JP6028236B2 - 物質のスクリーニング方法 - Google Patents

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Description

本発明は、初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に罹患した固体に由来する細胞から人工多能性幹細胞の誘導を促進する物質をスクリーニングする方法に関する。
進行性骨化性線維異形成症（Fibrodysplasia ossificans progressiva;ＦＯＰ）は、進行性であり、かつ出生後に広範囲に及ぶ軟組織及び／又は筋肉が骨化する先天的な障害である（非特許文献１〜３）。重度の衰弱と、関節の癒着による平均余命の低下と、胸部の関与を伴う拘束性換気障害がこの疾患の主な症状である。ＦＯＰ患者は、徐々に呼吸機能を悪化させ、最終的には呼吸不全のために４０歳までに死亡する。ＦＯＰに関連した異所性の骨化を防ぐ有効な治療法は存在しない。最近の研究では、ＢＭＰ１型受容体ＡＬＫ２として知られるアクチビンＡ受容体１型（ＡＣＶＲ１）における突然変異により、この疾患が生じることが明らかにされている（非特許文献３〜９）。最も一般的な突然変異はＲ２０６Ｈであり、ＡＬＫ２のキナーゼ活性を変化させ、その結果、ＡＬＫ２のキナーゼ活性が構成的に高まると考えられている。例えば、ＡＬＫ２におけるＧ３５６Ｄのような幾つかのほかの突然変異がＦＯＰの表現型変異で報告されており、それらもキナーゼ活性に影響を及ぼしてＡＬＫ２の構成的な活性化を引き起こすことが報告されている（非特許文献１０）。ＡＬＫ２（Ｇ３５６Ｄ）のキナーゼ活性がＡＬＫ２（Ｒ２０６Ｈ）よりも弱いことが示されており、臨床上の変化はＡＬＫ２変異体における生物活性の差異に起因することが示唆されている（非特許文献１１）。
また、ミトコンドリア病は、ミトコンドリアの機能低下を原因とする疾患の総称であり、代表的なものとして慢性進行性外眼麻痺症候群、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群、及びミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群がある。ミトコンドリア病は、生体内全ての細胞においてミトコンドリアが一様に異常をきたす訳でも無いことからその病態は多彩であり、根本的な治療法の無い難病である。
また、ライソゾーム病は、細胞内小器官の一つであるライソゾームに関連する酵素の欠損に起因して生じる疾患であり、本来分解されるべき物質が体内に蓄積してしまう疾患である。ライソゾーム病は、欠損する酵素の種類に応じて病名及び症状が異なり、現在は約３０種類の疾患が存在する。ライソゾーム病の治療方法としては、酵素補充療法、臓器移植、骨髄移植等が行われているが、症状によっては殆ど効果も得られず、根本的な治療法は知られていない。
一方、患者の体細胞に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、生物医学研究のみならず、患者に由来する細胞に対する薬剤の効果の検討について強力なツールとして期待されている。特定の疾患から生成されたｉＰＳ細胞が疾患に関連した表現型を再現することが明らかにされている。しかしながら、疾患に特異的な病原性がヒトｉＰＳ細胞の生成と維持にどのように影響するのかは未だに不明であり、進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病、ライソゾーム病等の難病においてｉＰＳ細胞を作製できた例はこれまでに知られていない。
F. S. Kaplan et al., Methods Enzymol 484, 357 (2010). E. M. Shore, F. S. Kaplan, Bone 43, 427 (2008). T. Fukuda et al., J Biol Chem 284, 7149 (2009). P. C. Billings et al., J bone Miner Res 23, 305 (2008) J. L. Fiori, P. C. Billings, L. S. de la Pena, F. S. Kaplan, E. M. Shore, J Bone Miner Res 21, 902 (2006). F. S. Kaplan et al., Hum Mutat 30, 379 (2009). A. B. Shafritz et al., N Engl J Med 335, 555 (1996). Q. Shen et al., J Clin Invest 119, 3462 (2009). E. M. Shore et al., Nat Genet 38, 525 (2006). H. Furuya et al., Am J Med Genet A 146A, 459 (2008). T. Fukuda et al., Biochem Biophys Res Commun 377, 905 (2008). Yu PB et al., Nat Med. 2008 Dec; 14(12): 1363-9
進行性骨化性線維異形成症等の難病に対する薬剤の開発では、一般的な培養細胞株や遺伝子異常を有するトランスジェニック・マウス等を用いた薬剤のスクリーニング系により薬剤の選別及び効能試験が行われているのが現状である。しかしながら、これらの手法は試験操作を煩雑にし、薬剤の効能評価に多大な時間を要する等の問題がある。さらに、このような従来の薬剤スクリーニング系では、患者本人に由来する細胞を用いて薬効を評価していないことから、選別された薬剤が実際に有効な薬剤として機能するかどうかの懸念を排除できないという問題がある。
本発明の課題は、初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に罹患した固体に由来する細胞から人工多能性幹細胞の誘導を促進する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、特に進行性骨化性線維異形成症の患者由来の線維芽細胞に初期化遺伝子である４因子（Oct4、Sox2、KLF4、及びｃＭｙｃ）を導入して人工多能性幹細胞の誘導を行っても、人工多能性幹細胞はほとんど樹立できないことを見出したが、同時に、ＡＬＫ２キナーゼの阻害剤として知られるＬＤＮ１９３１８９の存在下で人工多能性幹細胞を誘導すると、効率的に人工多能性幹細胞を樹立できることを見出した。ＢＭＰＩ型受容体キナーゼの特異的阻害剤ＬＤＮ−１９３１８９は、進行性骨化性線維異形成症の主要な症状である異所性骨形成と機能障害とを軽減することが知られている（非特許文献１２）。さらに、本発明者らは、特にライソゾーム病の一つであるクラッベ病に罹患した患者に由来する線維芽細胞に初期化遺伝子である４因子（Oct4、Sox2、KLF4、及びｃＭｙｃ）を導入して人工多能性幹細胞の誘導を行っても、人工多能性幹細胞はほとんど樹立できないことを見出したが、それと同時に、酪酸ナトリウムの存在下で人工多能性幹細胞を誘導すると、効率的に人工多能性幹細胞を樹立できることを見出した。
本発明は、係る知見により完成されたものである。
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
（１）初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に罹患した個体に由来する細胞であって初期化遺伝子が導入された細胞を被験物質の存在下で培養し、前記細胞の人工多能性幹細胞への誘導を促進する被験物質を選別することを含む、物質のスクリーニング方法。
（２）前記疾患がキナーゼの活性の変化に起因する、（１）に記載の方法。
（３）前記疾患がアクチビン受容体様キナーゼ２の活性の変化に起因する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記疾患が進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はライソゾーム病である、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病である、（１）から（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記細胞がヒトの細胞である、（１）から（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記細胞が、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、（７）に記載の方法。
（９）前記細胞が、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）初期化遺伝子が、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子である、（１）から（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記細胞が線維芽細胞である、（１）から（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）さらに、アクチビン受容体様キナーゼ２を阻害する被験物質を選別することを含む、（１）から（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）上記疾患に対する治療剤をスクリーニングする方法である、（１）から（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、（１）から（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）進行性骨化性線維異形成症又はライソゾーム病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、（１）から（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、（１）から（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に罹患した個体に由来する細胞であって初期化遺伝子が導入された細胞を、該細胞の人工多能性幹細胞への誘導を促進する物質の存在下で培養することを含む、人工多能性幹細胞の製造方法
（１８）前記疾患がキナーゼの活性の変化に起因する、（１７）に記載の方法。
（１９）前記疾患がアクチビン受容体様キナーゼ２の活性の変化に起因する、（１７）又は（１８）に記載の方法。
（２０）前記疾患が進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病である、（１７）から（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はライソゾーム病である、（１７）から（２０）のいずれかに記載の方法。
（２２）前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病である、（１７）から（２１）のいずれかに記載の方法。
（２３）前記細胞がヒトの細胞である、（１７）から（２２）のいずれかに記載の方法。
（２４）前記細胞が、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、（２３）に記載の方法。
（２５）前記細胞が、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、（２３）又は（２４）に記載の方法。
（２６）初期化遺伝子が、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子である、（１７）から（２５）のいずれかに記載の方法。
（２７）前記細胞が線維芽細胞である、（１７）から（２６）のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、従来の方法による初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患であっても、人工多能性幹細胞の誘導を促進する物質を効率的にスクリーニングすることができる。さらに、本発明によれば、初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患であっても、信頼性の高い薬剤候補を簡便かつ効率的に取得できる薬剤スクリーニング系として利用可能な物質のスクリーニング方法を提供することが可能となる。
ＦＯＰ患者からのｉＰＳ細胞の形成を調べた結果を示す。（Ａ）ＦＯＰ患者及び健常者からのｉＰＳ細胞の形成効率（Efficiency (%)）を示す。ＡＰ陽性とＥＳ様の形態（典型的(typical)な形態）によってｉＰＳコロニーを判定した。（Ｂ）６０ｍｍシャーレにおけるｉＰＳ細胞コロニーのＡＰ染色を示す。（Ｃ）ｉＰＳ細胞のコロニーの形態を示す。目盛尺：２００μｍ。（Ｄ）ＦＯＰ及び対照における典型的(typical)な及び異常(atypical)なｉＰＳ細胞コロニーの数及び比率を示す。 ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤処理による、ＦＯＰ線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の生成と維持を調べた結果を示す図である。（Ａ）ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤であるＬＤＮ−１９３１８９（ＬＤＮ）及びドルソモルフィンの処理によるｉＰＳ細胞コロニー形成の改善効果を示す。ＡＰ陽性とＥＳ様の形態によってｉＰＳコロニーを判定した。左と右のパネルはそれぞれ、患者Ｆ２と患者Ｆ４である。（Ｂ）ＬＤＮで治療した個々の患者から生成されたＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞の位相差写真を示す。目盛尺：２００μｍ。（Ｃ）センダイウイルス及びヒトＥＳマーカーのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。ｉＰＳのＦ１−１、Ｆ２−１及びＦ４−１はそれぞれ患者Ｆ１、Ｆ２及びＦ４に由来するｉＰＳ細胞株を示す。２０１Ｂ７：対照のヒトｉＰＳ細胞株。ＳｅＶ（＋）：ＳｅＶを感染させた線維芽細胞。（Ｄ）多能性マーカーについてのＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株の免疫蛍光染色及びＡＰ染色を示す。目盛尺：２００μｍ。（Ｅ）ＬＤＮなしでのＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株の自発的な分化を調べた結果を示す。未分化（Ｕ）は典型的(typical)なｉＰＳコロニーを示す。部分的分化（Ｐ）は部分的に分化したコロニーを示し、分化（Ｄ）は完全に分化したコロニーを示す（上段写真）。阻害剤を伴った又は伴わない（真ん中と下のパネル）ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株における３種のコロニーの数及び比率。目盛尺：２００μｍ。（Ｆ）ＬＤＮを伴わずに培養したＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株における分化マーカーの免疫蛍光染色を示す。４種のｉＰＳ細胞株を染色し、ｉＰＳ細胞株Ｆ２〜６から得た代表的なデータが示されている。目盛尺：２００μｍ。（Ｇ）多能性及び分化に関連する遺伝子の発現に関する定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。データはＧＡＰＤＨに対して標準化し、ＬＤＮを伴わずに培養した２０１Ｂ７ヒトｉＰＳ細胞株に対する相対的な発現レベルとして表す。 ＦＯＰに由来する線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の形成効率と、ＡＬＫ２キナーゼ阻害の時期との関係を調べた結果を示す。（Ａ）ＬＤＮによる処理の実験計画を示す。ｉＰＳ細胞の誘導培養は、図示される期間、ＬＤＮによって処理される。（Ｂ）図３Ａに示す期間、３種の濃度：０ｎＭ，３０ｎＭ及び２００ｎＭのＬＤＮで処理した６０ｍｍシャーレにおける患者Ｆ２（左）と健常者Ｎ１（右）に由来するｉＰＳ細胞コロニーのＡＰ染色の結果を示す。ｄ１−ｄ７、ｄ１−ｄ３０、及びｄ８−ｄ３０はそれぞれ、１日目〜７日目、１日目〜３０日目及び８日目〜３０日目のＬＤＮの処理期間を示す。（Ｃ）各期間ＬＤＮで処理したｉＰＳ細胞コロニーの形成効率を示す。典型的(typical)なＡＰ陽性コロニーを３０日目で計数した。グラフ横軸において、「１」から「７」は、それぞれのＬＤＮ処理期間を表し、「１」は「d1-d30」を、「２」は「d1-d7」を、「３」は「d1-d30」を、「４」は「d8-d30」を、「５」は「d8-d14」を、「６」は「d15-d21」を、「７」は「d22-d30」を表す（図３Ａを参照）。 ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤について調べた結果を示す。（Ａ）正常なｉＰＳ細胞及びＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞の全般的遺伝子発現パターンを調べた結果を示す。ＬＤＮ−１９３１８９の存在下及び非存在下における、ｉＰＳ細胞株Ｎ３−１、ｉＰＳ細胞株Ｆ１−１及びＦ２−１、及びｉＰＳ細胞株Ｆ４−１についての全般的遺伝子発現パターンの散布図を示す。（Ｂ）ＬＤＮ−１９３１８９及びドルソモルフィンの構造を示す。 ＡＬＫ２遺伝子における突然変異及びＦＯＰ−ｉＰＳ細胞のＡＬＫ２活性の阻害を調べた結果を示す。（Ａ）ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株のＡＬＫ２遺伝子におけるゲノム塩基配列を決定した結果を示す。６１７Ｇ＞Ａ（Ｒ２０６Ｈ）及び１０６７Ｇ＞Ａ（Ｇ３５６Ｄ）の突然変異を矢印で示した。（Ｂ）ドルソモルフィン（ＤＭ）で処理したＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞の位相差像を示す。左のパネル：患者Ｆ２に由来するｉＰＳ細胞；右のパネル：患者Ｆ４に由来するｉＰＳ細胞。目盛尺：２００μｍ。（Ｃ）ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株における３種のコロニーの数及び比率を示す。ｉＰＳ Ｆ２−１及びｉＰＳ Ｆ４−２の細胞をＤＭと共に、又はＤＭを伴わずに培養した。未分化（Ｕ）、部分分化（Ｐ）及び完全分化（Ｄ）のコロニーは図２Ｅで記載したように定義する。目盛尺：２００μｍ。（Ｄ）ＬＤＮ−１９３１８９（ＬＤＮ）で処理した又は処理しない正常対照（２０１Ｂ７）及びＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞（Ｆ２−１及びＦ４−１）におけるリン酸化Ｓｍａｄ１／５／８の免疫ブロット解析の結果を示す。ＢＭＰ−４で処理したｉＰＳのＦ２−１、Ｆ４−１及び２０１Ｂ７におけるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化の相対的レベルは、２０１Ｂ７細胞のみよりは高く、Ｓｍａｄ１／５／８のそのようなリン酸化はＬＤＮによる処理によって阻害される。１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４で処理した又は処理しない２０１Ｂ７ｉＰＳ細胞をそれぞれ、Ｓｍａｄ１／５／８リン酸化の陰性対照及び陽性対照として用いた。（Ｅ）ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞におけるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化に対するＤＭの効果を調べた結果を示す。ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞（Ｆ２−１及びＦ４−２）におけるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化は、ＬＤＮによるもののようにＤＭによる処理によって双方とも阻害される。リン酸化されたＳｍａｄ１／５／８の相対的レベルは総Ｓｍａｄ１に対して標準化されている。 ＦＯＰ−ｉＰＳ細胞についての遺伝子発現を解析した結果を示す。（Ａ）ＬＤＮの非存在下でｉＰＳ Ｆ２−１とＦ２−２の間で共通して２倍以上、上方又は下方調節される発現遺伝子に関するベン図を示す。５４，６７５の遺伝子中、１，４１７の発現遺伝子が、Ｆ２のｉＰＳ細胞株間で共通して上方調節され、３９４の遺伝子が下方調節される。（Ｂ）ＬＤＮの非存在下で培養されたｉＰＳのＦ１−１、Ｆ２（Ｆ２−１とＦ２−２）及びＦ４−１の間で２倍以上、共通して上方又は下方調節される遺伝子についてのベン図を示す。これらのｉＰＳ細胞株の遺伝子発現プロファイルを互いに比較すると、５１６の遺伝子の発現が共通して上方調節されることが示され、８５の遺伝子の発現が下方調節されることが示された。 乳児型クラッベ病患者由来の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を誘導した結果を示す。
本発明は、初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に罹患した個体に由来する細胞であって初期化遺伝子が導入された細胞を被験物質の存在下で培養し、前記細胞の人工多能性幹細胞への誘導を促進する被験物質を選別することを含む、物質のスクリーニング方法に関する。
本発明において、「初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患」とは、患者に由来する細胞（体細胞）に後述の初期化遺伝子を導入し、従来の手法により人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）への誘導を行っても、ｉＰＳ細胞の製造が不可能であるか、或いは低い効率でしか人工多能性幹細胞が出現しない疾患を意味する。より具体的には、疾患に由来する細胞に初期化遺伝子を導入し、各種ｉＰＳ培地において培養することにより人工多能性幹細胞の誘導を行っても、培地上にｉＰＳ細胞コロニーが全く出現しないか、或いは、健常な固体に由来する細胞からｉＰＳ細胞の誘導を行った場合と比較して培地上におけるｉＰＳ細胞コロニーの形成頻度が低い疾患を意味する。さらにより具体的には、該疾患に由来する細胞に初期化遺伝子（特に、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子）を導入し、１００ｍｍシャーレ当たり１〜２×１０5個の細胞を播種してｉＰＳ細胞の誘導を行った場合に、健常な固体に由来する細胞からｉＰＳ細胞の誘導を行った場合と比較して形成されるコロニー数がより少ない疾患である。例えば、「初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患」とは、健常固体由来の対照と比較して ｉＰＳ細胞のコロニー形成効率が低く、かつ形成されるｉＰＳ細胞のコロニーの数が、５０以下、好ましくは１０以下、より好ましくは１０以下、特に好ましくは５以下、４以下、３以下、２以下、１以下、０である疾患を意味する。
本発明における疾患は、上記定義の範囲内において特に限定されるものではないが、例えば疾患の責任遺伝子の異常（例えば、責任遺伝子の欠失、責任遺伝子がコードするアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換及び／または付加などの変異）又はその発現異常（例えば、発現の消失、低下、過剰発現）に起因して、該疾患に罹患した個体に由来する細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができない疾患を含む。
より具体的には、本発明における疾患は、例えば、正常個体と比較してキナーゼの活性異常を示し、かつその活性異常に起因して発症する疾患が挙げられる。キナーゼの種類としては、アクチビン受容体キナーゼ２（activin receptor-like kinase 2; ALK2）が挙げられる。このようなキナーゼの活性異常としては、正常固体と比較して活性が低下又は上昇するか、或いは正常個体ではキナーゼの活性が特定の調節因子により所定の様式で調節（活性の「オン」又は「オフ」）されているのに対し、疾患に罹患した固体ではキナーゼが調節因子により正常に調節されず常に活性化又は不活性化状態にある場合などが挙げられる。
本発明における疾患の具体例としては、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）、ミトコンドリア病[例えば、慢性進行性外眼麻痺症候群、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群（福原病；Myoclonus epilepsy associated with ragged-red fibers；ＭＥＲＲＦ）、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群（ＭＥＬＡＳ）］、造血器腫瘍（例えば、白血病）、ライソゾーム病等が挙げられる。ライソゾーム病の具体例としては、クラッベ病が挙げられ、クラッベ病は病乳児型（３〜６ヶ月で発症）、晩期乳児型（６ヶ月〜３歳で発症）、若年型（３歳〜１０歳で発症）、及び成人型（１０〜３５歳で発症）に分類され得る。本発明における疾患は、好ましくは進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）、ミトコンドリア病又はライソゾーム病であり、より好ましくは進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）又はライソゾーム病、特に好ましくは進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）又はクラッベ病であり、クラッベ病は好ましくは乳児型クラッベ病である。
ＦＯＰの責任遺伝子は、ＡＬＫ２遺伝子（ＡＣＶＲ１）であることが知られている。ヒトＡＬＫ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列（Homo sapiens activin A receptor, type I (ACVR1), transcript variant 1, mRNA）はＮＣＢＩアクセション番号：ＮＭ＿００１１０５として公開されている。そのCDS領域の塩基配列を配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
健常者とＦＯＰ患者のＡＬＫ２遺伝子を比較すると、そのＣＤＳ領域の塩基配列において第６１７番目の塩基がグアニン（Ｇ）であるのに対し、ＦＯＰ患者ではその塩基がアデニン（Ａ）に変異していることが知られており、この塩基の変異により、ＡＬＫ２遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異（Ｒ２０６Ｈ）する。さらに、ＦＯＰ患者におけるＡＬＫ２遺伝子の変異の希な事例として、ＣＤＳ領域の塩基配列において第１０６７番目の塩基がグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）へと変異し、アミノ酸配列において第３５６番目のグリシンからアスパラギンへと変異（Ｇ３５６Ｄ）するケースが知られている。ＡＬＫ２キナーゼは、骨組織を誘導する成長因子として知られるＢＭＰ（Bone morphogenetic protein）の１回膜貫通型受容体として機能し、細胞外領域でＢＭＰと結合すると活性化して細胞内に骨形成シグナルを伝達する。健常者では、ＡＬＫ２キナーゼはＢＭＰが結合していない状態では不活性化された「オフ」の状態であるが、ＦＯＰ患者では、ＡＬＫ２キナーゼはＢＭＰが結合していない場合でも活性化された「オン」の状態であることが明らかとされており、ＦＯＰでは常にＡＬＫ２キナーゼが活性化状態にあるため、骨形成を促進するシグナルが伝達されて異所性骨形成が進行するものと考えられている。
本発明において、「個体」は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
本発明において、「細胞」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には体細胞であり、任意の組織から採取した細胞、あるいは採取した細胞を培養して得られる培養細胞を用いることができる。本発明において体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。加えて、本発明において「由来する」とは、個体から採取した細胞をそのまま本発明のスクリーニング方法に用いてもよいし、採取した細胞を培養して樹立した培養細胞株を本発明のスクリーニング方法に用いてもよいことを意味する。本発明における細胞の具体例としては、例えば、疾患に罹患した個体にから採取した皮膚を培養することにより得られた線維芽細胞が挙げられる。さらに、本発明における細胞として、上記したＲ２０６Ｈ及び／又はＧ３５６Ｄの突然変異を有するＡＬＫ２キナーゼをコードする遺伝子を含む細胞を用いることができる。具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列においてＲ２０６Ｈ及び／又はＧ３５６Ｄの突然変異を有するＡＬＫ２キナーゼをコードする遺伝子を含むヒトの細胞を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法では、上記疾患に罹患した個体に由来する細胞に初期化遺伝子を導入して得られた細胞を人工多能性幹細胞の誘導及び維持に用いられ得る培地において被験物質の存在下で培養し、該細胞の人工多能性幹細胞への誘導を促進する被験物質を選別する。
本発明の方法では、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してiPS細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子
（ii）Oct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子
（iii）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40 large T遺伝子
（iv）Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子
Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子及びMyc遺伝子にはそれぞれ、複数のファミリー遺伝子が含まれている。それぞれのファミリー遺伝子の具体例としては、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報の明細書の第１１頁から第１３頁に記載されているものを用いることができる。具体的には、以下の通りである。
Oct遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、Oct3/4（NM＿002701）、Oct1A(NM＿002697)、及びOct6(NM＿002699)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはOct3/4である。Oct3/4はPOUファミリーに属する転写因子であり、未分化マーカーとして知られており、また多能性維持に関与しているとの報告もある。
Klf遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、Klf1(NM＿006563)、Klf2(NM＿016270)、Klf4(NM＿004235)、及びKlf5(NM＿001730)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはKlf4である。Klf4（Kruppel like factor-4）は腫瘍抑制因子として報告されている。
Sox遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、例えば、Sox1(NM＿005986)、Sox2(NM＿003106)、Sox3(NM＿005634)、Sox7(NM＿031439)、Sox15(NM＿006942)、Sox17(NM＿0022454)、及びSox18(NM＿018419)を挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくはSox2である。Sox2は初期発生過程で発現し、転写因子をコードする遺伝子である。
Myc遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、c-Myc(NM＿002467)、N-Myc(NM＿005378)、及びL-Myc(NM＿005376)などを挙げることができる（括弧内は、ヒト遺伝子のNCBI accession 番号を示す）。好ましくは、c-Myc である。c-Mycは細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子であり、多能性維持に関与しているとの報告がある。
上記した遺伝子は、ヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において任意の哺乳類動物由来（例えばヒト、マウス、ラット、サルなどの哺乳類動物由来）の遺伝子を用いることができる。また、野生型の遺伝子に対して、数個（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１から３個）の塩基が置換、挿入及び／又は欠失した変異遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を使用することもできる。
本発明では特に好ましくは、初期化遺伝子として、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子の組合せを用いることができる。
初期化遺伝子を細胞に導入する方法は、導入された初期化遺伝子が発現して細胞の初期化を達成できる限り特に限定されない。例えば、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を含む発現ベクターを用いて該初期化遺伝子を細胞に導入することができる。ベクターを用いて２種類以上の初期化遺伝子を細胞に導入する場合には、一つの発現ベクターに２種類以上の初期化遺伝子を組み込んで、該発現ベクターを細胞に導入してもよいし、１種類の初期化遺伝子を組み込んだ発現ベクターを２種類以上用意して、それらを細胞に導入してもよい。
発現ベクターの種類は特に限定されず、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよいが、好ましくはウイルスベクターである。本発明で使用できるウイルスベクターとしては、レトロウィルスベクター（レンチウィルスベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどを挙げることができる。上記の中でも好ましくはセンダイウイルスベクターである。
本発明の方法では、初期化遺伝子が導入された細胞を被験物質の存在下で培養するが、この工程では、人工多能性幹細胞の誘導又は維持に用いられ得る任意の培地に被験物質を添加して当該細胞を培養すればよい。具体的には、ＥＳ細胞や人工多能性幹細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地は当業界で公知であり、適当な培地を組み合わせて用いることができる。即ち、本発明の方法において初期化遺伝子が導入された細胞を被験物質の存在下で培養するために用いられ得る培地としては、ES培地、ES培地に10ng/ml FGF-2を添加後にマウス胚性線維芽細胞を24時間培養した上清であるMEF馴化ES培地（以下MEF馴化ES培地）、所定量のKnockOut Serum Replacement(KSR)（インビトロジェン社）及び／又はｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ培地などをあげることができる。本発明において初期化遺伝子が導入された細胞を培養するための培地には、各種の成長因子、サイトカイン、ホルモンなど（例えば、FGF-2、TGFb-1、アクチビンA、ノギン（Nanoggin）、BDNF、NGF、NT-1、NT-2、NT-3等のヒトES細胞の増殖・維持に関与する成分）を添加してもよい。
本発明において初期化遺伝子が導入された細胞を被験物質の存在下で培養する際には、適切な支持細胞を用いてもよい。本発明で用いられる支持細胞としては、一般に多能性幹細胞を誘導及び維持できる細胞であれば、特に限定されるものではない。支持細胞の具体例としては、ＭＥＦ細胞などが挙げられる。また、支持細胞は、マイトマイシンＣ処理又は放射線照射により細胞増殖を失わせたものを用いることができる。ＭＥＦ細胞（ＩＣＲマウスより）は、ＡＴＣＣにカタログ番号ＡＴＣＣ＃ＳＣＲＣ−１０４６として登録されている。また、ＭＥＦ細胞は、文献（Nagy A, et al. Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Third Edition Cold Spring Harbor Press; 2003）の記載に従って入手可能である。
本発明で用いる被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、低分子化合物であってもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
上述の通り、初期化遺伝子が導入された細胞を被験物質の存在下で培養することにより、当該細胞から人工多能性幹細胞の誘導を促進する被験物質を選別する。人工多能性幹細胞の誘導が促進されたか否かの判断については、例えば、被験物質が添加されていない培地で本発明の細胞を培養した陰性対照群と、被験物質を添加した培地で初期化遺伝子が導入された本発明の細胞を培養した被験試料群とを比較し、被験試料群の培地上に人工多能性幹細胞がより高頻度で出現した場合に、当該被験物質を人工多能性幹細胞の誘導を促進する物質として選別することができる。
人工多能性幹細胞が誘導されたか否かの判断については、例えば、培地上におけるｉＰＳ細胞のコロニーの形成を目視により判断することができる。より具体的には、被験物質が添加されていない培地で初期化遺伝子が導入された本発明の細胞を培養した陰性対照群と、被験物質を添加した培地で初期化遺伝子が導入された本発明の細胞を培養した被験試料群とを比較し、被験群の培地上に人工多能性幹細胞に典型的なコロニーがより高頻度で出現した場合に、当該被験物質を、人工多能性幹細胞の誘導を促進する物質として選別することができる。ｉＰＳ細胞のコロニーは、通常、輪郭が明瞭であり、細胞密度が高くなっている。当業者であれば、ｉＰＳ細胞のコロニーを目視により判別することができる。さらに、被験物質が添加されていない培地で初期化遺伝子が導入された本発明の細胞を培養した陰性対照群、或いは被験物質が人工多能性幹細胞の誘導を促進しない場合において、ｉＰＳ細胞のコロニーの形態とは異なる異常な形態をしたコロニーが観察されることもある。必要に応じて、顕微鏡による観察を行うことができる。
さらに、人工多能性幹細胞が誘導されたか否かの判断の指標として、形成された細胞（コロニー）についてｉＰＳ細胞の指標となるアルカリフォスファターゼ活性を検出することもできる。陰性対照群と比較して、アルカリフォスファターゼ活性が検出される細胞（コロニー）が被験試料群において高頻度に出現した場合には、当該被験物質を人工多能性幹細胞の誘導を促進する物質として選別することができる。
さらに、人工多能性幹細胞が誘導されたか否かの判断の指標として、形成された細胞（コロニー）についてｉＰＳ細胞の指標となる多能性マーカーの発現を検出することもできる。陰性対照群と比較して、被験試料群において多能性マーカーのより高い発現が確認された場合には、当該被験物質を人工多能性幹細胞の誘導を促進する物質として選別することができる。多能性マーカーとしては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｇｄｆ３、Ｓａｌｌ４ｆ、Ｒｅｘ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０等が挙げられる。一方、細胞の分化を示すマーカーを検出することにより、形成された細胞（コロニー）が人工多能性幹細胞であるか否かを判断することもできる。例えば、分化を示すマーカーの発現が検出された細胞（コロニー）は人工多能性幹細胞ではないと判断してもよい。分化を示すマーカーとしては、例えば、中胚葉マーカーであるブラキュリ（Brachyury）、Mesogenin及びＭｅｓｐ１、内胚葉マーカーであるＳｏｘ１７及びＦｏｘａ２、栄養外胚葉マーカーであるＣｄｘ２、神経外胚葉マーカーであるネスチン(Nestin)、神経細胞マーカーであるＳｏｘ１及びNeuroD1などが挙げられる。
本発明のスクリーニング方法によれば、上記の通り従来の手法による初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患であっても、その疾患に罹患した個体に由来する細胞からｉＰＳ細胞を効率的に誘導できる物質をスクリーニングすることが可能である。スクリーニングにより得られた物質は、人工多能性幹細胞の誘導が不可能か又は困難であると言うその疾患に特有の性質を正常化ないし改善することができる物質であるから、対象となる疾患の治療薬のとなる可能性が高い。即ち、本発明の方法は、上記の通り従来の手法による初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に対する治療薬の開発において、薬剤スクリーニング系として利用することができる。
さらに、本発明の方法において、上記の通り、正常個体と比較してキナーゼの活性異常（特に、活性の亢進）を示し、かつその活性異常に起因して発症する疾患に罹患した個体に由来する細胞が用いられる場合には、該細胞の人工多能性幹細胞への誘導を促進する物質として選別された被験物質に関し、さらにキナーゼ（例えば、アクチビン受容体キナーゼ２）の活性を阻害する物質を選別してもよい。
さらに、本発明の別の態様によれば、
「初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に罹患した個体に由来する細胞であって初期化遺伝子が導入された細胞を、該細胞の人工多能性幹細胞への誘導を促進する物質の存在下で培養することを含む、人工多能性幹細胞の製造方法」がさらに提供される。
本発明の人工多能性幹細胞の製造方法において、「初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患」、「個体」、「由来する」、「細胞」、及び「初期化遺伝子」の各用語は、本発明の物質のスクリーニング方法に関し上記に説明した通りであり、人工多能性幹細胞の製造方法は物質のスクリーニング方法に準じて実施することができる。「初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患」は、好ましくは進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病であり、特に好ましくは進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病である。クラッベ病については、乳児型クラッベ病であることが好ましい。
本発明の人工多能性幹細胞の製造方法において、「人工多能性幹細胞への誘導を促進する物質」としては、本発明の物質のスクリーニング方法により選別された物質を用いることができる。例えば、対象となる疾患がキナーゼの活性亢進に起因するものである場合には、キナーゼ阻害剤を用いることができる。対象となる疾患が進行性骨化性線維異形成症である場合には、アクチビン受容体様キナーゼ２阻害剤を用いることが可能であり、例えば、以下の実施例に記載のＬＤＮ−１９３１８９、及び／又はドルソモルフィンを用いることができる。また、対象となる疾患がライソゾーム病（例えば、クラッベ病）である場合には、「人工多能性幹細胞への誘導を促進する物質」として、例えば、酪酸及び／又は酪酸塩(好ましくは酪酸ナトリウム)を用いることができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
〔実施例１〕
（Ａ）材料及び方法
（１）皮膚由来の線維芽細胞の生成
倫理委員会に承認されたプロトコールにより、インフォームドコンセントの下、ＦＯＰ患者及び健常者の皮膚生検の外植片から線維芽細胞を作出した。患者及び健常者からの皮膚試料を細かく刻み、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤ−ＭＥＭ培地で培養した。線維芽細胞が出現したことを確認した後、ｉＰＳ細胞を誘導するために線維芽細胞を増殖させた。
（２）ｉＰＳ細胞の維持及び生成
２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清置換物（ＫＳＲ、インビトロゲン）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×１０-4Ｍの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、シグマ）、１×１０-4Ｍの２−メルカプトエタノール（シグマ）、０．５％のペニシリンとストレプトマイシン（日本、ナカライテスク）、及び５ｎｇ／ｍＬの基本線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、和光、日本）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（シグマ）を含有するヒトｉＰＳ培地において、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理したＭＥＦ支持細胞上でヒトｉＰＳ細胞を維持した。一部の実験では、ＬＤＮ−１９３１８９（ＳＴＥＭＧＥＮＴ；ステムジェント）及びドルソモルフィン（シグマ）等のＡＬＫ２キナーゼ阻害剤をヒトｉＰＳ培地に添加した。
N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される方法により、ヒト由来の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を生成した。感染１日前に、６穴プレートにおいてウエル当たり５×１０5個のヒト線維芽細胞を播種し、その後、感染多重度（multiplicity of infection；ＭＯＩ）３にて、下記センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターを細胞に感染させた。感染の７日後、トリプシンによって感染させた線維芽細胞を回収し、６０ｍｍのシャーレ当たり５．４×１０4個の細胞、或いは１００ｍｍのシャーレ当たり１〜２×１０5個の細胞をＭＭＣ処理したＭＥＦ支持細胞上に播種した。翌日、ヒトｉＰＳ細胞培地に置き換えた。感染の３０日後、コロニーを単離し、ヒトｉＰＳ細胞培地で再培養した。
（３）センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターの構築及び検出
Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋ１ｆ４遺伝子及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子を含むＳｅＶベクターは、N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される通り作成した。ＳｅＶのゲノムを検出するために、ネストＰＣＲを行った。皮膚線維芽細胞及びｉＰＳ細胞から抽出した１マイクログラムのトータルＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次いで、一対のＳｅＶ特異的プライマーを用いてｃＤＮＡを増幅し、これらＰＣＲ産物の１／１０容積をさらに、一対にネストプライマーを用いて増幅させた。プライマーの配列及び増幅条件を表１に示す。
（４）アルカリフォスファターゼ染色及び免疫組織化学
白血球アルカリフォスファターゼキット（Leukocyte Alkaline Phosphatase kit；シグマ）を用いてアルカリフォスファターゼ染色を行った。免疫細胞化学については、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで４℃にて３０分間細胞を固定した。核に局在する分子については、室温にて１５分間、０．２％トリトンＸ−１００にて試料を処理した。２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで細胞を３回洗浄し、次いで一次抗体と共に２％ＦＢＳを含有するＰＢＳにて４℃で一晩インキュベートした。一次抗体には、ＳＳＥＡ４（１：５００、ミリポア）、ＴＲＡ−１６０（１：５００、ミリポア）、Ｎａｎｏｇ（１：１０００、Ｒ＆Ｄシステムズ）及びＯｃｔ３／４（１：５００、Santa-Cruz）が含まれる。二次抗体には、アレクサ４８８が結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１０００、インビトロジェン）及びアレクサ４８８が結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（１：１０００、インビトロジェン）を用いた。分化マーカーの染色については、Ｓｏｘ１７（１：２００、Ｒ＆Ｄシステムズ）、Ｆｏｘａ２（１：２００、Ｒ＆Ｄシステムズ）及びブラキュリ(Brachyury)（1：200、Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いた。核は１μｇ／ｍＬのヘキスト３３２５８（インビトロジェン）で染色した。
（５）ＲＮＡの単離及びＰＣＲ
セパゾール・スーパーＧ試薬（Sepazol Super G reagent）（ナカライテスク、日本）を用いてトータルＲＮＡを精製した。製造元の指示書に従って、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（インビトロジェン）及びランダムプライマー（インビトロジェン）による逆転写反応に１マイクログラムのトータルＲＮＡを用いた。H. Sakurai et al., Stem Cells, 24, 575 (2006)に記載される通り、ＱｕｉｃｋＴａｑ（商標）（日本、東洋紡）によってＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーの配列及び増幅条件を表１に示す。
製造元の指示書に従って、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標）ｑＰＣＲミックス（東洋紡）によって定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（アプライド・バイオシステムズ）によって解析した。ＧＡＰＤＨの発現に対してデータを標準化した。Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋ１ｆ４及びｃ−Ｍｙｃに使用したプライマーは、導入遺伝子ではなく内在性の遺伝子の発現を検出するように設計した。ｑＰＣＲに使用したプライマーの配列を表２に列記する。
（６）免疫ブロッティング法
T. Fukuda et al., J. Biol. Chem., 284, 7149 (2009)に記載される免疫ブロッティング法によって、リン酸化されたＳｍａｄ１／５／８を検出した。およそ１０マイクログラムのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試し、ＰＶＤＦ膜に転写した。抗リン酸化Ｓｍａｄ１（Ｓｅｒ４６３／４６５）／Ｓｍａｄ５（Ｓｅｒ４３６／４６５）／Ｓｍａｄ８（Ｓｅｒ４２６／４２８）抗体（セルシグナリング）と抗Ｓｍａｄ１抗体（ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ及びセルシグナリング）によってリン酸化Ｓｍａｄ１／５／８及び総Ｓｍａｄ１を検出した。総Ｓｍａｄ１の発現に対してデータを標準化する。
（７）マイクロアレイ解析
ＬＤＮ−１９３１８９の存在下又は非存在下で培養したｉＰＳ細胞株（Ｆ１−１、Ｆ２−１、Ｆ２−２、Ｆ４−１及びＮ３−１）から抽出したトータルＲＮＡ２５０ｎｇをビオチンで標識し、製造元のプロトコール（３’ＩＶＴ発現キット(3'IVT Express kit)、アフィメトリクス）に従って断片化した。次いで、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０（アフィメトリクス）に試料をハイブリダイズさせた。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）スキャナー３００（アフィメトリクス）によってアレイをスキャンした。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸ１１．５ソフトウエア（Agilent technologies;アジレント・テクノロジーズ）を用いてデータを解析した。測定値の中央値に対して各チップを標準化した。
（８）ＤＮＡの単離及び塩基配列決定
ＤＮＡの塩基配列決定によってＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株におけるＡＬＫ２遺伝子の突然変異（Ｒ２０６Ｈ：６１７Ｇ＞Ａ及びＧ３５６Ｄ：１０６７Ｇ＞Ａ）を確認した。５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ及び０．１５ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含有する溶解緩衝液においてｉＰＳ細胞株を５５℃で一晩インキュベートした。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによってゲノムＤＮＡを抽出した。次いでＰＣＲによって１００ｎｇのゲノムＤＮＡを増幅させた。ABI PRISM（商標）310 Genetic Analyzer（ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネータｖ１．１サイクル・シーケンシング・キット、アプライドバイオシステムズ）によって、得られたＰＣＲ産物の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定に使用したプライマーの配列を表３に示す。
（９）ＢＭＰシグナル伝達についての細胞に基づいた阻害アッセイ
化合物のＡＬＫ２阻害活性を評価するために、Y. Katsuno et al., Oncogene, 27, 6322 (2008)に記載される通り、ルシフェラーゼリポーターアッセイを行った。ＢＭＰ反応性のＢＲＥリポーターの制御下でＦｌｕｃ（ホタル・ルシフェラーゼ）を発現し、同様に活性のあるＲｌｕｃ（ウミシイタケ・ルシフェラーゼ）を構成的に発現するレンチウイルスによって形質導入されたＭＤＡ−２３１−Ｄヒト乳癌細胞株である、ＭＤＡ−Ｄ−ＢＲＥＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃ細胞株をＢＭＰ−４又はＢＭＰ−６の存在下で化合物と共に培養した。２４時間の培養の後、ルシフェラーゼ活性（ホタル及びウミシイタケの双方）を測定した。相対的なＡＬＫ２活性をＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃとして表した。化合物の最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）を個々の化合物についての用量反応曲線から算出した。
（Ｂ）結果
上述の通り、センダイウイルス（ＳｅＶ）法によって４人のＦＯＰ患者と３人の健常者の皮膚由来の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を生成することを試みた。患者及び健常者の情報を以下の表４に示す。
３人の患者（Ｆ１〜Ｆ３）はＡＬＫ２の一般的な突然変異Ｒ２０６Ｈを有し、一人の患者は希な型の突然変異Ｇ３５６Ｄを有する（図５Ａ）。ＦＯＰの線維芽細胞からのｉＰＳ細胞コロニーの形成頻度は正常対照よりも顕著に低かった（図１Ａ及びＢ）。典型的(Typical)なコロニーは対照の培養（図１Ｃ左上）で主として認められた。一部典型的なコロニーが、ＦＯＰ由来の培養で検出された（図１Ｃ左下）。コロニーの中央だけがＡＰ陽性である（図１Ｃ右上）又はＡＰ陽性のコロニーが周辺にある（図１Ｃ右下）、異常(Atypical)なコロニーが検出された。結果として、形成したコロニーのほぼすべてが正常対照と比べて異常(Atypical)な形態を示した（図１Ｃ及びＤ）。単離されたコロニーは、平坦な形態となり急速に消失してしまい、数世代の継代にわたって培養し続けることはできなかった。
ＦＯＰでは、突然変異ＡＬＫ２は、構成的に活性のある形態を介してＢＭＰのシグナル伝達に機能不全を生じることが知られている（T. Fukuda et al., J Biol Chem 284, 7149 (2009); J. L. Fiori, P. C. billings, L. S. de la Pena, F. S. Kaplan, E. M. Shore, J Bone Miner Res 21, 902 (2006); E. M. Shore et al., Nat Genet 38, 525 (2006)）。本実施例では、ｉＰＳ細胞の形成及び維持に対するＡＬＫ２キナーゼ阻害剤の効果を調べた。ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤であるＬＤＮ−１９３１８９（ＬＤＮ）（P. B. Yu et al., Nat Med 14, 1363 (2008)）による処理は、用量依存的に、ｉＰＳ細胞のコロニー形成の回復を示した（図２Ａ）。ＡＬＫ２の別の阻害剤であるドルソモルフィン(Dorsomorphin)（G. D. Cuny et al., Bioorg Med Chem Lett 18, 4388 (2008)）もコロニー形成の効率を改善することができたが、ＬＤＮよりも低かった。ＬＤＮ処理はまた、線維芽細胞Ｆ４（Ｇ３５６Ｄ）からのｉＰＳ細胞の生成も改善したが、その効率は、Ｆ２（Ｒ２０６Ｈ）からのものより非常に低かった（図２Ａ）。
同様に、阻害剤は、ｉＰＳ細胞が自発的に分化するのを妨げるので、ｉＰＳ細胞は阻害剤の存在下で分化することなく、継続して維持することができる。ＬＤＮ及びドルソモルフィンの存在下で形成されたコロニーは典型的(typical)な形態を示した（図２Ｂ及び図５Ｂ）。さらに、個々のコロニーを採取し、ＬＤＮの存在下で維持し続けた。ネストＰＣＲによる増幅によりＳｅＶのＤＮＡ断片は検出されなかった（図２Ｃ）。この結果は、ＦＯＰ由来の各ｉＰＳ細胞株からＳｅＶが完全に除去されていることを示している。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫染色による解析によってＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株は、一連の多能性マーカーを発現していることが明らかとなった（図２Ｃ及びＤ）。しかしながら、培養液から阻害剤を取り除くと、コロニー形成が崩壊し、維持条件下でさえ細胞は直ちに分化し始めた（図２Ｅ及び図５Ｃ）。ＡＬＫ２の下流分子であるリン酸化されたＳｍａｄ１／５／８の免疫ブロット解析によって、ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞におけるＡＬＫ２キナーゼ活性が正常なｉＰＳ細胞におけるものより高いことが示された（図５Ｄ）。ＡＬＫ２キナーゼ活性の阻害は、Ｓｍａｄの脱リン酸化によって確認された（図５Ｄ及びＥ）。
次に、ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞からどんな種類の細胞が自発的に分化されるのかを調べた。対照の培養と比較して、分化を示す一連のマーカーが、ＡＬＫ２阻害剤無しで培養したＦＯＰ−ｉＰＳ細胞において発現し、発現の上昇が認められた（図２Ｆ及びＧ）。発現が上昇したマーカーは、それぞれ、ブラキュリ(Brachyury)とＭｅｓｐ１、及びＳｏｘ１７とＦｏｘａ２のような中胚葉と内胚葉のマーカーの双方を含む（S. Tada et al., Development 132, 4363 (2005); H. Sakurai et al., Stem Cells 24, 575 (2006)）。ＬＤＮなしで培養したＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株において栄養外胚葉のマーカーであるＣｄｘ２も上方調節された（H. Niwa et al. Cell 123, 917 (2005)）。それに対して、ネスチン(Nestin)のような神経外胚葉マーカーの発現レベルは阻害剤の非存在下でさえ変化しなかった（図２Ｇ）（Y. Takashima et al., Cell 129, 1377 (2007)）。ＬＤＮの非存在下で培養したｉＰＳ細胞は、ＬＤＮ存在下で培養したものより低いレベルで、Ｏｃｔ３/４（H. Niwa, J. Miyazaki, A. G. Smith, Nat Genet 24, 372 (2000)）及びNanog（K. Mitsui et al., Cell 113, 631 (2003)；I. Chambers et al., Cell 113, 643 (2003)）のような多能性マーカーを発現した（図２Ｇ）。マーカーの発現パターンは、維持条件で培養しても、ＦＯＰに由来するｉＰＳ細胞は、外胚葉ではなく中胚葉及び内胚葉双方に自発的に分化する傾向があることが示された。
ｉＰＳ細胞の形成に対するＡＬＫ２キナーゼの構成的な活性化の効果をさらに検討するために、誘導の間、どの時点でＡＬＫ２変異体がｉＰＳ細胞の形成を阻害するのかを決定した（図３Ａ）。８日目〜３０日目の期間で阻害剤による処理をした場合、最高数のＡＰ+コロニーが検出された（図３Ｂ及びＣ）。１日目〜３０日目の期間での処理は、８日目〜３０日目の処理よりも低いレベルの効率を示した。加えて、コロニー形成の効率は、１日目〜７日目のみ処理することによっては回復しなかった（図３Ｂ及びＣ）。次いで、８日目〜３０日目の期間を３つの期間、すなわち８〜１４日目と１５〜２１日目と２２〜３０日目に分け、各処理についてｉＰＳコロニーの数を測定した。意外にも、いずれの期間でもわずかなｉＰＳ細胞コロニーしか検出できなかった（図３Ｃ）。これらの結果は、ＦＯＰからのｉＰＳ細胞の形成には、ｉＰＳ細胞の誘導の最初の期間（７日目まで）ではなく、そのほかの期間（８日目〜３０日目）において変異ＡＬＫ２キナーゼの阻害が必要となることが示唆された。
ＤＮＡマイクロアレイの解析によって、ＬＤＮにより処理されたＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞とＬＤＮなしでのそれら細胞との間で全般的な遺伝子発現のパターンが異なることが示された（図４Ａ）。解析した５４，６７５の遺伝子の中で、１，４１７の遺伝子が、ＬＤＮなしで処理したｉＰＳ細胞クローンとＬＤＮで処理したｉＰＳ細胞クローンとの間で発現に２倍を超える差を示した（図６Ａ及びＢ）。中胚葉と内胚葉のマーカーの発現レベルがＬＤＮで処理したものよりＬＤＮなしで処理したｉＰＳ細胞で高いが、NestinやＳｏｘ１（Y. Takashima et al., Cell 129, 1377 (2007)）のような神経外胚葉マーカーはそうではないことを確認した（図４Ａ）。それに対して、ＬＤＮによる処理は、正常のｉＰＳ細胞株における分化マーカーの発現に影響しなかった（図４Ａ）。
ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤による処理によってｉＰＳ細胞がＦＯＰ線維芽細胞から生成でき、多能性を持って維持できたという結果により、本発明の方法によればＡＬＫ２キナーゼの阻害剤の候補をスクリーニングすることが可能となることが示された。
本実施例において、ＡＬＫ２の構成的な活性化がヒトのｉＰＳ細胞の形成と維持の双方を阻害することが証明された。キナーゼ活性を構成的な形態に変化させるＡＬＫ２キナーゼの突然変異はＦＯＰで常に認められ、ＡＬＫ２キナーゼの突然変異がこの疾患の原因であると考えられている（T. Fukuda et al, J Biol Chem 284, 7149 (2009); P. C. Billings et al., J bone Miner Res 23, 305 (2008); J. L. Fiori, P. C. Billings, L. S. de la Pena, F. S. Kaplan, E. M. Shore, J Bone Miner Res 21, 902 (2006); F. S. Kaplan et al., Hum Mutat 30, 379 (2009), A. B. Shafritz et al., N Engl J Med 335, 555 (1996); Q. Shen et al., J Clin Invest 119, 3462 (2009); E. M. Shore et al., Nat Genet 38, 525 (2006)）。本実施例において、ＢＭＰシグナルの構成的な活性化が、再プログラミングの初期段階を除いて、ｉＰＳ細胞の形成を阻害することが示された。１日目〜７日目の初期の期間では、ＢＭＰシグナル伝達の阻害は、正常対照からのｉＰＳ細胞の生成を抑制することが示されている。従って、再プログラミングを制御することにおけるＢＭＰシグナルの役割は、相互に関係する２つの側面を有し、一方は早期段階での再プログラミングを刺激し、もう一方は後期段階でそれを抑制する。
今までに、幾つかの研究によって、患者から確立されたｉＰＳ細胞が疾患の態様の一部を再現することができるだけでなく、より良い設計に使用し、先端医療からの成績を期待することもできることが報告されている（J. T. Dimos et al., Science 321, 1218 (2008); A. D. Ebert et al., Nature 457, 277 (2009); G. H. Liu et al., Nature 472, 221 (2011); M. C. Marchetto et al., Cell 143, 527 (2010); F. Soldner et al., Cell 136, 964 (2009)）。本実施例では、疾患の原因及び細胞内で生じるそれに続く現象がｉＰＳ細胞の形成を阻害するが、それらを取り除くことによってｉＰＳ細胞のコロニーの形成の効率性を改善することが証明された。従って、何故疾患に由来するｉＰＳ細胞の作出が上手く行かないかを検索することは、疾患の原因又は病態形成事象の手掛かりを見つけることに繋がる。
本実施例では、ＦＯＰにおいてｉＰＳ細胞の作出及び維持が不可能であることを利用して将来の治療法の新しい候補を見つけることができることも明らかとなった。ここで使用する系が常にＦＯＰの症状に関連するとは限らないが、ＡＬＫ２キナーゼに対する既知の阻害剤はＦＯＰからのｉＰＳ細胞の形成と維持の双方の効率を改善することができた。ＡＬＫ２阻害剤としての新しい化合物を探索することは、ＦＯＰの安定した治療法のための新しい薬剤を開発することに向けた第１段階である。この目的で、ここで提示した患者に由来する細胞モデルは、ＦＯＰを治療するための新しい化合物の発見をもたらす。本発明の方法は、疾患のメカニズムを理解するだけでなく、将来の治療法の新しい候補を見つけるための手段となる。
〔実施例２〕
本実施例は、酪酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｅ；ＮａＢ）を用いて、乳児型クラッベ(Krabbe)病患者由来の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を誘導した例である。
実施例１と同様にして、乳児型クラッベ病患者の皮膚試料から線維芽細胞を作製し、該線維芽細胞をセンダイウイルス（SeV）感染前日、６穴プレートに５×１０5細胞／ウェルとなるように播種した。該線維芽細胞にOct-3/4, Sox2, Klf4, cMycを発現するSeV を感染させて、翌日、培地(DMEM+10% FBS + 500uM酪酸ナトリウム)を交換し、以後毎日培地を交換した。ウイルス感染7日目に当該線維芽細胞を回収し、３．５×１０5細胞をマイトマイシン処理したマウス胎仔由来繊維芽細胞（MMC-MEF）上へ播種した。その翌日から、ヒト胚性幹細胞（hES細胞）培養培地 [ＤＭＥＭ/Ｆ１２ ＋ ２０％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）＋ ２ｍＭ Ｌグルタミン酸＋１００ｍＭ非必須アミノ酸＋１００ｍＭ ２-メルカプトエタノール ＋ ５ｎｇ/ｍＬ 塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor；ｂＦＧＦ)]に５００μＭの酪酸ナトリウム(ＮａＢ) を添加した試験群と、ＮａＢが添加されていない該hES細胞培養培地の無添加群とに分けて、それぞれ培地を交換した。以後感染１２日目までは１日置きに培地を交換した。感染１３日目からは、培地を５００ｕＭ酪酸ナトリウムが未添加のhES培養培地に変え、培地交換を開始し、以後毎日培地を交換した。感染２８日目に、実施例１に示す通り、アルカリフォスファターゼ染色によりｉＰＳ細胞コロニーを染色し、コロニー数を数え、ｉＰＳ細胞の誘導効率を測定した。その結果を図７に示す。
図７に示される通り、クラッベ病患者の線維芽細胞は、酪酸ナトリウムが添加されていない通常のｉＰＳ細胞誘導培地ではｉＰＳ細胞誘導効率が０％であるが、５００μＭの酪酸ナトリウム（ＮａＢ）を添加した場合にはｉＰＳ細胞誘導効率の回復（０．１６％）が見られた。即ち、本実施例により、本発明によれば、ｉＰＳ細胞の製造が困難であるクラッベ病患者に由来する細胞においてｉＰＳ細胞の誘導を促進する物質の選別が可能であることが示された。また、本発明によればｉＰＳ細胞の製造が困難であるクラッベ病患者に由来する細胞からｉＰＳ細胞を製造することも可能であることが示された。

Claims (16)

  1. 初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に罹患した個体に由来する細胞であって初期化遺伝子が導入された細胞を被験物質の存在下で培養し、前記細胞の人工多能性幹細胞への誘導を促進する被験物質を選別することを含む、物質のスクリーニング方法。
  2. 前記疾患がキナーゼの活性の変化に起因する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記疾患がアクチビン受容体様キナーゼ２の活性の変化に起因する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記疾患が進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はライソゾーム病である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記細胞がヒトの細胞である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記細胞が、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記細胞が、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 初期化遺伝子が、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記細胞が線維芽細胞である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. さらに、アクチビン受容体様キナーゼ２を阻害する被験物質を選別することを含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 上記疾患に対する治療剤をスクリーニングする方法である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 進行性骨化性線維異形成症又はライソゾーム病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
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