 약물 물질의 효과를 모니터링하는 단계를 포함하는, 세포 기반 약물 스크리닝 분석 방법에 관한 것이다.

Description

세포 기반 약물 스크리닝 분석 방법 및 이의 용도{METHOD FOR A CELL-BASED DRUG SCREENING ASSAY AND THE USE THEREOF}
본 발명은 독립 청구항 제1항의 서두에 따른 배양 환경에서 배양된 세포 상에서의 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
세포 기반 스크리닝 방법은, 임상전 약물 개발의 초기 단계에서 새로운 화합물, 예를 들어 새로운 항암 약물의 작용 방식, 예컨대 효능 및 독성을 평가하는 의사 결정 과정에서 정보의 중요한 공급원을 나타낸다(Michelini, Cevenini et al., (2010) "Cell-based assays: fuelling drug discovery." Anal Bioanal Chem 398(1): 227-238.; An and Tolliday (2010), "Cell-based assays for high-throughput screening." Mol Biotechnol 45(2): 180-186; Sharma, Haber et al., (2010) "Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents." Nature Reviews Cancer 10 : 241-253).
약물 개발에서의 핵심적인 역할을 고려해 볼 때, 지난 10년간 생리학적으로 더 관련된 세포 기반 분석법의 개발을 향해 매우 많은 신규 접근법이 연구되었다(Yamada and Cukierman (2007), "Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D." Cell 130(4): 601-610; Pampaloni, Reynaud et al. (2007); "The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue." Nat Rev Mol Cell Biol 8(10): 839-845). 예를 들어, 암 세포 생물학 및 항종양 약물 개발에 있어서, 과학적 증거의 규모 증가는, 편평한 플라스틱 표면 상에서의 종래 배양(2차원 배양 모델)에 비하여 암 세포가 3차원 구조로 조직화하고 성장할 수 있게 하는 방법(3차원 배양 모델)이 생체내에서; 특히 세포 성장, 세포 신호전달 및 유전자 발현에 관해서 관찰된 거동을 더 근접하게 반영함을 시사한다(Abbott (2003). "Cell culture: Biology's new dimension." Nature 424(6951): 870-872, Kunz-Schughart, Freyer et al. (2004), "The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model." J Biomol Screen 9(4): 273-285; Bissell (2007), "Modelling molecular mechanisms of breast cancer and invasion: lessons from the normal gland." Biochem Soc Trans 35(Pt 1): 18-22.; Friedrich, Seidel et al. (2009). "Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach." Nat Protoc 4(3): 309-324; Debnath and Brugge (2005), "Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures." Nat Rev Cancer 5(9): 675-688).
항암 약물을 테스트하는 더 생리학적인 이러한 3차원 배양 모델을 생성하기 위하여 몇몇 기법들이 이용되어 왔다(Nyga 2011, Cheema et al.(2011), "3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies" J. Cell Commun. Signal. 5, 239-248). 가장 일반적인 3차원 기법은 3차원의 암 세포 구조(예를 들어, 회전타원체, 조직)를 성장시키기 위해 (i) 세포 캡슐화에 있어서 천연 기원 유래의 겔 매트릭스(matrix)(Weaver, Petersen et al. (1997), "Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies." J Cell Biol 137(1): 231-245.; Fiebig, Maier et al. (2004), "Clonogenic assay with established human tumour xenografts: correlation of in vitro to in vivo activity as a basis for anticancer drug discovery." Eur J Cancer 40(6): 802-820; Krausz, de Hoogt et al. (2013), "Translation of a tumor microenvironment mimicking 3D tumor growth co-culture assay platform to high-content screening." J Biomol Screen 18(1): 54-66) 또는 합성 기원 유래의 겔 매트릭스(Loessner, Stok et al. (2010). "Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells." Biomaterials 31(32): 8494-8506; Sieh, Taubenberger et al. (2012), "Phenotypic characterization of prostate cancer LNCaP cells cultured within a bioengineered microenvironment." PLoS One 7(9): e40217.; Yang and Zhao (2011). "A 3D model of ovarian cancer cell lines on peptide nanofiber scaffold to explore the cell-scaffold interaction and chemotherapeutic resistance of anticancer drugs." Int J Nanomedicine 6: 303-310), (ii) 세포 파종에 있어서 강성의 중합체 3차원 스캐폴드(Fischbach, Chen et al. (2007), "Engineering tumors with 3D scaffolds." Nat Methods 4(10): 855-860; Knight, Murray et al. (2011). "Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture." Methods Mol Biol 695: 323-340), 또는 (iii) 매트릭스가 없는 세포 응집 공정(WO 2010/031194 A1;(Friedrich, Seidel et al. (2009), "Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach." Nat Protoc 4(3): 309-324; Karlsson, Fryknas et al. (2012). "Loss of cancer drug activity in colon cancer HCT-116 cells during spheroid formation in a new 3-D spheroid cell culture system." Exp Cell Res 318(13): 1577-1585; Tung, Hsiao et al. (2011). "High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array." Analyst 136(3): 473-478; Lama, Zhang et al. (2013). "Development, validation and pilot screening of an in vitro multi-cellular three-dimensional cancer spheroid assay for anti-cancer drug testing." Bioorg Med Chem 21(4): 922-931)을 사용한다.
질환 진행에 있어서 변화를 고려하지 못함은 위양성 약물 후보물(인간에서 작용하지 않을 약물)을 선택할 가능성 및 위음성 약물 후보물(인간에서 작용할 약물)를 폐기할 가능성을 증가시킬 수 있다.
그러므로, 본 발명의 목적은 공지된 약물 스크리닝 방법의 단점을 피하고, 특히 상이한 핵심 생리학적 생체 내 질환 상태를 나타내는 프로파일링된 세포 상에서 테스트된 약물 활성에 대한 데이터를 제공하는 것이다. 이러한 목적은 청구항 제1항에 따른 약물 스크리닝 방법을 이용하여 해결된다.
본 혁신 기술에 따르면, 세포 기반 약물 스크리닝 분석법은 세포뿐만 아니라 시간 경과에 따른 생리학적 변화 및 거동을 고려하여 약물의 작용 방식을 이해한다. 상기 분석법은 세포 유형, 배양 환경, 세포의 생리학적 특징, 세포 집단의 생리학적 특징, 형성된 조직의 생리학적 특징, 또는 약물 물질의 종류, 예를 들어 약물 물질 작용의 목표 메커니즘에 의존적으로 적어도 2개의 모니터링 시점을 결정하는 단계를 포함한다. 약물 물질은 적어도 하나의 처리 시점에서 배양된 세포에 적용된다. 세포 성장 동력학, 거동 및/또는 생리학적 특징에 대한 약물 종류의 영향은 적어도 상기 2개의 모니터링 시점에서 모니터링된다. 시점은 특정 순간뿐만 아니라 특정 시간일 수 있다.
배양 환경은 특정 세포 및/또는 형성된 조직에 있어서 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 포함하여 특정 물리적, 생물학적 및 생화학적 특성을 고려하는 생리학적 관련 미세환경을 포함한다.
적어도 2개의 시점에서, 예를 들어 "초기 단계"에서 그리고 "말기 단계"에서 세포 증식의 모니터링은 약물 처치의 생리학적 특성 및/또는 효과의 발전 및/또는 세포 성장 동안 2개 단계의 비교를 가능하게 할 수 있다. 세포-성장 환경 및 생리학적 특성은 주어진 세포 유형 또는 약물에 대하여 조정될 필요가 있을 수 있다. 따라서 모니터링 시점은 바람직하게, 예를 들어 암의 초기 또는 말기 단계에 대한 약물 작용 방식의 관점에서 관련된 정보를 제공하도록 선택되며; 특정 암은 "초기 단계"가 바람직하게 생리학적으로 관련된 환경에서 배양한 후 4일 내지 7일인 것으로 간주되고, "말기 단계"는 바람직하게 생리학적으로 관련된 환경에서 배양한 후 14일 내지 17일인 것으로 간주될 수 있다. "말기 단계"는 또한 세포 성장 동력학 또는 세포 구성에 있어서 특이적인 생리학적으로 특징적인 특성, 예를 들어 저산소증 또는 변화의 부재 또는 존재에 의해 정의될 수 있다.
세포의 모니터링은 약물 적용의 종료 후 1일 내지 7일 이상 계속할 수 있다. 무약물 기간의 시작 및 끝은 특정 세포 유형 및 약물에 대하여 결정되어야 한다. 세포가 약물 처치에서 벗어나게 할 수 있으므로, 이 기간은 "회복 단계"라 명명된다. 제1 및/또는 제2 약물 적용 후 회복을 위하여 관련된 시점을 포함하는 것은 세포에 즉각적인 효과를 나타내지 않는 약물 또는 효과적인 약물의 식별을 위해 필수적일 수 있다.
바람직한 실시형태는, 예를 들어 "초기 단계"에서의 처치 및 "회복 단계"가 있는 또는 "회복 단계"가 없는 적어도 2개의 관련 시점에서 모니터링하는 것을 포함하는 과정, 또는 "말기 단계"에서의 처치 및 "회복 단계"가 있는 또는 "회복 단계"가 없는 적어도 2개의 관련 시점에서 모니터링하는 것을 포함하는 과정, 또는 "초기 단계" 및 "말기 단계"에서의 처치 및 "회복 단계"가 있는 또는 "회복 단계"가 없는 적어도 2개의 관련 시점에서 모니터링하는 것을 포함하는 과정을 말한다.
세포 배양에 사용되는 환경은 세포 미세환경을 모방하는 기질 매트릭스 또는 배지, 바람직하게는 중합을 용이하게 하는 구조 화합물 및 링커 화합물로 이루어진 3차원 매트릭스를 포함할 수 있다. 구조 화합물은 불포화 말단기, 바람직하게는 비닐기를 포함하는 다분지 폴리에틸렌 글라이콜일 수 있다. 링커 화합물은 링커 화합물에 의해 가교된 구조 화합물의 중합을 가능하게 하는 적어도 2개의 시스테인 또는 티올기를 지니는 펩타이드를 포함한다. 3차원 매트릭스는 바람직하게 유럽 특허 공개 번호 제2 561 005호에 기재된 바와 같은 매트릭스 조성을 포함한다.
세포 배양에 사용되는 환경은, 상기 환경에 파종될 때 (i) 다세포 개체를 형성하는 단일 세포 또는 (ii) 다세포 개체를 형성하는 복수 세포의 3차원 성장을 촉진할 수 있다. 우선적으로, 세포는 성장하여 세포 콜로니 또는 세포 집단을 형성한다. 예를 들어, 암 세포의 콜로니 배열은, 외부 세포가 용이하게 접근가능하고 동시에 중심에 있는 세포를 보호하는 종양의 3차원 배열을 모방하는 회전타원체를 형성한다.
한정된 강성도를 지니는 3차원 환경 및 적절한 생리학적 및 생물학적 특징을 지니는 조성물을 생성하기 위하여, 용기 또는 표준 세포-배양 장치, 바람직하게는 384-웰 플레이트가 사용될 수 있다. 상기 환경과 세포는 세포 배양 배지와 함께 장치 내로 분배될 수 있으며, 그 다음 상기 세포 배양 배지는 세포 배양 인큐베이터 내에 배치될 수 있다. 세포 증식 및 활성의 모니터링은 용기 또는 장치, 바람직하게는 산출 모니터링 데이터의 재현성을 최대화하고 자동화되는 장비와 호환가능한 영상화 및 감각 장비를 사용하여 측정될 수 있다.
상기 환경에서 배양에 사용되는 세포는 시험관내에서 배양되거나 분화된 임의의 유기체, 세포 또는 세포주의 세포 또는 유기체로부터 유래한 줄기 세포 및 유기체의 암 세포, 우선적으로 결장, 췌장 및 난소 암 세포뿐만 아니라 성장이 촉진된 건강한 세포의 임의의 유형일 수 있다.
배양된 세포에 적용되는 약물 물질은 임의의 화학, 천연 또는 합성 물질의 군 중 선택된 임의의 물질, 공지된 약물 스크린의 임의의 물질 및 항암 약물로서 이전에 인식된 물질일 수 있다. 약물 물질은 액체 형태로 적용될 수 있되, 상기 액체는 약물 물질을 분말로서, 환제(pill)로서 또는 담체 중에 캡슐화된 형태, 바람직하게는 나노입자로서 포함하는 유기 용매 또는 수성 완충액일 수 있다.
세포 성장 동역학 및 활성을 모티터링하는 분석 판독 양상은 바람직하게 (i) 대사 활성, 바람직하게는 알라마 블루(Alamar Blue)(등록상표), 유세포 분석, 데옥시리보핵산(DNA) 함량, 단백질 정량화, 세포 계수, 영상 기반 분석, 유전자 발현 수준, 질량 분광분석법, 표지 기반 측정(예컨대, 리포터 유전자 기술, 공명 에너지 전이, 단백질-분절- 또는 분할- 상보성 분석, 또는 무표지 기반 측정(예컨대, 전기적 바이오센서/임피던스 시스템, 광학 바이오센서 시스템, 표면 플라스몬 공명 시스템, 음향 바이오센서 시스템, 및 열량 측정, 전기적 활성에서의 변화를 활용하는 시스템 중 임의의 것, 또는 (ii) 상기 언급한 모니터링 분석법 중 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다. 세포 증식의 모니터링은 세포 형상 및 구조에 미치는 약물-유도 효과에 대한 직접적인 정보를 제공한다.
다른 생리학적 및 생물학적 특징(예를 들어, 저산소증 및/또는 혈관 신생 마커를 결정하는 분석 판독 양상은 바람직하게 (i) 리보핵산(RNA) 수준, 단백질 발현 수준, 질량 분광분석법, 면역조직화학, 영상 기반 분석, 프로테오믹스 방법의 선택된 군 중 임의의 것 또는 (ii) 상기 언급한 모니터링 분석법 중 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다.
적용된 약물 물질의 최대 허용 용량 또는 농도는 주어진 세포 및 세포 유형에 대하여 결정될 수 있다. 세포, 세포 유형 또는 조직의 허용된 약물 용량의 결정은, 이환된 세포, 바람직하게는 암 세포를 표적으로 할 때, 적용되는 약물 용량의 조정을 허용한다.
적용되는 약물 물질의 최저 유효 용량은 주어진 세포 및 세포 유형에 대하여 결정될 수 있다. 세포, 세포 유형 또는 조직의 최저 유효 용량의 결정은, 이환된 세포, 바람직하게는 암 세포를 표적으로 할 때, 적용되는 약물 용량의 조정을 허용한다.
본 발명의 다른 목적은 (i) 이환된 세포를 처치 또는 사멸시키는 것, 건강한 세포를 지원하는 것 및 건강한 세포가 약물 처치에 의해 질환 상태로 들어가는 것을 유도하는 것 또는 (ii) 세포의 재프로그래밍 및/또는 분화를 모니터링하는 방법의 용도를 제공하는 것이다.
적용되는 약물 물질에 대하여 줄기 세포 또는 전구 세포로 분화되는 세포의 재프로그래밍은 (i) 대사 활성, 바람직하게는 알라마 블루(등록상표), 유세포 분석, 데옥시리보핵산(DNA) 함량, 단백질 정량화, 세포 계수, 영상 기반 분석, 유전자 발현 수준, 질량 분광분석법, 표지 기반 측정(예컨대, 리포터 유전자 기술, 공명 에너지 전이, 단백질-분절- 또는 분할- 상보성 분석, 또는 무표지 기반 측정(예컨대, 전기적 바이오센서/임피던스 시스템, 광학 바이오센서 시스템, 표면 플라스몬 공명 시스템, 음향 바이오센서 시스템, 및 열량 측정, 전기적 활성에서의 변화를 활용하는 시스템 중 임의의 것, 또는 (ii) 상기 언급한 모니터링 분석법 중 임의의 조합에 의해 분석될 수 있다. 분화된 세포는 임의의 세포, 세포 유형, 세포 배양 유래 세포 또는 특정 조직으로부터 유래된 세포일 수 있다. 여기서, 적용된 약물 물질은 재프로그래밍 과정을 촉발시킬 수 있다.
상기 방법은 (i) 알라마 블루(등록상표), 유세포 분석, 저산소 증 및 혈관 신생 마커를 사용하는 대사 활성, 리보핵산(RNA) 수준, 단백질 발현 수준, 질량 분광분석법, DNA 함량, 단백질 정량화, 세포 계수, 영상 기반 분석, 및 면역조직화학 중 임의의 것, 또는 (ii) 상기 언급한 모니터링 분석법 중 임의의 조합을 포함하는, 세포 세포 성장 동역학 및 활성에 따라서 적용되는 약물 물질에 대하여 분화된 세포로 줄기 세포의 분화를 분석하는 데 사용될 수 있다. 여기서, 적용된 약물 물질은 분화 과정을 촉발시킬 수 있다.
본 발명의 추가 양태 및 상세한 내용은 하기에 제공된 도면 및 실시예로부터 명확하게 될 것이다:
도 1: 3차원 매트릭스에서 세포 콜로니 프로필과 결정암 세포(HCT 116)의 저산소 상태를 나타내는 그래프 및 이미지;
도 2: 3차원 생리학적 미세환경에서뿐만 아니라 종래 2차원 단층 배양물에 대한 약물 처치 스케줄의 결정을 나타내는 도식 표현;
도 3: 도 2에서 결정된 약물 처치 스케줄을 사용하는 약물의 2차원 스크리닝 대 3차원 스크리닝을 비교하는 그래프;
도 4: "초기 단계" 처치 및 "말기 단계" 처치 후 용량-의존성 약물 효능 프로필의 결정을 나타내는 그래프 및 이미지;
도 5: 처치 종료 직후 및 무약물 기간 직후 측정된 약물 활성의 효능을 비교하는 그래프;
도 6: 3차원 환경 및 종래 2D 세포 배양 모델에서 성장된 HCT 116 세포의 콜로니에 대한 5-플루오로유라실 약물 효능을 요약한 표;
도 7: 결장암 세포(HCT 116)의 2차원 성장을 나타내는 그래프;
도 8: 3차원 환경에서 결장암, 췌장암 및 난소암 세포의 저산소증 마커의 각각의 성장 및 유전자 발현 프로필의 비교를 나타내는 그래프 및 이미지;
도 9: 독립적인 처치 스케줄을 이용하는 2차원 및 3차원 세포 배양에 대한 성장 프로필을 나타내는 그래프;
도 10: 젬시타빈으로 처치한 췌장암 세포를 나타내는 그래프: 처치 종료 직후, 및 무약물 회복 기간의 4일 및 7일 후 약물 활성을 측정하는 비교.
도 1은 약물 처치없는 3차원 생리학적 미세환경에서 결장암 세포(HCT 116)의 성장 프로필을 나타낸다. a)에서 세포는 단일 세포로서 캡슐화될 때, 작은 종양을 모방하는 세포 또는 암 회전타원체의 콜로니로서 성장한다. 회전타원체 크기는 시간 경과에 따라서 증가한다. 왼쪽 패널은 상이한 시점에서 형성된 회전타원체 크기의 분포를 정량화하는 히스토그램으로서 나타낸 영상 기반 분석 결과를 나타낸다. 암 세포의 회전타원체 직경 크기는 성장 제4일에 35㎛에서 제21일에 155㎛로 증가한다. 오른쪽 패널은 형광 칼세인 기반 살아있는 성장하는 암 세포의 염색 이미지를 나타낸다. 3차원 매트릭스 중 암 세포 회전타원체의 성장 동역학은 b)에 나타나 있다. 알라마 블루(등록상표)에 의한 대사 활성 및 유세포 분석에 의한 세포 계수가 도시되어 있으며, 둘 다 초기의 신속하고 이후의 편형화 세포 성장 동역학에 의해 특징지어진 유사한 세포 성장 프로필을 나타내는 최적화된 분석 조건에서 실행되었다. c)에서 세포 회전타원체는 살아있는 세포에 대하여 칼세인(녹색)으로 염색되었고 저산소증 상태의 세포에 대하여 하이폭시센스(적색)으로 염색되었다. 이러한 암 세포주에서, 적색에서(보통 세포 회전타원체의 중심에서) 확인된 저산소증은 배양물 중에서 제14일 근처부터 관찰되었다. 그레이 스케일에서의 시각화를 위하여, 적색 염색을 나타내는 회전타원체는 점선 원으로 나타나 있다. 적색 염색은 회전타원체의 중심에서 가장 강하다.
암 세포의 프로파일링은 상이한 성장 시점에서 암 세포 회전타원체의 생리학적 특징(예를 들어, 저산소증)을 식별하고 조사하는 것을 허용하므로, 암 세포의 프로파일링은 본 발명에서 핵심 단계이다. 중요하게도, 이들 특징은 종양 조직의 기원에 강하게 의존한다(도 8에 나타낸 바와 같음). 추가적으로, 종양에 대한 약물 효능은 종양 생리 기능의 특성에 강하게 의존한다(도 3 및 4에 나타낸 바와 같음). 본 발명에서 암 세포 회전타원체의 프로파일링된 생리학적 특징에 기반하여, 약물 스크리닝을 위한 처치 시점이 그 후로 조정되어 생체 내에서 종양의 상이한 단계를 모방할 수 있다. 세포 증식의 상이한 단계 및 생리학적 특징(예를 들어, 저산소 상태)을 나타내는 겔 매트릭스에서 회전타원체는 도 1 및 8에 설명되어 있다.
도 2는 프로파일링된 세포 성장 및 암의 생리학적 특징을 기반으로 하여 약물 처치 스케줄 및 판독 시점의 결정을 나타낸다. 3차원 매트릭스에서 성장된 세포에 대한 "초기 단계" 및 "말기 단계" 약물 처치를 포함하는 예가 주어져 있다. 상이한 암 단계의 상태가 도 1에서와 같이 확인되고 프로파일링 분석으로부터 유래되어 있으며, 따라서 약물 스크리닝에 대한 스케줄이 결정된다. 여기서, 3차원 매트릭스에서 배양된 세포에 대한 상이한 암 단계가 "초기 단계" 및 "말기 단계" 암 처치로서 결정된다.
"초기 단계"는 판독을 위한 2개의 시점을 포함한다. 제7일의 제1 시점은 약물 처치 말인 반면, 제11의 제2 시점은 무약물 회복 단계 이후이다. "말기 단계"는 판독을 위한 2개의 시점을 포함한다. 제17일의 제1 시점은 제2("초기 단계"와 독립적임) 약물 처치 단계의 말이다. 제21일의 제2 시점은 무약물 회복 단계 이후이다. 추가적인 시점에서의 측정은 처치의 개시 전 및/또는 상이한 무약물 회복 단계 후에 실행될 수 있다.
제4일 내지 제7일의 "초기 단계"는 직경이 35㎛인 작은 회전타원체를 나타내며, 매우 증식성이 높은 세포(도 9에 나타냄) 및 무 저산소 조건은 저산소 마커 발현 또는 다른 생화학적 수단(도 1c)의 측정으로 결정되었다. 반대로 "말기 단계"는 직경이 155㎛인 더 큰 회전타원체의 존재, 낮은 세포 증식(도 9에 나타냄), 및 저산소 조건의 존재(도 1c)를 설명한다. 두 가지 경우에서, 젬시타빈을 이용하여 관찰된 경우로서 판독은 처치 종료 직후에 실행되어 즉각적인 약물 효능을 테스트하고, 제4일 무약물 기간 후에 "소형 종양" 성장의 재발 및/또는 지연된 약물 효능을 테스트한다(도 10).
참고인 2차원 분석을 위하여, 세포는 보통 제1일 내지 제4일의 대수 증식 단계 내에서 약물을 이용하여 테스트된다(도 9).
도 3은 직장암 HCT 116 세포의 콜로니에 대하여 도 2에 기재된 바와 같은 처치 스케줄을 사용한 약물 스크리닝 캠페인을 나타낸다. "히트(Hit)" 생성에 대한 예로서 상업적으로 이용가능한 약물 라이브러리(프레스트윅(Prestwick))로부터 약물의 선택이 사용된다. A)에서 대사 판독(알라마블루(등록상표))에 의해 측정된 암 세포에 대한 60종의 약물의 효과가 나타나 있다. 화합물은 10μM의 농도에서 3번 테스트된다. 평균 및 표준 편차가 여기에 나타나 있다. 약물은 3번의 결과가 HIT 임계값(음성 대조군의 표준 편자의 평균 +/- 3배. 무약물 DMSO 비히클을 이용한 조건은 음성 대조군으로서 사용됨)을 초과하는 경우에만 "히트"로서 간주된다. 상부 차트는 2차원에서 성장하고 3차원 매트릭스에서 포매된 암 세포의 조기 처치의 헤드 투 헤드 비교를 나타내며, 하부 차트는 3차원 매트릭스에서 포매된 세포의 "초기 단계" 및 "말기 단계" 처치의 비교를 나타낸다. "초기 단계" 및 "말기 단계" 처치를 이용하여 위양성 약물(false-positive drug)은 히트의 수를 감소시키는 것을 효과적으로 피하는 것을 나타낸다.
도 3b에서 세포 콜로니, 특히 "조기 단계" 및 "말기 단계" 처치 직후 측정된 암 회전타원체의 직경 크기의 분포를 정량화하는 영상 기반 분석은 10μM의 약물 농도에서 도 3a로부터의 약물의 선택의 예로서 나타나 있다. "초기 단계" 및 "말기 단계"의 말에 대사 판독을 사용하여 결정된 바와 같이 실선 곡선은 "히트"에 해당하고, 점선 곡선은 "히트가 아님"이다(양성 대조군: 황산구리로 처리한 세포; 음성 대조군: DMSO로 처리한 세포).
도 4에서, 결장암 HCT 116 세포의 콜로니에 대하여 도 2, 예로서 5-플루오로유라실(5-FU)에서 선택된 "히트"의 알라마 블루(등록상표) 판독으로서 반수 최대 억제 농도(IC50)의 결정이 나타나 있다. 판독은 3차원 매트릭스에서 세포의 "초기 단계" 및 "말기 단계" 처리 직후 실행하였다. 용량-의존성 약물 효능이 도 4a에 나타나 있다. 화살표는 "초기"에서 "말기" 처치의 더 높은 IC50 농도로의 이동을 나타낸다. 이는 5-FU가 말기 단계 암의 처치에서 덜 강력한 것을 나타내고, 도 3에서와 같이 "말기 단계" 약물 스크리닝에서 이 약물에 대하여 얻어진 "히트가 없음"을 확인한다. 2차원 기준 분석을 이용하여 얻은 IC50 곡선은 종종 본 발명(3 차원)의 "초기 단계" 처치 상태와 유사하다. 이는 또한 도 3a에서 분석 모델을 이용하여 관찰된 대부분의 "히트"의 약물 스크리닝 상관관계에 나타나 있다(상부 패널). 상이한 반복 실험에서 결정된 IC50 농도의 요약은 도 6에 부여되어 있다. 도 4b에서 선택된 약물 농도, 즉 IC50 및 1mM에서 "초기 단계" 및 "말기 단계" 후 3차원 매트릭스에서 암 세포 회전타원체의 영상 기반 분석 결과가 나타나 있다. 상부 패널은 회전타원체 크기 분포를 나타내고, 하부 패널은 해당하는 칼세인 기반 형광 이미지를 나타낸다. 대사 판독 분석결과에서 또한 관찰되는 바와 같이 5-FU는 "초기 단계" 처리에서 회전타원체 성장의 강한 억제를 나타내었으나, "말기 단계" 처리 후에는 그렇지 않았다(도 3a 및 도 4a). 이러한 결과는, 병원에서 결장암을 처치하는 데 단일 작용제로서 더 이상 이용되지 않는 5-FU의 임상사용과 비슷하다.
도 5는 처치 말 직후 그리고 무약물 기간("회복"으로 명명됨) 직후 약물 효능의 비교를 나타낸다. 여기서, 결장암 세포의 콜로니에 대한 5-FU 처치가 예로서 주어져 있다. "초기 단계"(왼쪽 패널) 및 "말기 단계" 처리 스케줄(오른쪽 패널)은 도 2에 기재된 처리 스케줄에 따라서 4일의 무약물 회복 기간 전 및 후에 측정되었다. IC50 곡선 및 농도에서 무약물 기간 전 및 후에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 6). 흥미롭게도, 췌장으로부터 유래한 다른 암 세포 및 젬시타빈 약물을 이용하면 무약물 회복 기간은 본 발명을 사용하는 약물 효능의 검출에 있어서 중요하였다(도 10). 본 발명은, 심지어 적용된 약물의 효과가 무약물 기간 후에 검출가능할 때 조차도 약물의 식별을 가능하게 한다.
도 6은 본 발명을 사용하여 결정된 약물 5-FU의 IC50 농도 및 결장암 세포를 이용한 참조 2차원 세포 배양 분석의 개요를 나타낸다. 3차원 반복 실험의 결과가 나타나 있다.
암 세포는 세포 공급사 및 과학적 간행물에 의해 기재된 바와 같이 조직 배양 플라스틱 상에서 2차원 단층으로서 정상적으로 성장한다.
도 7에 결장암 HCT 116 세포의 2차원 환경에서의 성장이 나타나 있다. 컨플루언스에 도달할 때, 전체 조직 배양 플라스틱 표면은 세포로 덮이고, 보통 공간 제한으로 인하여 세포는 성장을 멈춘다. 불리하게도, 시험관내 상황은 생리학적인 생체내 상태를 적절하게 반영하지 않는다(예를 들어 2차원 방법의 세포층 대 생체내 3차원 세포 응집 또는 3차원 배양 방법; 모든 세포는 2차원 시험관내에서 영양소 및 산소 공급에 노출되는데 대해서. 모든 세포는 생체내 회전타원체 내부에서 또는 3차원 배양 방법에서 세포에 대하여 낮은 영양소 및 산소 조건).
도 8에서 상이한 암 유형의 세포는, 특히 세포 응집을 기반으로 하는 다른 3차원 세포 배양 방법과 대조적으로 3차원 환경에서 단일 세포로부터 성장할 때 핵심적인 생체내 생리학적 특징을 반영하는 콜로니 성장 및 회전타원체 형성에서 유의한 차이점을 나타내며, 여기서 회전타원체 크기 및 성장은 응집된 세포의 수에 의존한다. 왼쪽에 있는 세포의 이미지는 제14일의 것이다. 3가지 암 세포주, 즉 결장 HCT 116, 췌장 Panc-1 및 난소암 세포를 비교하였다. 3차원 매트릭스에서 제14일에 성장한 회전타원체의 칼세인 기반 형광 이미지가 a)의 왼쪽에 나타나 있다. 오른쪽에, 제14일에 암 세포에 의해 형성된 회전타원체 크기의 분포를 정량화하는 히스토그램으로서 나타낸 영상 기반 분석 결과가 나타나 있다. 일반적으로, 난소암 세포가 가장 큰 암 세포 회전타원체를 형성하였고, 췌장 세포는 테스트된 암 세포의 세트로부터 가장 작은 암 세포 회전타원체를 형성하였으며, 이는 생체내 종양 성장과 비슷하다. b)에서, 상이한 암 세포의 회전타원체 성장 곡선은 알라마 블루(등록상표) 대사 활성 형광 판독을 사용하여 결정하였다. 난소 및 결장암 세포는 제11일과 제15일 사이에, 췌장 암 세포는 제20일에 성장 고원(plateau)에 도달하였다. 난소 및 결장암 세포 콜로니 형성은 췌장암 세포와 비교하여 조기에 평탄화하면서 더 빠른 초기 성장 동역학을 나타내었다.
도 8c)에서, 시간 경과에 따른 유전자 발현에 대하여 제시된 바와 같은 본 발명의 3차원 환경에서 성장한 3가지 세포주의 비교가 전형적으로 저산소증 조건에서 관찰되는 마커에 대하여 나타나 있다. 비교된 세포주는 결장암 세포(HCT 116), 췌장암 세포(Panc-1), 및 난소암 세포(A2780)이다. 테스트된 저산소증 마커는 HIF-1a(Hypoxia Inducible Factor 1 alpha(저산소증 유도 인자 1 알파); 저산소증의 핵심 조절자); VEGFA(Vascular Endothelial Growth Factor A(혈관 표피 성장 인자 A), 이는 혈관신생에 연루되어 있음); CAIX(Carbonic Anhydrase IX(탄산무수화효소 IX), 이는 pH 조절에 연루되어 있음); GLUT-1(Glucose Transporter 1(글루코스 수송체 1), 이는 에너지 생성에 연루되어 있음); LDHA(Lactate Dehydrogenase A(젖산 탈수소 효소 A), 이는 에너지 생성에 연루되어 있음); BNIP3(BCL-2/adenovirus-EIB-19-kDa-interacting protein 3(BCL-2/아데노바이러스-EIB-19-kDa-상호작용 단백질 3)), 이는 아포토시스에 연루되어 있음)이다. 유전자 수준에서 테스트된 3가지 암 세포주(시간 경과에 따른 유전자 발현 프로필)는 유의하게 상이한 거동을 나타낸다. HIF-1a 유전자 발현은 시간 경과에 따라서 A2780 및 HCT 116에서 기본 수준에 남아있지만, Panc-1 세포에서는 시간 경과에 따라서 상향조절된다. VEGFA 발현은 A2780 세포에 대하여 일정하고 HCT 116 및 Panc-1 세포에서 최대 6배까지 상향조절된다. CAIX 발현은 시간 경과에 따라서 증가하지만, 발현의 규모는 테스트된 세포주 사이에서 대폭 차이가 있다. 가장 강력한 CAIX 유전자 발현이 A2780 세포에서 관찰된 다음(약 4000배 증가), HCT 116(약 400 내지 500배 증가) 및 Panc-1(약 60 내지 80배 증가)에서 관찰된다. BNIP3, GLUT-1 및 LDHA의 유전자 발현 프로필은 시간 경과에 따라서 유전자 발현을 증가시키는 경향을 공유한다. 암 세포의 유전자 발현 프로필은 상이한 성장 시점에서 암 세포 회전타원체의 생리학적 특징의 식별 및 조사를 허용한다. 도 8a), b) 및 c)는 이들 생리학적 특징이 종양 세포의 기온 및/또는 세포 성장 단계에 강하게 의존함을 설명한다. 도 8c)는 정량적인 데이터를 제공하며, 상기 데이터는 암 세포의 초기 단계 및 말기 단계를 확인하여 관련 단계에서 제시된 것과 같은 약물 스크리닝을 실행하는 것의 중요성을 뒷받침한다.
도 9에서, 암 세포 HCT 116 성장 프로필 내에서 처치 스케줄은 3차원 생리학적 환경에 포매된 세포를 사용하는 본 발명에 대하여 나타나 있다(상부 패널). 비교를 위하여, 2차원 참조 분석(하부 패널)이 나타나 있다. 2차원 참조 분석은 단지 제1일 내지 제4일의 초기 성장 단계를 포괄한다. 본 발명에서와 같이 약물 처치의 분할은 "3차원 초기 처치 기간"(제4일 내지 제7일) 및 "3차원 말기 처치 기간"(제14일 내지 제21일)을 포괄한다. 3차원 초기 처치 기간은 비교적 작은 회전타원체, 무 저산소증 상태 및 높은 증식을 나타내는 회전타원체의 초기 성장 단계에 의해 특징지어지고, 3차원 말기 처치 기간은 큰 회전타원체 크기, 저산소증 상태 및 정지된 세포 증식을 나타내는 정지 단계에 의해 특징지어진다. 이는 생체내 종양 성장과 비슷하다.
도 10은 젬시타빈으로 처리된 췌장 Panc-1 암 세포를 나타낸다. 3차원 매트릭스에서 췌장 암 세포 배양물 상에 젬시타빈을 이용한 "말기 단계" 처리에 대한 용량-의존적 효능 프로필은 제4일 내지 제7일의 무약물 회복 기간 전 및 후에 알라마 블루(등록상표) 판독에 따라서 측정하였다. 처리 직후 측정된 2차원 참조 분석 및 3차원 분석으로부터의 판독에 따라서, 젬시타빈은 활성적이지 않은 것으로 나타났다. 그러나, 측정이 무약물 회복 기간 후에 실행되었을 때, 젬시타빈은 3차원 환경에서 성장한 암 세포의 강력한 세포 성장 억제제인 것으로 관찰되었다. 젬시타빈은 병원에서 췌장암을 처치하는 데 단일 작용제로서 사용된다. 본 발명을 이용하여 특정 환경, 예를 들어 저산소 조건 또는 정지 세포 증식 하에서 효과적이고/효과적이며 세포에 대하여 지연된 효능을 나타내는 강력한 약물 물질이 확인된다.

Claims (13)

  1. 세포 기반 스크리닝 분석 방법으로서,
    - 배양 환경에서 세포 집단을 배양하는 단계,
    - 세포 유형, 세포의 생리학적 특징, 형성된 조직의 생리학적 특징, 약물 물질의 작용 방식 및 배양 환경 중 적어도 하나에 의존적으로 적어도 2개의 모니터링 시점을 한정하는 단계,
    - 적어도 1개의 처리 시점에서 약물 물질을 상기 배양된 세포에 적용하는 단계,
    - 적어도 상기 2개의 모니터링 시점에서 세포 또는 형성된 조직에 대한 상기 약물 물질의 효과를 모니터링하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 모니터링 시점은,
    - 특정 세포의 초기 단계를 위한 적절한 시점, 바람직하게는 상기 환경에서 세포를 배양한 후 제4일 내지 제7일, 및
    - 말기 단계에 대한 시점, 바람직하게는 상기 환경에서 그리고 특정 생리학적 특징, 예를 들어, 저산소증 또는 세포 성장 동역학의 변화의 부재 또는 존재에 의해 한정된 시점에서 세포를 배양한 후 14일 내지 17일, 및
    - 무약물 회복 단계 후 약물 효능을 측정하기 위한 적절한 시점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 증식의 모니터링은 상기 약물의 적용 종료 후 1일 내지 7일 이상 계속되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는, 우선적으로 비닐 설폰 말단기를 지니는 다분지 폴리에틸렌 글라이콜과 3차원 매트릭스에 중합을 가능하게 하는 적어도 2개의 시스테인 또는 일반적으로 티올기를 포함하는 펩타이드를 포함하는 구조 화합물과 링커 화합물을 포함하는 환경에서 배양되는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 3차원 환경은 캡슐화된 세포의 3차원 성장, 우선적으로는 회전타원체 성장을 촉진하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 3차원 환경은 겔 주조 장치 또는 표준 세포-배양 장치, 바람직하게는 384-웰 플레이트와 같은 용기에서 주조되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 임의의 종류의 세포, 세포주, 분화된 세포, 및 결장암 세포, 췌장암 세포 및 난소암 세포와 같은 암 세포의 군에서 선택되는 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 성장이 상기 약물의 처리에 의해 촉진되는 세포인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 물질은,
    (i) 임의의 화학, 천연 또는 합성 물질 및 공지된 약물 스크린의 임의의 물질; 또는
    (ii) i)에 따른 물질들의 임의의 조합;
    (iii) 용액 중 또는 임의의 담체, 나노입자 또는 전달 장치와 조합된 i) 또는 ii)에 따른 임의의 물질(들)
    의 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 특징의 모니터링은,
    대사 활성, 및/또는
    유세포 분석, 및/또는
    DNA 함량, 및/또는
    단백질 정량화, 및/또는
    세포 계수, 및/또는
    영상 기반 분석, 및/또는
    저산소 및 혈관신생 마커의 수준, 및/또는
    리보핵산(RNA) 수준, 및/또는
    단백질 발현 수준, 및/또는
    질량 분광분석법, 및/또는
    면역조직화학
    에 의해 분석되는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 물질의 최대 허용 용량은 주어진 세포 유형에 대하여 결정되는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 물질의 최저 유효량은 주어진 세포 유형에 대하여 결정되는 방법.
  13. (i) 적용된 물질에 대하여 분화된 세포의 재프로그래밍 및
    (ii) 적용된 물질에 대하여 줄기 세포의 분화
    를 평가하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법의 용도.
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