JP2002501609A - 化学治療剤を含む活性薬剤の正確な効能アッセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 特定の患者に関する効能に付いて、複数の候補となる治療薬剤または化学治療薬剤をスクリーニングする改善されたシステムであって、このシステムでは、特定の患者から得たカルチャー細胞に対する最適処置または薬剤を客観的に特定する目的のために、患者からの組織サンプルを採取し、培養しかつ複数の処理および／または治療薬剤に別々に暴露する。細胞サンプル調製などの特定の方法的改新は、本発明の方法を、治療的にだけでなく、実用的に有用とする。一つの特に重要な組織サンプル調製技術は、初期組織カルチャー単層を調製するために、酵素的に分離した細胞を懸濁または調製することではなく、組織サンプルの凝集性多細胞粒子を初期に調製することである。細胞の均一なサンプルを広範な種類の活性薬剤（およびその濃度）に暴露することで、患者を処置するために最も効能のある薬剤および濃度が決定できる。

Description

【発明の詳細な説明】 化学治療剤を含む活性薬剤の正確な効能アッセイ方法 発明の分野 本発明は、薬剤による治療を指示された個々の患者における潜在的効能を予想 するための、化学治療薬を含む活性薬剤のスクリーニングまたは試験に関する。 序論 合衆国では、化学治療剤を含む全ての活性薬剤は、薬剤的使用のための承認に 先立って、その効果および安全性に付いて厳密な試験に付される。効能の評価方 法は、与えられた処置方法および／または活性薬剤に関する二重盲検法による大 集団の入念な検査を、それに伴う得られたデータの統計上の解明とともに含んで いるが、これらの結論が全体としての患者集団について、一般化されることは不 可避である。しかしながら、多くの薬理学上の学問、特に化学治療の分野におい ては、個々の患者の治療結果が、−−個々の患者の損傷についての−−一般化さ れたデータと一致しない可能性がある。化学治療剤を非限定的に包含する活性薬 剤の治療能力を、治療に先立って、与えられた個々の患者についての効能に関し て評価する方法への必要性が長い間認識されていた。 従来技術のアッセイが既に存在しており、これは治療的投与のための最適な選 択を評価する目的で、複数の活性薬剤に様々なタイプの悪性組織を暴露するもの である。例えば、Kruczynski，A.，et al，“Evidence of a direct relationsh ip between the increase in the in vitro passage number of human non-smal l-cell-lung cancer primocultures and their chemosensitivity”，Anticance r Research，vol．13，no．2，pp．507-513(1993)では、非小細胞肺 癌の化学的敏感性が、インビボ移植片、インビトロプライモカルチャー（primoc ulture）および市販の長期癌セルラインにおいて研究されている。化学的敏感性 の増加が立証され、問題の細胞における形態的変化と相互に関係していた。時々 、動物モデル悪性細胞および／または樹立細胞カルチャーが、期待される治療薬 剤を用いて試験されている(例えば、Arnold,J.T.,“Evaluation of chemopreven tive agents in different mechanistic classes using a rat tracheal epithe lial cell culture transformation assey”,Cancer Res.,vol.55，no．3，pp． 537-543(1995)参照)。 実際の患者の細胞を用いて、個々の患者に焦点を合わせたインビトロアッセイ を形成した場合、典型的な従来技術法では、細胞を収穫（生検）し、トリプシン 処理（酵素トリプシンを用いて結合組織を消化）して、望ましい組織カルチャー 形態に変換させるのに適した細胞サスペンジョンが作成される。これら技術から 結果として得られたインビトロ組織カルチャー細胞コレクションでは、一般的に 、それらの起源となる癌または他の細胞生検の化学的な敏感性を正確に模倣する 能力がないことで悩まされる。標準的なクローンニングおよび組織カルチャー技 術は、更に、患者毎のアッセイセットで使用するためには、過度に複雑で高価で ある。したがって、薬剤評価の目的のために細胞カルチャーを提供し、簡単な調 製の後に、細胞カルチャーをそれらのインビボでの反応性と等価な様式で反応さ せ、薬剤または化学治療薬剤を、スクリーニングを指示された患者に関してスク リーニングすることを可能とする組織カルチャー調製技術に対する要請が残され ている。 発明の概要 この必要に合致させるために、本発明は、特定の患者に関する効能に付いて、 複数の候補となる治療薬剤または化学治療薬剤をスクリーニングする改善された システムであって、このシステムでは、患者から得たカルチャー細胞に対する最 適処置を客観的に特定する目的のために、患者からの組織サンプルを採取し、培 養しかつ複数の処理および／または治療薬剤に別々に暴露する。細胞サンプル調 製などの特定の方法的改新は、本発明の方法を、治療的にだけでなく、実用的に 有用とする。一つの特に重要な組織サンプル調製技術は、初期組織カルチャー単 層（monolayer）を調製するために、酵素的に分離した細胞を懸濁または調製す ることではなく、組織サンプルの凝集性多細胞粒子を初期に調製することである 。悪性細胞のカルチャーに関しては(理論的に束縛されるつもりはないが)、起源 となる組織の多細胞粒子内に悪性細胞を維持することで、悪性細胞そのものの成 長が、懸濁癌細胞をカルチャーで成長させた場合に発生する繊維芽細胞または他 の細胞の過剰成長とは反対に、促進されると考えられている。したがって、細胞 の実用的単層を形成して、複数の処置および／または薬剤の意味あるスクリーニ ングを行うことができる。アッセイを始めるときを確かめ、かつカルチャー細胞 の成長速度を決定するために細胞の成長をモニターし、これによって薬剤添加の 順序およびタイミングをもモニターしかつ最適化する。細胞の均一なサンプルを 広範な種類の活性薬剤（およびその濃度）に暴露することで、最も効能のある薬 剤が決定できる。癌処置に関する処置のためには、与えられた抗癌剤の急性毒性 効果およびより長期間での阻害効果の両方が調査される２段アッセイが意図され ている。 発明の詳細な説明 本発明は、特定の患者に関する効能に付いて、複数の候補となる治療薬剤ま たは化学治療薬剤をスクリーニングするシステムであって、このシステムでは、 最適処置または薬剤を客観的に特定する目的のために、患者からの組織サンプル を採取し、かつ複数の処理および／または治療薬剤に別々に暴露する。細胞サン プル調製などの特定の方法的改新は、本発明の方法を、治療的にだけでなく、実 用的に有用とする。一つの特に重要な組織サンプル調製技術は、初期組織カルチ ャー単層（monolayer）を調製するために、酵素的に分離した細胞を懸濁または 調製することではなく、組織サンプルの凝集性多細胞粒子（外植片）を初期に調 製することである。細胞成長、および薬剤添加の順序よびタイミングをモニター し、かつ最適化する。 本発明の重要な適用としては、悪性サンプルが生検された患者からの悪性細胞 の組織カルチャー調製物に対する化学治療薬剤および他の抗腫瘍性治療をスクリ ーニングすることである。本発明のシステムを用いてスクリーニングできる関連 抗癌治療は、放射線治療および、免疫治療抗癌剤ばかりでなく、放射線の毒性を 促進する薬剤の両方である。非悪性症候群のための処置または治療薬剤に付いて のスクリーニング方法も本発明の範囲内に包含されるが、乾癬などの過増殖症候 群に対する薬剤、または創傷治癒薬剤をも制限なく包含する。本発明の組織カル チャーシステムでは細胞間生体化学機能を促進または抑制することを意図された 薬剤も試験できるため、本発明の効能アッセイは細胞成長を加速（治癒）または 減速（抗癌、抗過増殖）する活性薬剤のスクリーニングのみに限定されない。例 えば、酵素、神経伝達物質または他の生体化合物の形成またはブロッキングが、 患者を処置するに先立つ本発明のアッセイ方法でスクリーニングできる。 患者を癌が存在するために処置するためには、本発明の好ましい態様では、非 壊死性かつ非汚染性の組織＞１００mgの癌生検が、当該技術分野で公知の好適な 生検または手術手法の何れかで、患者から採取される。生検サンプル調製は、一 般的には、使用の少なくとも２０分前に作動させるべき層流フード（Laminar Fl ow Hood）下で、以下のように進められる。サンプル調製を始める前に、フード の表面を試薬級エタノールでふき取る。次いで積出し容器から、滅菌条件下で、 癌を取り出し、滅菌したはさみを使用して細かく切断する。もし試料が既に細か く切断されて到着した場合には、個々の癌切片を４つのグループに分けなければ ならない。次いで、滅菌ピンセットを用いて、四分の一非分割組織を３mlの滅菌 成長培養液（17%仔ウシ血清と標準量のペニシリンおよびストレプトマイシンと を含む標準F-10培養液）中に移し、２つの滅菌小刀を用いて、はさみのような動 きまたは機械的にそれと等価な手法で、あるいは自動化された対抗する門歯型刃 で、規則正しく切断する。この横方向切断（cross-cutting）動作は、得られる 癌多細胞粒子の切断縁部をなめらかにする技術であるため、重要である。必ずし も必要ではないが、好ましくは、癌粒子の各々は１mm³の測定値を有する。各四 分の一癌を切断した後、粒子を、滅菌パスツールピペットを用いて培養フラスコ に導入する(T-25フラスコ毎に９個の外植片またはT-75フラスコ毎に２０個の粒 子)。次いで、各々のフラスコを患者のコード、外植データまたは他の識別デー タで標識する。外植片は、３７℃インキュベータ内での５〜１０分間の初期倒立 インキュベーションでは、フラスコの底表面にわたって均一に分布していなけれ ばならず、次いで約５〜１０ml滅菌成長培養液を加え、通常の非倒立位置で更に インキュベートする。フラスコを、３５℃の非CO₂インキュベータ内に置く。フ ラスコは、成長および汚染に付いて毎日チェックしなければならない。数週間に わたって、５mlの成長 培養液を毎週除去及び入れ替えすると、外植片の細胞成長が促進されて単層とな る。悪性細胞のカルチャーに関しては(理論的に束縛されるつもりはないが)、起 源となる組織の多細胞粒子内に悪性細胞を維持することで、悪性細胞そのものの 成長が、懸濁癌細胞をカルチャーで成長させた場合に発生する傾向にある繊維芽 細胞（または他の望まれない細胞）の過剰成長とは反対に、促進されると考えら れている。 このような手順を用いて細胞単層カルチャーを形成することで、組織サンプル からの悪性細胞の成長を最大とし、このようにして、試験すべき各種薬剤の化学 治療活性の組織カルチャーアッセイを最適化して確実なものとする。実際の悪性 細胞の促進された成長は、本発明の一観点にすぎないのであり、他の重要な特徴 は、一旦形成された単層の成長を調査するために用いられる成長速度モニターシ ステムである。一旦一次カルチャーおよびその誘導二次単層組織カルチャーが開 始されると、細胞の成長がモニターされ、化学治療アッセイを開始するときが確 かめられ、かつカルチャー細胞の成長速度が決定される。 細胞成長のモニターは、ある周期的基準で、細胞を殺傷および染色することな く、かつカルチャーフラスコからどの細胞も除去することなく、単層の細胞を計 数することで行われる。計数は、目視または自動的方法で、当該技術分野で公知 の見積もり方法（例えば、グリッド領域の数を乗じた、単一グリッドの代表的領 域における計数）を用いるか、または用いることなく行われる。次いで、周期的 計数からのデータは、成長速度を決定するのに用いられ、この成長速度は患者の インビトロでの同一細胞の成長速度と相似すると考え得るか、または考え得ない 。成長速度サイクルが立証された場合、例えば、次いである活 性薬剤の投与量が患者のためにあつらえられる。同様に、同一の成長速度が放射 線処理周期の評価に用いることができる。単層がフラスコ内で成長する間に行っ た成長速度決定を用いることで、本発明の方法では、血球計数法、流動細胞計数 法、または顕微鏡スライドおよび染色の使用を、それら全てに伴う労力および費 用とともに必要としないことは、特筆されるべきである。 単層成長速度のためのプロトコルでは、一般的に、位相差倒立顕微鏡を用いて 、３７℃（5%CO₂）インキュベータでインキュベートしたカルチャーフラスコを 調査する。フラスコを位相差倒立顕微鏡に配置した場合、十個のフィールド（フ ラスコ固有のグリッド上の領域）を１０×対物レンズを用いて調査する。但し、 十個のフィールドは非接触の、または有意に互いに離間していなければならず、 それによって十個のフィールドがフラスコ全体の代表的サンプリングとなる。調 査された各フィールドに着いての細胞占有パーセンテージを記録し、これらパー センテージを平均することで細胞カルチャーにおける全体合流パーセントの見積 もりが与えられる。患者のサンプルが２または３、あるいはそれ以上のフラスコ に分けられている場合、患者サンプル全体に付いての平均細胞数が計算されるべ きである。計算された平均合流パーセントは、工程記録に記入され、時間にわた るデータ−−および成長曲線のプロット−−の編集を可能とする。単層カルチャ ーは、その写真を撮り、細胞形態および細胞成長パターンを立証することもでき る。適用可能な式は： である。従って、例としては、細胞により占有された領域の見積が30%であり かつフィールドの全領域が100%である場合、合流パーセントは30/100、または30 である。 上記プロトコルの非癌細胞への適用は直接的であり、一般的に等価な手法を構 成する。 カルチャー細胞を用いた活性薬剤のスクリーニングは、初期インキュベートフ ラスコでは行わず、一般的にはマイクロタイタープレートなどのプレートを用い て行われる。スクリーニング目的のために用いられる化学的敏感性アッセイの性 能は、与えられたウェルを通して均一な細胞分布を達成できることばかりでなく 、プレートおよび／または一連のプレートに再現可能な数の細胞を供給できるこ とに依存する。以下の手法は確実に、細胞を再現可能にフラスコからマイクロタ イタープレートに移動し、かつ各ウェルの表面にわたって均一に分布させる。 マイクロタイタープレートの調製における最初の工程は、勿論、上述したよう な単層の調製およびモニターである。以下のプロトコルは例示であり、当業者に とって明らかであるように改変の余地がある。細胞をカルチャーフラスコから取 り出し、細胞ペレットを遠心により調製する。次いで、単層から誘導された細胞 ペレットを５mlの成長培養液に懸濁し、６〜１０秒間振盪して円錐形試験管内で 混合する。その後、試験管を１０回前後に揺らす。円錐形試験管の中心からの36 μl滴をピペットで９６ウェルプレートの一つのウェルに分ける。次いで、新し いピペットを用いて36μlアリコートのトリパンブルー溶液を取り、同一のウェ ルに加え、二つの滴をピペットでの吸引を繰り返して混合する。 得られた混合物を、標準的光学顕微鏡を用いて調査するために、２つの血球計数 器チャンバーに分ける。細胞を、倍率１０×で、４つの血球計数器コードラント （quadrant）からの２つにおいて計数する。トリパンブルー染料を取り込まなか った細胞のみを計数する。この方法を第二計数チャンバーに付いても繰り返す。 このようにして、チャンバー毎の平均細胞数が決定される。公知の方法を用いて 、コードラント計数値をチェックし、記入し、10⁴倍して細胞／ml値を得、従っ て、そして残りの細胞アリコートを懸濁するのに必要な流動体（成長培養液）全 量を計算する。 培養液中の望ましい細胞濃度を決定した後、単層からの追加の細胞アリコート を、振動および揺らせることで成長培養液中に懸濁し、当該分野で公知のテラサ キディスペンサーにかける。調製された細胞懸濁液のアリコートを、当該分野で 公知のテラサキディスペンサー技術を用いたマイクロタイタープレートに供給す る。必要に応じて、単一の細胞懸濁液から複数のプレートを調製することができ る。次いで、プレートを滅菌された湿った綿ガーゼで覆い、当該分野で公知の手 段によって、インキュベータボックス内でインキュベートする。 マイクロタイタープレートを調製した後、細胞の活性薬剤への暴露が、以下の 例示的プロトコルに従って行われる。本発明に係るアッセイのこの部分の間に、 適当な量の特定活性薬剤を上述のように調製したマイクロタイタープレートに移 す。適用できる一般的プロトコルは、以下の通りである。各々のマイクロタイタ ープレートを、湿った綿ガーゼスポンジの覆いから取り外し、細胞付着について 顕微鏡で調査する。コントロール溶液をマイクロタイタプレートのグリッド内に おける輪郭を描いた列のウェルに分配し、試験すべき活性薬剤の 適当なアリコートを残りの列の残されたウェルに加える。通常、順次増加させた 濃度の試験すべき薬剤を、プレートの次第に大きくした番号の列に加える。次い で、プレートをガーゼで再度覆い、５%CO₂下、３７℃インキュベートボックス内 でインキュベートする。所定の暴露時間の後、プレートから覆いを取り外しかつ 薬剤を滅菌ガーゼで吸い取って除去した後に、このプレートを、Hank'sバランス 塩溶液で洗浄し、成長培養液で満たし次いで所定時間インキュベートボックス中 のインキュベータに置いた後、評価するために、プレートを固定および染色する ことができる。 固定および染色は、幾つかの適当な手法に従って行うことができ、したがって 以下は代表例である。インキュベートボックスからプレートを取り出した後、カ ルチャー培養液を流し出し、プレートをHank'sバランス塩溶液で満たす。繰り返 し（各々のときに撹拌しながら）満たした後、プレートを試薬級エタノールで２ 〜５秒間満たす。次いで、エタノールを流し出す。プレート毎に約５mlのギーム ザ染色液を用いて染色を行うが、この体積は臨界的ではなく、満たすことが終点 である。ギームザ染色液は、タイミングが染色強度に影響するため、決まって５ 分±３０秒間放置されるべきである。次いで、ギームザ染色液を流し出し、プレ ートをビーカ内の冷水道水に３回浸す。次いで、プレートを反転させ、激しく浸 透し、ラボラトリーベンチ上のラックで（プレートの蓋を外して）一夜空気乾燥 する。次いで、ウェル毎の細胞を、手動で、あるいは自動的手段および／または コンピュータ化された手段で計数し、様々な濃度での暴露における細胞の化学的 敏感性に関するデータを誘導する。細胞計数のための環境を操作する特に有用な コンピュータは、市販されているOPTIMATEコンパイラであり、これはコンピュー タ化された細胞計数手法およびそれに次ぐ計算に良 く適した光学的計数機能を発揮できるように設計されている。 上記手法は、化学治療薬剤などの細胞阻止薬剤ではなく、細胞成長プロモータ がアッセイされた場合でもさほど変化しない。本発明のアッセイは、同様の容易 さで、細胞死または細胞成長をモニターすることを可能とする。どの様な場合で も、本発明に係るシステムの使用の最適化は、インビトロでの結果に基づく患者 処置における最良候補の選択のためには、様々な候補活性薬剤の比較実験を含む であろう。上述した発明の特に有利な一態様は、長期間での阻害効果の評価が後 に続く、細胞毒性のための２段アッセイである。このようにして、化学治療薬剤 は、そのより長い遅延効能に付いてだけでなく、直接的な化学治療効果の両方に 付いて、別途評価することができる。 一以上の活性薬剤または化学治療薬剤の同定は本発明に対する周辺であり、こ れは所定の患者に関する何れかまたは全ての薬剤の効能スクリーニングのために 意図される。文字通り、何れの活性薬剤も本発明に従ってスクリーニングするこ とができ、従ってここでは活性薬剤の例示は無視した。 したがって、本発明の本質は、本発明のシステムの単純さにおける重要な特徴 、即ち試験すべき患者組織の凝集性多細胞粒子を、細胞単層を形成するために用 い、相互に関連する、同一細胞のインビボでの成長を正確に予測するために単層 の成長をモニターし、かつ異なった濃度の幾つかの活性薬剤を、最適な薬剤を決 定する目的だけでなく、(算出された細胞成長速度に従って)実際に患者を暴露す るための薬剤最適濃度を決定する目的で調査できることを包含する。本発明の要 件において、本発明のシステムは、長期間にわたる希釈クローニン グにより作成された単一細胞の子孫を用いるのではなく、(約数週間の)迅速な条 件下、栄養培養液中で成長した細胞カルチャー単層の懸濁物において行われるイ ンビトロテストを可能とすることを特筆することも重要である。幾つかの場合、 本発明は細胞毒性および長期間成長阻害についての二段アッセイである。 本発明を、上述した特定の材料および方法に付いて説明してきたが、本発明は 、添付の請求項に説明される限りにおいて限定されると考えられるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 31/00 31/00 35/00 35/00 37/02 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）患者の組織、細胞腹水または浸出流体の試料を採取し、 ｂ）前記試料を多細胞粒子に分離し、 ｃ）前記凝集性多細胞粒子から組織カルチャー単層を成長させ、 ｄ）前記単層からの細胞を複数の分離した部位に接種し、かつ ｅ）前記複数の部位を少なくとも１種の活性薬剤で処理し、次いで該部位にお ける前記細胞の少なくとも一種の薬剤に対する化学的な敏感性を調査する工程を 含む、患者の細胞の化学的な敏感性を調査する方法。 ２．前記工程ａ）が、 ａ）患者の癌組織のサンプルから採取された試料を調製する工程をさらに含む 請求項１記載の方法。 ３．前記複数の分離した部位が、さらに複数のウェルを含むプレートからなる請 求項１記載の方法。 ４．前記工程ｅ）が、 ｅ）前記複数の部位を、種々の濃度の前記複数の活性薬剤で試験し、次いで単 一の濃度での単一の活性薬剤に付いての最適な化学的敏感性を調査する工程を更 に含む請求項１記載の方法。 ５．前記工程ｅ）が、 ｅ）前記複数の部位を、前記複数の活性薬剤の少なくとも１種において初期細 胞毒性効果および長期間阻害効果の両方の調査を可能とするのに十分な時間 に亘って、複数の活性薬剤を用いて処理する工程を更に含む請求項１記載の方法 。 ６．前記工程ｅ）でアッセイされた化学的敏感性が、抗癌敏感性である請求項１ 記載の方法。 ７．前記工程ｄ）が、テラサキディスペンサーを用いて行われる請求項１記載の 方法。 ８．前記工程ｄ）の細胞が、カルチャープレートにおける複数のウェルに接種さ れるのに先立って、懸濁液中で調製される請求項１記載の方法。 ９．前記活性薬剤が、化学治療薬剤である請求項１記載の方法。 １０．前記活性薬剤が、創傷治癒薬剤である請求項１記載の方法。 １１．前記活性薬剤が、放射線治療薬剤および／または放射線治療鋭敏化薬剤ま たは放射線治療向上薬剤である請求項１記載の方法。 １２．前記活性薬剤が、免疫治療薬剤である請求項１記載の方法。