WO2015033447A1 - ユーイング肉腫非ヒトモデル動物 - Google Patents
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
Definitions
- the present invention relates to a non-human animal model of Ewing sarcoma.
- Ewing sarcoma is a malignant tumor that frequently occurs in the extremities and pelvis of children and young adults. It often develops as a small round cell sarcoma at the metaphysis of a long bone (Non-patent Document 1). Since the first case was reported in 1921 (Non-Patent Document 2), the origin of Ewing sarcoma has long been a mystery. Primitive neural crest cells, hematopoietic stem cells, muscle cells, and mesenchymal stem cells (MSC) have been considered to be developmental homes (Non-Patent Documents 3 and 4).
- EWS-ETS fusion is considered to be a genetic feature of human Ewing sarcoma (Non-Patent Documents 5 to 7).
- Ewing sarcoma has yet to be successful.
- EWS-FLI1 fusion gene When the EWS-FLI1 fusion gene is expressed in mouse ES cells or fetal fibroblasts, cell death is caused (Non-patent Document 8). When induced by mating with Mx1-Cre Tg mice, it is expressed in hematopoietic cells and induces leukemia. (Non-Patent Document 9).
- One object of the present invention is to provide an Ewing sarcoma animal model that can be an effective tool for searching and evaluating new therapeutic agents and novel biomarkers for Ewing sarcoma. It is a further object of the present invention to provide a means for creating an animal model of Ewing sarcoma.
- the inventors of the present application introduced an EWS-ETS fusion gene into a facial zone cell population separated from the epiphyseal layer of the long bone of a mouse fetus, and transplanted the cell population to a mouse.
- the inventors have found that a model of Ewing sarcoma can be created, and that the model can be used for screening of a therapeutic or prophylactic agent for Ewing sarcoma and for evaluating the Ewing sarcoma treatment or prevention effect of any compound, and thus completed the present invention.
- the present invention is intended to transplant a cell population obtained by introducing an EWS-ETS fusion gene into a facial zone cell population isolated from the epiphyseal surface layer of the long bones of a non-human animal embryo into a non-human animal.
- a method for producing a non-human animal model of Ewing sarcoma is provided.
- the present invention is characterized in that a cell population obtained by introducing an EWS-ETS fusion gene is transplanted into a facial zone cell population isolated from the epiphyseal surface layer of a long bone of a non-human animal embryo.
- the present invention provides a cell population obtained by introducing an EWS-ETS fusion gene into a facial zone cell population isolated from the epiphyseal surface layer of a long bone of a non-human animal embryo. Furthermore, the present invention provides a method for screening a compound effective for the treatment or prevention of Ewing sarcoma, which comprises administering a compound to the above-mentioned model animal of the present invention and examining whether or not sarcoma growth is suppressed. . Furthermore, the present invention provides a method for evaluating the Ewing sarcoma treatment or prevention effect of the compound, comprising administering the compound to the model animal of the present invention and examining whether or not the growth of sarcoma is suppressed.
- the present invention provides the first animal model of Ewing sarcoma.
- the model of the present invention is an effective tool for searching and evaluating new therapeutic agents for Ewing sarcoma.
- the present invention greatly contributes to the treatment of Ewing sarcoma.
- FIG. 1 Histological image of knee joint during development of mouse mouse dpcd18.5 embryo. The asterisk is the perisynovial region (PSR).
- B Mouse dpc 18.5 embryo femur (lightly stained with methylene blue). The positions of FZ, heel GP and diaphysis are shown in the figure.
- C A nude mouse transplanted with EZ-FLI1-introduced FZ cells to form a tumor.
- D Histological image of Ewing sarcoma in a mouse (H & E staining). The left figure is low magnification and the middle figure is high magnification.
- FZ FZ cells before infection with ⁇ retrovirus
- FZ-EF 48h FZ cells 48 hours after retrovirus infection
- mES Subcutaneous tumor sample that proliferated as Ewing sarcoma in mice (numbered as sample No.).
- C Venn diagram for genes that were commonly up-regulated or down-regulated among mouse Ewing sarcoma, human Ewing sarcoma, and human neuroblastoma species.
- D Results of confirmation of the expression of nerve-related genes in mouse Ewing sarcoma by RT-PCR. Lane is the same as (B).
- Gfra2 The expression of Gfra2, Ncan, Mycn, Ntrk1, Syt1, Syt13, Aplp1, Bex1, Dbh, xNrxn1, Ntrk3, Sv2a, Syngr1, Synj1, Syp and Ddc genes is upregulated in EZ-FLI1 in FZ cells. It was.
- the Hprt gene was used for confirmation of RNA quantity and quality. It is a histological image of an early neoplastic lesion of mouse Ewing sarcoma 3 weeks after transplantation. (A) H & E stained image. (B, C and D) FLAG and BrdU immunofluorescence evaluation.
- EWS-FLI1 FLAG
- E and F Further differentiation into the cartilage lineage from the heel to the margin is indicated by the expression of collagen 10 or S100. Characterization of FZ cells and modulation of gene expression profile after EWS-FLI1 introduction.
- A Gene whose expression is different between FZ and GP (left). RT-PCR analysis on the expression of Erg, Fli1, Pthrp, Lubricin, Sox9, Col2a1, Gdf5, Col10a1, Nanog, Oct4 and Sox2 genes in PSR, FZ and GP cells (right).
- C Schematic showing the sensitivity of PSR, FZ and GP cells to Ewing sarcoma initiation.
- A Selection of gene sets for Wnt / ⁇ -catenin pathway, EGF pathway and receptor tyrosine kinase activity, FZ and GP (left and center) transfected with EWS-FLI1, and FZ / EWS-FLI1 and others It is the result of gene setrichenrichment analysis (GSEA) during (right).
- GSEA gene setrichenrichment analysis
- B Real-time quantitative RT-PCR results of Dkk2, Dkk1, Wif1, Prkcb1, Flt4, and Musk genes at 0 hours or 48 hours after introduction in FZ cells or GP cells with or without EWS-FLI1 introduced.
- C Knockout of EWS-FLI1 transgene by Cre / loxp.
- EWS-FLI1 retrovirus introduced with LoxP induced Ewing sarcoma (left), and Cre expression significantly suppressed colony formation (right).
- D Aging-like morphology was induced by knockout of EWS-FLI1 (left). Aging-related heterochromatin region (middle). Senescence-related ⁇ -galactosidase expression (right).
- E Inhibition of cell proliferation by knockdown of FLI1 gene and important pathway genes. The relative tumor cell growth 48 hours after siRNA treatment was calculated by comparing the number of each cell with cells treated with control siRNA (left). Gene knockdown was confirmed by immunoblotting (FLI1, Catnb, Ezh2 and Prkcb1) or RT-PCR (Dkk2) (right).
- facial zone cells are bones of long bones in the late fetal stage of a non-human animal fetus (16.5 to 19.5 dpc (days after intercourse) in the case of mice) It refers to cells that make up about 2 to 3 surface layers at the end. Cells in this zone are thought to be embryonic bone / chondrogenic progenitor cells. Erg gene and Gdf5 gene are expressed (FIGS. 4 and 5).
- Facial zone cells can be obtained by removing long bones from a non-human fetus in the late embryonic period (16.5 to 19.5 dpc in the case of mice) and excising the surface layer (about 1 mm) of the epiphysis with a scalpel under a microscope. it can. The epiphyseal surface layer is cut out and gently digested with collagenase or the like for several hours to separate the cells.
- This is a facial zone cell population, immediately subjected to EWS-ETS fusion gene introduction treatment, and then cultured in a growth medium (such as IMDM) supplemented with fetal calf serum for a short period (about 24 to 48 hours). What is necessary is just to use for the transplant to a human animal.
- IMDM fetal calf serum
- the boundary between the facial zone and the growth plate is vague and difficult to distinguish clearly, and when cutting about 1 mm of the epiphyseal surface layer as described above, usually GP cells Also partially mixed.
- GP cells are partially mixed.
- the cells are collected by cutting out the surface layer of the epiphyseal part of the late fetal long bone at about 1 mm, most of them are facial zone cells. It is not necessary to select and concentrate only facial zone cells from the population.
- the “facial zone cell population” in the present invention means 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and still more preferably 80% of facial zone cells expressing the Erg gene and Gdf5 gene. It refers to a cell population that occupies the above, and may include other cells such as GP cells.
- the facial zone cells are characterized in that the Erg gene and the Gdf5 gene are expressed. Therefore, when selecting and enriching the facial zone cells from the facial zone cell population, at least the Erg gene and the Gdf5 gene are used. What is necessary is just to select the cell which can confirm that either is expressing.
- the EWS-ETS fusion gene is a fusion gene generated by chromosomal translocation between the EWSR1 gene and a gene encoding an ETS family transcription factor, and is regarded as a genetic characteristic of Ewing sarcoma.
- EWS-ETS fusion genes identified in Ewing sarcoma cases include those shown in Table 1 below.
- the type of EWS-ETS fusion gene is not particularly limited, and any of them may be used.
- Ewing sarcoma models are created using the EWS-FLI1 gene and the EWS-ERG gene as representative examples, but the present invention is not limited to these specific examples.
- RNA is extracted from lesion cells collected from patients with Ewing sarcoma, synthesized from RNA samples with poly A by reverse transcription, and the target fusion gene cDNA is amplified. It can be obtained by amplifying by PCR using specific primers designed as possible.
- the technique of extracting RNA from cells and synthesizing the cDNA of the target gene is a well-known conventional method, and kits and reagents for carrying out each step are commercially available.
- EWS-ETS fusion protein typically has a structure in which the DNA binding region (DNA binding domain; DBD) of the ETS family transcription factor is fused to the C-terminal side of the activation domain of EWSR1.
- PCR is carried out using cDNA prepared from Ewing sarcoma cell RNA as a template, it can be obtained by amplifying the cDNA of the EWS-ETS fusion gene.
- EWS-ETS fusion genes CDNA sequences of various EWS-ETS fusion genes are known and registered in databases such as NCBI GenBank.
- SEQ ID NOs: 1 and 2 in the Sequence Listing are EWS-FLI1 sequences
- SEQ ID NOs: 3 and 4 are EWS-ERG sequences
- SEQ ID NOs: 5 and 6 are EWS- The sequence of E1AF (GenBank U35622.2) is shown.
- SEQ ID NOs: 7 and 8 describe the cDNA sequences of ETV1 (U17163) and FEV (NM_017521), which are EWS fusion partners, respectively.
- EWS-FLI1 fusion gene in addition to the sequence described in SEQ ID NO: 1, sequences registered in GenBank with the accession numbers of JF290489.1, JF290490.1, AF327066.1, etc. are also known. Yes.
- the cDNA sequence of the EWS-ETS fusion gene used in the present invention is not limited to the specific examples described in the sequence listing, and such variants can also be used.
- Methods for introducing foreign genes into animal cells are well known, and examples include electroporation, lipofection, and viral vector methods.
- the viral vector method can be preferably used.
- retroviral vectors used for gene introduction into animal cells include retroviruses, lentiviruses, adeno-associated viruses, and the like.
- retroviral vectors are particularly advantageous in terms of sustained foreign gene expression because the target gene can be integrated into the genome of the host cell.
- a retroviral vector can be preferably used for introduction of the EWS-ETS fusion gene into FZ cells in the present invention.
- the gene transfer method using a viral vector is an established method in this field.
- Various viral vector systems are known, including retroviruses, and kits and reagents for such systems are commercially available. Introduction of the EWS-ETS fusion gene into FZ cells can be performed using such a known viral vector system.
- retroviral vector gene introduction can be performed as follows. That is, first, recombinant retroviral DNA is prepared by incorporating EWS-ETS fusion gene cDNA into retroviral expression plasmid DNA.
- the retrovirus expression plasmid can be introduced into appropriate packaging cells (cells into which the gag, pol, and env genes encoding retrovirus structural proteins have been introduced) by a method such as the calcium phosphate method.
- the retroviral expression plasmid can be introduced simultaneously with the plasmid DNA expressing the retroviral structural protein into a suitable host cell that is not a packaging cell.
- infectious recombinant retroviral particles containing the EWS-ETS fusion gene are produced in the culture supernatant.
- the culture supernatant is recovered to obtain a recombinant retrovirus solution, which is mixed with the FZ cell population prepared as described above, the recombinant retrovirus solution, and an appropriate gene transfer promoting reagent such as polybrene or retronectin and incubated.
- the FZ cell population can be infected with the recombinant retrovirus.
- virus infection may be performed in a state where the mixture containing the FZ cell population and virus solution is centrifuged for several hours (spin infection).
- spin infection As described above, an EWS-ETS fusion gene is introduced, and an FZ cell population expressing the fusion gene can be obtained.
- the infection efficiency (gene transfer efficiency) of the recombinant virus is, for example, the fluorescence from the fluorescent protein when a recombinant retrovirus designed to incorporate a fluorescent protein gene such as GFP into the genome of the FZ cell population is used. Can be examined by detecting by flow cytometry or the like.
- the expression of the EWS-ETS transgene in the FZ cell population can be confirmed by measuring the mRNA of the EWS-ETS gene by real-time PCR, Northern blotting or the like.
- EWS-ETS gene is introduced so that the EWS-ETS protein is expressed with a tag such as FLAG added, an immunological assay using antibodies against the tag sequence (Western blotting, immunity of cell specimens) It is also possible to confirm by staining etc.).
- An Ewing sarcoma model animal can be obtained by transplanting the FZ cell population into which the EWS-ETS fusion gene has been introduced subcutaneously into a non-human animal. If FZ cell population of gene transfer efficiency is about 10%, it may be transplanted 10 about four or more cells. The transplanted EWS-ETS-introduced FZ cell population develops as Ewing sarcoma in the recipient body.
- the EWS-ETS-introduced FZ cell line has the same genetic characteristics as human Ewing sarcoma, and the mass produced by the growth of the cell line in the recipient body is both morphologically and genetically. The fact that it has the same characteristics as human Ewing sarcoma is confirmed in detail in the following examples.
- the type of non-human animal to be transplanted with the EWS-ETS-introduced FZ cell population is not particularly limited, and may be any mammal other than human, but an immunodeficient animal that is usually used in transplantation experiments for tumor cells, etc. It can be preferably used. Among various mammals including mice, immunodeficient animals that can be used for transplantation experiments are known, and any of them can be preferably used in the present invention.
- the animal species from which the EWS-ETS-introduced FZ cells to be transplanted are derived from the animal species to be transplanted may be the same or different, but are usually preferably the same.
- the Ewing sarcoma model non-human animal of the present invention is very useful as a tool for searching and evaluating a novel therapeutic drug for Ewing sarcoma.
- an EWS-ETS-introduced FZ cell population is contacted with a compound in vitro, and a compound showing inhibition of cell proliferation is screened in vitro.
- the selected compound is administered to the model animal of the present invention to examine whether the growth of Ewing sarcoma in the model body is suppressed.
- a compound that suppresses the growth of Ewing sarcoma in vivo can be selected as a candidate substance for a therapeutic agent for Ewing sarcoma.
- the model animal of the present invention can be used for screening a compound effective for the treatment or prevention of Ewing sarcoma from the compound group.
- any compound can be used to evaluate the therapeutic or prophylactic effect of Ewing sarcoma. If the growth of sarcoma is suppressed in the model animal body to which any compound is administered, it can be evaluated that the compound has a therapeutic or prophylactic effect, particularly a therapeutic effect, on Ewing sarcoma. The high therapeutic or prophylactic effect of the compound can also be evaluated according to the degree of growth inhibition.
- FZ FZ cells
- GP growth plate
- PSR perisynovial region
- head or trunk embryonic mesenchymal cells were also prepared from the same embryo. Each region was collected and gently digested with 2 mg / mL collagenase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. for 2 hours.
- the infected cells were cultured for a short period in a growth medium consisting of Iscove's Modified Dulbecco's Medium (Invitrogen) supplemented with 15% fetal calf serum.
- EWS-FLI1 full-length cDNA (May WA et al. 1993. Mol Cell Biol 13 (12): 7393-7398) was obtained from Dr. Susanne Baker. The base sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
- EWS-ERG cDNA (SEQ ID NO: 2) was obtained by cloning from a human EWS-ERG positive Ewing sarcoma case as follows.
- EWS-ERG positive Ewing sarcoma tumors were passaged as cultured cell lines.
- PolyA + RNA was prepared from 1 ⁇ 10 7 cultured cells using FastTrack II kit from Invitrogen. Using 0.1 ⁇ g of RNA, cDNA was synthesized with the ImpromII cDNA synthesis kit from Promega.
- EWS FL5 CCGACATGGCGTCCACGGATTAC, SEQ ID NO: 9
- ERG FL3H AAGCTTTAGTAGTAAGTGCCCAGATG, SEQ ID NO: 10
- EWS-FLI1 and EWS-ERG added with N-terminal FLAG were incorporated into the retroviral vector pMYs-IRES-GFP.
- Plat-E packaging cells Morita S et al., 2000. Gene Ther. 7: 1063-1066.
- PMYs-EWS-FLI1, which incorporates EWS-FLI1, and pMYs-EWS-ERG which incorporates EWS-ERG were introduced.
- Lipofectamine 2000 invitrogen was used as a gene introduction reagent.
- a retrovirus solution (culture supernatant of the gene-introduced Plat-E cells) was collected. Fetuses were removed from the pregnant mice, and each cell cage (FZ, GP, Shaft, Trunk, Head) was collected as described above, and immediately infected with retrovirus. Specifically, each cell, the above-mentioned retrovirus solution and 6 ⁇ g / ml polybrene® (Sigma) were mixed, seeded on a culture dish, and centrifuged at 800 ⁇ g per culture dish for 2 hours to infect the virus (spin infection). The infection efficiency was examined using a FACSCalibur flow cytometer (Beckton Dickinson).
- the cells were mixed with growth factor reduced Matrigel (Beckton Dickinson) and transplanted subcutaneously into Balb / c nude mice. Mice after transplantation were observed daily to check tumor formation and general condition. When the subcutaneous mass reached 15 mm in diameter, the tumor was removed and subjected to further experiments. Some of the tumors (1 x 10 5 cells) was continuously injected into or tail vein implanted subcutaneously in nude mice was confirmed tumorigenicity and metastatic activity. Animals were handled according to the guidelines of the Animal Experiment Committee of the Cancer Research Society, and the study was approved by the committee.
- the following primary antibodies were used: anti-BrdU (Beckton Dickinson), anti-mouse CD99 (transferred from Dr. Dietmar Vestweber), anti-Col2a (Millipore), anti-S100 (Dako), anti-Col10 (LSL) Anti-CD57 (Sigma), anti-NGFR (Millipore), anti- ⁇ -catenin (Beckton Dickinson).
- the immunofluorescence images were taken using a Zeiss LSM 710 laser scanning microscope (uses 40x (Zeiss) objective) and LSM Software ZEN 2009 (Zeiss).
- RT-PCR and real-time quantitative RT-PCR Total RNA extraction, reverse transcription, and RNA quantification were performed as previously reported (Kawamura-Saito et al. 2006. Hum Mol Genet 15: 2125-2137.). RT-PCR and real-time quantitative RT-PCR were performed as usual using Gene Amp 9700 thermal cycler (Applied Biosystems) and 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems), respectively. The oligonucleotide primer sequences used are shown in Tables 2-1 to 2-3 below.
- Microarray analysis Gene expression profiles were examined by GeneChip analysis. The per cell normalization method was applied to the FZ sample and GP sample (Kanno J et al. 2006. BMC Genomics 7: 64.). Briefly, it is as follows. Cell lysate was prepared using RLT buffer (QIAGEN). After adding RNA cocktail to the cell lysate according to the amount of DNA, total RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). The aRNA probe generated from FZ cells, GP cells and mouse Ewing sarcoma tissue was hybridized to mouse Genome 430 2.0 Array (Affymetrix).
- Chromatin immunoprecipitation A total of 5 ⁇ 10 6 cells per immunoprecipitation were cross-linked with 10% formaldehyde for 10 minutes at room temperature. Histone immunoprecipitation was performed using anti-histone antibodies H3K9 / K14Ac, H3K4 / me3, H3K27 / me3, total H3 (Cell Signaling Technologies) or H3K9 / me3 (Millipore) previously bound to G protein magnetic beads. The immunoprecipitated DNA was amplified with primers specific to each region (Table 4 below).
- siRNA interference experiment siRNA for knockdown of FLI1, Dkk2, Catnb, Prkcb1 and Ezh2 (sequences are SI04156152, SI04358375, SI00979629, SI00979636, SI00942046, SI00942060, SI01388646, SI01388653, SI00997801 and SI00997808) were purchased from QIAGEN .
- SiRNA was introduced into mouse Ewing sarcoma cells according to the manufacturer's protocol. The knockdown efficiency was confirmed by Western blotting using anti-FLAG, anti- ⁇ -catenin, anti-Ezh2 (Cell Signaling Technologies), anti-PKC ⁇ 1 (Santa Cruz Biotechnology), or RT-PCR.
- Mouse Ewing sarcoma cells prepared by transducing EZ-FLI1 into FZ cells were treated with MEK1 inhibitor U0126 (Cell Signaling Technologies) in vitro.
- Mouse and human Ewing sarcoma cell lines can be obtained in vitro and in vivo using Wnt / ⁇ -catenin inhibitors iCRT14 and PNU74654 (Tocris Bioscience), EZH2 inhibitor DZNeP (Cayman Chemical), or PARP1 inhibitor Olaparib (Selleckchem).
- Wnt / ⁇ -catenin inhibitors iCRT14 and PNU74654 Tocris Bioscience
- EZH2 inhibitor DZNeP Cayman Chemical
- PARP1 inhibitor Olaparib Selleckchem
- Cell cycle assay A single cell suspension was permeabilized with 0.1% triton X-100 solution in PBS and 50 mg / ml propidium iodide and 1 mg / ml RNAse A were added. Thereafter, the cell suspension was analyzed using a FACScalibur flow cytometer and Modifit software (Becton Dickinson).
- EWS-ETS expression was confirmed by immunoblotting and immunostaining of FLAG-tagged protein (data not shown).
- Mic2 / CD99 Ambros IM et al. 1991. Cancer 67: 1886-1893.
- a surface marker of human Ewing sarcoma was detected locally (data not shown).
- the Cd99 gene sequence is only partially conserved between human and mouse (Bixel G et al. 2004. Blood 104: 3205-3213.), And the role of Cd99 as a specific marker for mouse ES is still being evaluated. Not.
- transduced FZ cells were able to produce Ewing sarcoma with as little as 1 ⁇ 10 4 injections.
- the EWS-FLI1-introduced GP fraction, bone stem fraction and PSR fraction required 1 ⁇ 10 6 cells for tumor development. This clearly shows that the cells of origin of Ewing sarcoma are highly enriched in the FZ fraction.
- EWS-FLI1 is introduced into embryonic mesenchymal cells purified from the mouse head or trunk, the incidence of small round cell sarcomas is low (Fig. 1E, F), and fibrosarcoma-like tumors are also obtained. (Data omitted).
- Mouse Ewing sarcoma has the same gene expression profile as human Ewing sarcoma and neuroblastoma. Ewing sarcoma, malignant fibrous histiocytoma, mucinous liposarcoma, synovial sarcoma, The expression profiles of a series of human tumors including osteosarcoma, neuroblastoma and chondrosarcoma were compared. According to unsupervised clustering using a common gene set (23,860 probe set) between mice and humans, mouse Ewing sarcoma was very similar to human Ewing sarcoma and neuroblastoma (FIG. 2A). These results show a close relationship between this model and human Ewing sarcoma.
- EWS-FLI1 was able to induce neuroblastoma-like small round cell sarcoma morphology from osteochondral progenitor cells.
- a common up-regulated gene was present in mouse and human Ewing sarcomas.
- known EWS-FLI1 targets such as Ezh2, Id2 and Ptpn13 genes (Richter GH et al. 2009. Proc Natl Acad Sci USA 106: 5324-5329 .; Nishimori H et al. 2002. Oncogene 21: 8302 -8309 .; Abaan OD et al. 2005.
- Oncogene 24: 271-2722. was found to be up-regulated in both mouse and human Ewing sarcoma. Furthermore, targets of EWS-FLI1 such as Nkx2.2, Nr0b1, Gstm4, Polr2g, Tert, Tnc and Upp1 genes (Smith R et al. 2006. Cancer Cell 9: 405-416 .; Kinsey M et al. 2006. Mol Cancer Res 4: 851-859 .; Luo W et al. 2009. Oncogene 28: 4126-4132 .; Petermann R et al. 1998. Oncogene 17: 603-610 .; Fuchs B et al. 2004. Clin Orthop Relat Res.
- the staining was basically localized in the nucleus at the center of the initial tumor lesion (Figure 3C). Nuclear localization of EWS-FLI1 fusion protein has been confirmed in many types of cells (Honsei N et al. 2006. Int J Oncol 29: 689-693.), And localization to the cytoplasm in differentiated cells is This suggests that EWS-FLI1 elimination from the nucleus exists as a suppression mechanism in the tumorigenesis process of Ewing sarcoma. These results also suggest that EWS-FLI1 expression itself is insufficient for complete tumor formation. Furthermore, more differentiated chondrocytes positive for type 10 collagen or S100 were observed in the peripheral region (FIGS. 3E, F). These findings indicate that EWS-FLI1 expression is not sufficient for complete tumor formation.
- Osteochondral progenitor cells are enriched in the FZ cell fraction During the process of osteochondral differentiation, FZ cells are immature and migrate towards more differentiated GP regions (Vortkamp A et al. 1996. Science 273: 613-622.).
- FZ cells show a characteristic profile of immature chondrogenic progenitor cells including Sox9, Col2a1, Pthrp (Pthlh) and Lubricin (Prg4) genes (FIG. 4A), and have been reported (Iwamoto M et al.
- GP cells showed a gene expression profile of chondrocytes with a higher degree of differentiation as represented by the Col10a1 gene (FIG. 4A). Nanog, Oct4 and Sox2 genes expressed in many immature cell lines were enriched in PSR, but were hardly or not expressed in FZ and GP. Furthermore, in contrast to embryonic somatic stem cells, FZ cells lacked MSC surface markers such as Sca1, CD34, CD44 and CD105 (data not shown).
- FIG. 5B shows a graph of the results of examining gene expression in PSR, FZ and GP cells (FIG. 5A) collected by laser microdissection by real-time quantitative RT-PCR.
- the expression of Erg, Gdf5, Pthlh and Prg4 genes was significantly higher in FZ cells than PSR and GP.
- These four genes are expressed only in the surface layer of articular cartilage in other mesenchymal tissues.
- Erg and Gdf5 are not expressed in the surface layer of the articular cartilage of adults, but are expressed only in the surface layer of the articular cartilage of the embryo. It is known that Erg and Gdf5 gene expression is one of the characteristics of FZ cells.
- FZ cells showed remarkable osteogenic and chondrogenic differentiation potentials, but lacked the ability to differentiate into adipose lineage.
- MSC showed a typical multilineage differentiation pattern (FIG. 4B).
- FZ cells could not differentiate into muscle lineage or nerve lineage (data not shown).
- EWS-FLI1 responsive gene and chromatin modification in FZ cells Assuming that there are strict restrictions on the origin of mouse Ewing sarcoma, the relationship between tumor matrix cells and EWS-FLI1 mutations is important. Therefore, gene expression profiles in the presence or absence of EWS-FLI1 were compared between FZ cells and GP cells. Most of the known EWS-FLI1 target genes (Ordonez JL et al. 2009. Cancer Res 69: 7140-7150.) Were up-regulated in FZ cells after introduction of EWS-FLI1 (data not shown). EWS-FLI1 encodes an abnormal transcription factor (Smith R et al. 2006. Cancer Cell 9: 405-416 .; Ordonez JL et al. 2009.
- Dkk2 gene was similar between FZ cells and GP cells, and up-regulation of Dkk2 gene was induced only in FZ cells by introduction of EWS-FLI1 gene (FIG. 6B). Increased expression of Wif1 gene was observed in FZ but not in GP, and its expression was maintained after EWS-FLI1 gene introduction. Furthermore, the gene set for EGF pathway and receptor protein kinase activity was enriched (FIG. 6B).
- the Prkcb gene is a downstream gene of EWS-FLI1 (Dohjima T et al. 2000. Br J Cancer 82: 16-19.) And is originally expressed at a higher level than GP in FZ.
- EWS-FLI1 the EWS-FLI1 gene into FZ.
- the Flt4 / Vegfr3 and Musk genes important for vascular and neuromuscular signal transduction were also identified as EWS-FLI1-responsive genes (FIG. 6B).
- the Dkk2 gene is a member of the dickkopf family protein. As modulators of the Wnt / ⁇ -catenin pathway, this family plays an important role in bone and cartilage development and homeostasis (Niehrs C. 2006. Oncogene 25: 7469-7481.). According to previous studies, knocking down the EWS-FLI1 gene in Ewing sarcoma cells down-regulates the DKK2 gene, but the reverse response has been observed for the DKK1 gene (Miyagawa Y et al. 2009. PLoS One) 4: e4634.).
- ⁇ -catenin protein was evaluated. ⁇ -catenin expression was increased by transiently introducing the EWS-FLI1 gene into FZ cells (data not shown). As described above, mouse Ewing sarcoma can be continuously transplanted into syngeneic mice and has a high proliferation ability. Increased expression of ⁇ -catenin was frequently observed in the infiltrated areas of secondary tumors (data not shown), suggesting that this pathway may play a role in tumor maintenance and / or malignant progression.
- the ⁇ -catenin inhibitors iCRT14 and PNU74654 significantly suppressed the proliferation of both mouse and human Ewing sarcoma cells in vitro, and the EZH2 inhibitor DZNeP moderately but significantly suppressed proliferation ( Figure 7A).
- Olaparib GarnettbMJ et al. 2012. Nature 483: 570-575.
- a PARP1 inhibitor that has been reported to specifically inhibit Ewing sarcoma, also suppressed Ewing sarcoma in both mice and humans ( Figure 7A).
- iCRT14 and DZNeP showed an increase in G1 population and a decrease in G2 / M population, confirming cell cycle arrest (FIG. 7B).
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Abstract
要約 ユーイング肉腫の新規治療剤や新規バイオマーカー等の探索及び評価に有効なツールとなり得る、ユーイング肉腫の動物モデルが開示されている。本発明のユーイング肉腫非ヒトモデル動物は、非ヒト動物胚の長管骨の骨端部表層から分離されたフェイシャルゾーン細胞集団にEWS-ETS融合遺伝子を導入してなる細胞集団を、非ヒト動物に移植することにより作出される。該モデルは、ユーイング肉腫の新規治療剤の探索及び評価に有効なツールである。本発明は、ユーイング肉腫の治療に大いに貢献する。
Description
本発明は、ユーイング肉腫非ヒトモデル動物に関する。
ユーイング肉腫は、小児や若年成人の四肢、骨盤に好発する悪性腫瘍である。長骨の骨幹端で小円形細胞肉腫として発達することが多い（非特許文献１）。1921年に最初の症例が報告（非特許文献２）されて以来、ユーイング肉腫の起源は長い間謎である。原始神経堤細胞、造血幹細胞、筋肉細胞及び間葉系幹細胞（MSC）が発生母地ではないかと考えられてきた（非特許文献３、４）。その後、第22番染色体上のEWSR1と、FLI1やERG等のETSファミリー転写因子をコードする遺伝子との間での染色体転座に関連する遺伝子融合が同定された。現在ではEWS-ETS融合がヒトのユーイング肉腫の遺伝学的特徴と考えられている（非特許文献５～７）。
ユーイング肉腫発生の初期から進展に至る多段階のプロセスを経時的に観察・解析できる動物モデルを確立できれば、発がん予防の標的因子の同定や、診断に有用なバイオマーカーの特定、治療剤の開発に貢献できる。しかしながら、ユーイング肉腫の動物モデルは未だ成功例がない。EWS-FLI1融合遺伝子をマウスES細胞や胎仔線維芽細胞で発現すると細胞死を引き起こし（非特許文献８）、Mx1-Cre Tgマウスとの交配で発現誘導すると、造血細胞に発現して白血病を誘発する（非特許文献９）。また、変異型p53胎仔マウスの間葉系組織にEWS-FLI1を発現させると、未分化肉腫は形成されるが、ユーイング肉腫としての特徴づけは充分ではない（非特許文献１０）。
Bernstein M et al. 2006. Oncologist 11: 503-519.
Ewing J. 1921. Proc New York Pathol Soc 21: 17-24.
Hu-Lieskovan S et al. 2005. Cancer Res 65: 4633-4644.
Tirode F et al. 2007. Cancer Cell 11: 421-429.
Delattre O et al. 1992. Nature 359: 162-165.
Zucman J et al. 1993. EMBO J 12: 4481-4487.
Sorensen PH et al. 1994. Nat Genet 6: 146-151.
Deneen B et al., 2001. Oncogene 20: 6731-6741
Torchia E et al., 2007. Mol. Cell. Biol. 27: 7918-7934
Lin PP et al., 2008. Cancer Res. 68: 8968-8975
本発明の１つの目的は、ユーイング肉腫の新規治療剤や新規バイオマーカー等の探索及び評価に有効なツールとなり得る、ユーイング肉腫の動物モデルを提供することである。本発明のさらなる目的は、ユーイング肉腫の動物モデルを作出する手段を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、マウス胎仔の長管骨の骨端部の表層から分離したフェイシャルゾーン細胞集団にEWS-ETS融合遺伝子を導入し、該細胞集団をマウスに移植することにより、ユーイング肉腫のモデルを作出できること、該モデルがユーイング肉腫の治療又は予防剤のスクリーニングや任意の化合物のユーイング肉腫治療又は予防効果の評価に使用可能であることを見出し、本願発明を完成した。
すなわち、本発明は、非ヒト動物胚の長管骨の骨端部表層から分離されたフェイシャルゾーン細胞集団にEWS-ETS融合遺伝子を導入してなる細胞集団を、非ヒト動物に移植することを含む、ユーイング肉腫非ヒトモデル動物の作出方法を提供する。また、本発明は、非ヒト動物胚の長管骨の骨端部表層から分離されたフェイシャルゾーン細胞集団にEWS-ETS融合遺伝子を導入してなる細胞集団が移植されていることを特徴とする、ユーイング肉腫非ヒトモデル動物を提供する。さらに、本発明は、非ヒト動物胚の長管骨の骨端部表層から分離されたフェイシャルゾーン細胞集団にEWS-ETS融合遺伝子を導入してなる細胞集団を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のモデル動物に化合物を投与し、肉腫の増殖が抑制されるか否かを調べることを含む、ユーイング肉腫の治療又は予防に有効な化合物のスクリーニング方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のモデル動物に化合物を投与し、肉腫の増殖が抑制されるか否かを調べることを含む、前記化合物のユーイング肉腫治療又は予防効果の評価方法を提供する。
本発明により、ユーイング肉腫の動物モデルが初めて提供された。本発明のモデルは、ユーイング肉腫の新規治療剤の探索及び評価に有効なツールである。本発明は、ユーイング肉腫の治療に大いに貢献する。
本発明において、フェイシャルゾーン細胞（以下、FZ細胞と略記することがある）とは、非ヒト動物胎仔の胎生後期（マウスの場合は16.5～19.5dpc（性交後日数））の長管骨の骨端部の表層２～３層程度を構成する細胞をいう。このゾーンの細胞は、胎生期の骨・軟骨形成前駆細胞と考えられる。Erg遺伝子及びGdf5遺伝子が発現していることを特徴とする（図４、５）。
フェイシャルゾーン細胞は、胎生後期（マウスの場合は16.5～19.5dpc）の非ヒト動物胎仔から長管骨を取り出し、顕微鏡下で骨端部の表層部分（約1mm）をメスで切り出して得ることができる。骨端部表層部分を切り出し、コラゲナーゼ等で数時間程度穏やかに消化して細胞を分離させる。これをフェイシャルゾーン細胞集団とし、直ちに、EWS-ETS融合遺伝子導入処理に付した後、ウシ胎仔血清を添加した増殖培地（IMDMなど）で短期間（２４時間～４８時間程度）培養したものを非ヒト動物への移植に用いればよい。
胎仔期の骨ではフェイシャルゾーンと成長板（growth plate; GP）の境界が曖昧ではっきり区別することが困難であり、上記のようにして骨端部表層の1mm程度を切り出すと、通常はGP細胞も一部混入する。しかしながら、いずれの非ヒト動物においても、胎生後期の長管骨の骨端部の表層約1mmの部分を切り出して細胞を回収すれば、そのうちの大多数がフェイシャルゾーン細胞であるので、回収した細胞集団から特にフェイシャルゾーン細胞のみを選別、濃縮して用いる必要はない。
従って、本発明における「フェイシャルゾーン細胞集団」とは、Erg遺伝子及びGdf5遺伝子を発現しているフェイシャルゾーン細胞が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上を占める細胞集団をいい、GP細胞等の他の細胞も含むものであってよい。
なお、上記の通り、フェイシャルゾーン細胞はErg遺伝子及びGdf5遺伝子が発現していることを特徴とするので、フェイシャルゾーン細胞集団からフェイシャルゾーン細胞を選別、濃縮する場合は、Erg遺伝子及びGdf5遺伝子の少なくともいずれかが発現していることが確認できる細胞を選別すればよい。
EWS-ETS融合遺伝子は、EWSR1遺伝子とETSファミリー転写因子をコードする遺伝子との間で染色体転座により生じる融合遺伝子であり、ユーイング肉腫の遺伝学的特徴とされている。これまでに、ユーイング肉腫症例において同定されているEWS-ETS融合遺伝子としては、下記表１に示すものが挙げられる。本発明では、EWS-ETS融合遺伝子の種類は特に限定されず、いずれを使用してもよい。下記実施例では、EWS-FLI1遺伝子及びEWS-ERG遺伝子を代表例として用いてユーイング肉腫モデルを作出しているが、これらの具体例に限定されるものではない。
EWS-ETS融合遺伝子のcDNAは、ユーイング肉腫患者から採取された病巣部細胞からRNAを抽出し、ポリA付加したRNAサンプルから逆転写反応によりcDNAを合成し、目的とする融合遺伝子のcDNAを増幅できるように設計した特異的プライマーを用いてPCRにより増幅させることで得ることができる。細胞からRNAを抽出し、目的遺伝子のcDNAを合成する手法は周知の常法であり、各工程を実施するためのキットや試薬類が市販されている。
各EWS-ETS融合遺伝子のcDNAを増幅するための特異的プライマーは、各融合遺伝子のcDNA配列に基づいて設計することができる。あるいは、EWS-ETS融合タンパク質は、典型的には、EWSR1の活性化ドメインのC末側にETSファミリー転写因子のDNA結合領域（DNA binding domain; DBD）が融合した構造になっているので、EWSR1遺伝子cDNAの活性化ドメインの5'末端領域に特異的にハイブリダイズするプライマーと、融合パートナーであるETSファミリー転写因子cDNAのDNA結合領域の3'末端領域に特異的にハイブリダイズするプライマーとを使用し、ユーイング肉腫細胞RNAから調製したcDNAを鋳型として用いてPCRを行なえば、EWS-ETS融合遺伝子のcDNAを増幅して得ることができる。
各種のEWS-ETS融合遺伝子のcDNA配列が公知であり、NCBIのGenBank等のデータベースに登録されている。公知のEWS-ETS融合遺伝子の配列の一例として、配列表の配列番号１、２にEWS-FLI1の配列を、配列番号３、４にEWS-ERGの配列を、配列番号５、６にEWS-E1AF（GenBank U35622.2）の配列をそれぞれ示した。また、配列番号７、８には、EWSの融合パートナーであるETV1（U17163）及びFEV（NM_017521）のcDNA配列をそれぞれ記載した。これらの融合遺伝子の中には、ごく一部の配列が相違したバリアントの存在が同定されているものもある。例えば、EWS-FLI1融合遺伝子については、配列番号１に記載されている配列の他、GenBankにJF290489.1、JF290490.1、AF327066.1のアクセッション番号で登録されている配列等も知られている。本発明で用いるEWS-ETS融合遺伝子のcDNAの配列は、配列表に記載した具体例に限定されるものではなく、そのようなバリアントも使用可能である。
動物細胞への外来遺伝子の導入方法は周知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルスベクター法等を挙げることができる。本発明では、FZ細胞内で持続的にEWS-ETS融合遺伝子を発現させることが望ましいので、ウイルスベクター法を好ましく用いることができる。
動物細胞への遺伝子導入に用いられるウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等を挙げることができる。中でもレトロウイルスベクターは、目的遺伝子を宿主細胞のゲノム中に組み込むことができるので、持続的な外来遺伝子発現という点では特に有利である。本発明におけるFZ細胞へのEWS-ETS融合遺伝子導入には、レトロウイルスベクターを好ましく用いることができる。
ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法はこの分野において確立した手法である。レトロウイルスをはじめ、様々なウイルスベクターシステムが知られており、そのためのキットや試薬類が市販されている。FZ細胞へのEWS-ETS融合遺伝子の導入は、そのような公知のウイルスベクターシステムを用いて行なうことができる。
レトロウイルスベクターを用いる場合の具体的な手順は下記実施例に記載されているが、例えば次のようにして遺伝子導入を行なうことができる。すなわち、まず、レトロウイルス発現プラスミドDNAにEWS-ETS融合遺伝子cDNAを組み込んで組換えレトロウイルスDNAを調製する。レトロウイルス発現プラスミドは、リン酸カルシウム法などの方法により適当なパッケージング細胞（レトロウイルスの構造タンパク質をコードするgag, pol, 及びenv遺伝子が導入された細胞）に導入され得る。あるいは、レトロウイルス発現プラスミドは、レトロウイルス構造タンパク質を発現するプラスミドDNAと同時に、パッケージング細胞ではない適当な宿主細胞に導入され得る。いずれの場合でも、遺伝子導入後の細胞を培養すると、EWS-ETS融合遺伝子を含む感染性の組換えレトロウイルス粒子が培養上清中に産生される。この培養上清を回収して組換えレトロウイルス液とし、上記のようにして調製したFZ細胞集団、組換えレトロウイルス液、及びポリブレンやレトロネクチン等の適当な遺伝子導入促進試薬を混合してインキュベートすることにより、FZ細胞集団に組換えレトロウイルスを感染させることができる。所望により、FZ細胞集団とウイルス液を含む混合物を数時間遠心した状態でウイルス感染を行なってもよい（spin infection）。以上により、EWS-ETS融合遺伝子が導入され、該融合遺伝子を発現するFZ細胞集団を得ることができる。
組換えウイルスの感染効率（遺伝子導入効率）は、例えば、GFP等の蛍光タンパク質遺伝子もFZ細胞集団のゲノムに組み込まれるように設計された組み換えレトロウイルスを使用した場合には、蛍光タンパク質からの蛍光をフローサイトメトリー等で検出することで調べることができる。
FZ細胞集団内でのEWS-ETS導入遺伝子の発現は、リアルタイムPCRやノーザンブロッティング等によりEWS-ETS遺伝子のmRNAを測定することで確認可能である。FLAG等のタグが付加された状態でEWS-ETSタンパク質が発現されるようにEWS-ETS遺伝子を導入した場合には、タグ配列に対する抗体を用いた免疫学的アッセイ（ウエスタンブロッティング、細胞標本の免疫染色等）により確認することも可能である。
EWS-ETS融合遺伝子が導入されたFZ細胞集団を非ヒト動物の皮下に移植することにより、ユーイング肉腫モデル動物を得ることができる。遺伝子導入効率が10%程度のFZ細胞集団であれば、104個程度以上の細胞を移植すればよい。移植されたEWS-ETS導入FZ細胞集団は、レシピエント体内でユーイング肉腫として発達する。EWS-ETS導入FZ細胞株が遺伝学的にヒトのユーイング肉腫と同じ特徴を有していること、該細胞株がレシピエント体内で増殖して生じた腫瘤が形態的にも遺伝学的にもヒトのユーイング肉腫と同じ特徴を有していることは、下記実施例において詳細に確認されている通りである。
EWS-ETS導入FZ細胞集団を移植する非ヒト動物の種類は特に限定されず、ヒト以外の哺乳動物であればよいが、腫瘍細胞等の移植実験に通常用いられている免疫不全状態の動物を好ましく用いることができる。マウスをはじめとした様々な哺乳動物において、移植実験に使用可能な免疫不全状態の動物が知られており、本発明ではいずれをも好ましく用いることができる。移植するEWS-ETS導入FZ細胞が由来する動物種と、移植を受ける動物種とは、同一でも異なっていてもよいが、通常は同一であることが好ましい。
本発明のユーイング肉腫モデル非ヒト動物は、ユーイング肉腫の新規治療薬を探索・評価するためのツールとして非常に有用である。例えば、EWS-ETS導入FZ細胞集団をインビトロで化合物と接触させて、細胞増殖の抑制が見られた化合物をインビトロでスクリーニングする。次いで、選択された化合物を本発明のモデル動物に投与し、該モデル体内のユーイング肉腫の増殖が抑制されるかどうかを調べる。インビボでユーイング肉腫の増殖を抑制した化合物は、ユーイング肉腫の治療剤の候補物質として選択することができる。このように、本発明のモデル動物は、化合物群からユーイング肉腫の治療又は予防に有効な化合物をスクリーニングするために用いることができる。あるいは、任意の化合物について、ユーイング肉腫の治療又は予防効果を評価するために用いることができる。任意の化合物を投与されたモデル動物体内で肉腫の増殖が抑制されれば、該化合物はユーイング肉腫の治療又は予防効果、特に治療効果があると評価することができる。増殖抑制の度合いに応じて該化合物の治療又は予防効果の高さを評価することもできる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
＜材料及び方法＞
1. FZ細胞の調製
18.5 dpc（性交後日数）のBalb/cマウス胚の大腿骨及び上腕骨を無菌的に取り出し、立体顕微鏡（Zeiss Stemi 2000-C, カールツァイスマイクロイメージング社）下でマイクロダイセクションによりフェイシャルゾーン（facial zone; FZ）、成長板（growth plate; GP）、骨幹及び滑液膜周囲領域（perisynovial region; PSR）に分離した。各実験において、頭部又は体幹の胚性間葉系細胞も同じ胚から調製した。各領域を採取し、2 mg/mLコラゲナーゼ（和光純薬社）で37℃、2時間穏やかに消化した。直ちにレトロウイルス感染に供した後、15%ウシ胎仔血清を添加したIscove's Modified Dulbecco's Medium（Invitrogen社）からなる増殖培地中で感染後の細胞を短期間培養した。
1. FZ細胞の調製
18.5 dpc（性交後日数）のBalb/cマウス胚の大腿骨及び上腕骨を無菌的に取り出し、立体顕微鏡（Zeiss Stemi 2000-C, カールツァイスマイクロイメージング社）下でマイクロダイセクションによりフェイシャルゾーン（facial zone; FZ）、成長板（growth plate; GP）、骨幹及び滑液膜周囲領域（perisynovial region; PSR）に分離した。各実験において、頭部又は体幹の胚性間葉系細胞も同じ胚から調製した。各領域を採取し、2 mg/mLコラゲナーゼ（和光純薬社）で37℃、2時間穏やかに消化した。直ちにレトロウイルス感染に供した後、15%ウシ胎仔血清を添加したIscove's Modified Dulbecco's Medium（Invitrogen社）からなる増殖培地中で感染後の細胞を短期間培養した。
2. レトロウイルス感染及び移植
EWS-FLI1全長cDNA（May WA et al. 1993. Mol Cell Biol 13(12): 7393-7398）はSusanne Baker博士から譲り受けた。その塩基配列を配列表の配列番号１に示す。EWS-ERGのcDNA（配列番号２）は、ヒトEWS-ERG陽性ユーイング肉腫症例から以下の通りにクローニングして得た。
EWS-FLI1全長cDNA（May WA et al. 1993. Mol Cell Biol 13(12): 7393-7398）はSusanne Baker博士から譲り受けた。その塩基配列を配列表の配列番号１に示す。EWS-ERGのcDNA（配列番号２）は、ヒトEWS-ERG陽性ユーイング肉腫症例から以下の通りにクローニングして得た。
EWS-ERG陽性ユーイング肉腫腫瘍は、培養細胞株として継代された。培養細胞1x107個から、Invitrogen社のFastTrack II kitでpolyA+ RNAを調製した。RNA 0.1μgを用い、Promega社のImpromII cDNA合成キットによりcDNAを合成した。制限酵素サイトを付加したプライマーEWS FL5（CTCGACATGGCGTCCACGGATTAC、配列番号９）及びERG FL3H（AAGCTTTAGTAGTAAGTGCCCAGATG、配列番号１０）を用いて、94℃ 30 sec, 55℃ 1 min, 72℃ 2 minで35 cycleのPCRを行い、増幅したPCR産物をPromega社のpGEM T-easy vectorにクローニングした。
FZ細胞等へのレトロウイルス感染は既報（Jin G et al. 2007. Blood 109: 3998-4005.）の通りに実施した。具体的手順を以下に記載する。
N末端FLAG付加したEWS-FLI1及びEWS-ERGをレトロウイルスベクターpMYs-IRES-GFPに組み込んだ。Plat-Eパッケージング細胞（Morita S et al., 2000. Gene Ther. 7:1063-1066.）を培養皿に播種し、1日後、Plat-E細胞に各遺伝子（空ベクターpMYs-IRES-GFP, EWS-FLI1を組み込んだpMYs-EWS-FLI1, 及びEWS-ERGを組み込んだpMYs-EWS-ERG）を導入した。遺伝子導入試薬にはLipofectamine 2000（invitrogen社）を使用した。遺伝子導入４８時間後にレトロウイルス液（遺伝子導入したPlat-E細胞の培養上清）を回収した。妊娠マウスから胎仔を取り出して、上述の通りに各細胞 (FZ, GP, Shaft, Trunk, Head)を回収し、直ちにレトロウイルスに感染させた。具体的には、各細胞、上記レトロウイルス液及び6μg/mlのpolybrene (Sigma社)を混ぜて培養皿に播き、培養皿毎800 gで２時間遠心することで、ウイルスを感染させた（spin infection）。感染効率はFACSCaliburフローサイトメーター（Beckton Dickinson社）を用いて調べた。
spin infectionの48時間後、細胞をgrowth factor reduced Matrigel（Beckton Dickinson社）に混和し、Balb/cヌードマウスの皮下に移植した。移植後のマウスは毎日観察して腫瘍の形成と全身状態をチェックした。皮下腫瘤が直径15 mmに達した時点で腫瘍を摘出し、さらなる実験に付した。腫瘍の一部（1 x 105細胞）を連続的にヌードマウスの皮下に移植するか又は尾静脈に注入し、腫瘍形成能及び転移活性を確認した。動物は公益財団法人がん研究会の動物実験委員会のガイドラインに従って取り扱い、本研究は該委員会に承認された。
3. 病理組織診断及び免疫組織化学的検査
ホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒドで固定した腫瘍組織をパラフィンに包埋し、標準的な手法を用いて切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ブロモデオキシウリジン（BrdU）によるラベリングは、屠殺の30分前に1 mg/mL BrdUを腹腔注射することにより行った。EWS-FLI1抗原及びEWS-ERG抗原は、ウサギ抗FLAGポリクローナル抗体（Sigma社）とVECTOR M.O.M. Immunodetection Kit（Vector Laboratories社）又はFITC結合抗ウサギイムノグロブリンとを組み合わせて用いて検出した。１次抗体は次のものを用いた：抗BrdU（Beckton Dickinson社）、抗マウスCD99（Dietmar Vestweber博士より譲渡）、抗Col2a（Millipore社）、抗S100（Dako社）、抗Col10（LSL社）、抗CD57（Sigma社）、抗NGFR（Millipore社）、抗β-カテニン（Beckton Dickinson社）。免疫蛍光像は、Zeiss LSM 710レーザースキャン顕微鏡（対物レンズは40x（Zeiss社）を使用）及びLSM Software ZEN 2009（Zeiss社）を用いて撮影した。
ホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒドで固定した腫瘍組織をパラフィンに包埋し、標準的な手法を用いて切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ブロモデオキシウリジン（BrdU）によるラベリングは、屠殺の30分前に1 mg/mL BrdUを腹腔注射することにより行った。EWS-FLI1抗原及びEWS-ERG抗原は、ウサギ抗FLAGポリクローナル抗体（Sigma社）とVECTOR M.O.M. Immunodetection Kit（Vector Laboratories社）又はFITC結合抗ウサギイムノグロブリンとを組み合わせて用いて検出した。１次抗体は次のものを用いた：抗BrdU（Beckton Dickinson社）、抗マウスCD99（Dietmar Vestweber博士より譲渡）、抗Col2a（Millipore社）、抗S100（Dako社）、抗Col10（LSL社）、抗CD57（Sigma社）、抗NGFR（Millipore社）、抗β-カテニン（Beckton Dickinson社）。免疫蛍光像は、Zeiss LSM 710レーザースキャン顕微鏡（対物レンズは40x（Zeiss社）を使用）及びLSM Software ZEN 2009（Zeiss社）を用いて撮影した。
4. ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロット解析は、既報（Kawamura-Saito et al. 2006. Hum Mol Genet 15: 2125-2137.）の通りに腫瘍組織のライセートを用いて常法により実施した。
ウエスタンブロット解析は、既報（Kawamura-Saito et al. 2006. Hum Mol Genet 15: 2125-2137.）の通りに腫瘍組織のライセートを用いて常法により実施した。
5. RT-PCR及びリアルタイム定量RT-PCR
トータルRNAの抽出、逆転写反応、及びRNAの定量は既報（Kawamura-Saito et al. 2006. Hum Mol Genet 15: 2125-2137.）の通りに行なった。RT-PCR及びリアルタイム定量RT-PCRは、Gene Amp 9700サーマルサイクラー（Applied Biosystems社）及び7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems社）をそれぞれ用いて常法通りに行なった。使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列を下記表２－１～２－３に示す。
トータルRNAの抽出、逆転写反応、及びRNAの定量は既報（Kawamura-Saito et al. 2006. Hum Mol Genet 15: 2125-2137.）の通りに行なった。RT-PCR及びリアルタイム定量RT-PCRは、Gene Amp 9700サーマルサイクラー（Applied Biosystems社）及び7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems社）をそれぞれ用いて常法通りに行なった。使用したオリゴヌクレオチドプライマーの配列を下記表２－１～２－３に示す。
6. インビトロ分化アッセイ
6ウェルプレートに細胞を2 x 105個/ウェルずつ播種し、増殖培地中で培養した。既報（Pittenger MF et al. 1999. Science 284: 143-147.; Sakaguchi Y et al. 2005. Arthritis Rheum 52: 2521-2529.; Shiota M et al. 2007. Exp Cell Res 313: 1008-1023.）の方法に従い、脂肪系、軟骨系、骨系、筋肉系及び神経系への分化アッセイを実施した。間葉系幹細胞（MSC）の調製は既報（Shiota M et al. 2007. Exp Cell Res 313: 1008-1023.）の通りに行なった。
6ウェルプレートに細胞を2 x 105個/ウェルずつ播種し、増殖培地中で培養した。既報（Pittenger MF et al. 1999. Science 284: 143-147.; Sakaguchi Y et al. 2005. Arthritis Rheum 52: 2521-2529.; Shiota M et al. 2007. Exp Cell Res 313: 1008-1023.）の方法に従い、脂肪系、軟骨系、骨系、筋肉系及び神経系への分化アッセイを実施した。間葉系幹細胞（MSC）の調製は既報（Shiota M et al. 2007. Exp Cell Res 313: 1008-1023.）の通りに行なった。
7. マイクロアレイ解析
GeneChip解析により遺伝子発現プロファイルを調べた。FZサンプル及びGPサンプルにはper cell normalization法を適用した（Kanno J et al. 2006. BMC Genomics 7: 64.）。簡潔に記載すると以下の通りである。細胞ライセートはRLTバッファー（QIAGEN社）を用いて調製した。DNA量に従ってRNAカクテルを細胞ライセートに添加した後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を用いてトータルRNAを抽出した。FZ細胞、GP細胞及びマウスのユーイング肉腫組織から生成したaRNAプローブをマウスのGenome 430 2.0 Array（Affymetrix社）にハイブリダイズした。ストレプトアビジン－フィコエリトリンコンジュゲートで染色後、Affymetrix GeneChip Scanner 3000を用いてアレイをスキャンし、Affymetrix GeneChip Command Console Software（AGCC, Affymetrix社）及びGeneSpring GX 11.0.2（Agilent Technologies社）を用いて既報（Fujino T et al., 2010. Am J Pathol 176: 1973-1982.）の通りに解析した。Percellome法を用いた解析では、FZ細胞及びGP細胞の発現データを細胞当たりmRNAコピー数に変換し、クオリティコントロールを行ない、Percellome software（Kanno J et al. 2006. BMC Genomics 7: 64.）を用いて解析した。GSEA-P 2.0 software（Subramanian A et al. 2007. Bioinformatics 23: 3251-3253.）を用いてGene Set Enrichment Analysis（GSEA）を行なった。
GeneChip解析により遺伝子発現プロファイルを調べた。FZサンプル及びGPサンプルにはper cell normalization法を適用した（Kanno J et al. 2006. BMC Genomics 7: 64.）。簡潔に記載すると以下の通りである。細胞ライセートはRLTバッファー（QIAGEN社）を用いて調製した。DNA量に従ってRNAカクテルを細胞ライセートに添加した後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を用いてトータルRNAを抽出した。FZ細胞、GP細胞及びマウスのユーイング肉腫組織から生成したaRNAプローブをマウスのGenome 430 2.0 Array（Affymetrix社）にハイブリダイズした。ストレプトアビジン－フィコエリトリンコンジュゲートで染色後、Affymetrix GeneChip Scanner 3000を用いてアレイをスキャンし、Affymetrix GeneChip Command Console Software（AGCC, Affymetrix社）及びGeneSpring GX 11.0.2（Agilent Technologies社）を用いて既報（Fujino T et al., 2010. Am J Pathol 176: 1973-1982.）の通りに解析した。Percellome法を用いた解析では、FZ細胞及びGP細胞の発現データを細胞当たりmRNAコピー数に変換し、クオリティコントロールを行ない、Percellome software（Kanno J et al. 2006. BMC Genomics 7: 64.）を用いて解析した。GSEA-P 2.0 software（Subramanian A et al. 2007. Bioinformatics 23: 3251-3253.）を用いてGene Set Enrichment Analysis（GSEA）を行なった。
8. マウス及びヒトのマイクロアレイデータセット間のデータ比較とクラスタリング
マウスのユーイング肉腫サンプル10例から得たマイクロアレイデータをヒト腫瘍のマイクロアレイデータセットと比較した。ONCOMINEデータベース（www.oncomine.org）のデータは2011年6月にアクセスして得た。Human Genome U133A Array（Affymetrix社）を用いて解析した腫瘍サンプル117個を含む5つのマイクロアレイ結果を遺伝子発現について照会した。E-MEXP-353（Henderson SR et al., 2005. Genome Biol 6: R76.）、E-MEXP-1142（Schaefer KL et al. 2008. Eur J Cancer 44: 699-709.）、GSE6481（Nakayama R et al. 2007. Mod Pathol 20: 749-759.）、GSE7529（Albino D et al. 2008. Cancer 113: 1412-1422.）及びGSE21122（Barretina J et al. 2010. Nat Genet 42: 715-721.）のCELファイルをダウンロードした。Entrez Gene IDを使用してGeneSpringの翻訳機能によりヒトU133Aアレイのプローブセットを23,860個のマウス430 2.0アレイに翻訳し、新たな共通プラットフォームを作製した。log変換データを用いて下記の手順により階層クラスタリング（hierarchical clustering; HC）を行なった。初期統計解析のため、合計32個のヒトユーイング肉腫サンプルのうちの少なくとも24個で"present"又は"marginal"コールを示した13,026遺伝子を選択した。次いで、1元配置ANOVA（p < 0.05）解析により12,340個のプローブを選択した。最終的に、少なくとも3種の腫瘍において発現が2倍超の差を示した1,819個のプローブを選択した。これら1,819個のプローブを使用し、平均連結法及びPearson’s centered measurement法を用いてHCを実施した。
マウスのユーイング肉腫サンプル10例から得たマイクロアレイデータをヒト腫瘍のマイクロアレイデータセットと比較した。ONCOMINEデータベース（www.oncomine.org）のデータは2011年6月にアクセスして得た。Human Genome U133A Array（Affymetrix社）を用いて解析した腫瘍サンプル117個を含む5つのマイクロアレイ結果を遺伝子発現について照会した。E-MEXP-353（Henderson SR et al., 2005. Genome Biol 6: R76.）、E-MEXP-1142（Schaefer KL et al. 2008. Eur J Cancer 44: 699-709.）、GSE6481（Nakayama R et al. 2007. Mod Pathol 20: 749-759.）、GSE7529（Albino D et al. 2008. Cancer 113: 1412-1422.）及びGSE21122（Barretina J et al. 2010. Nat Genet 42: 715-721.）のCELファイルをダウンロードした。Entrez Gene IDを使用してGeneSpringの翻訳機能によりヒトU133Aアレイのプローブセットを23,860個のマウス430 2.0アレイに翻訳し、新たな共通プラットフォームを作製した。log変換データを用いて下記の手順により階層クラスタリング（hierarchical clustering; HC）を行なった。初期統計解析のため、合計32個のヒトユーイング肉腫サンプルのうちの少なくとも24個で"present"又は"marginal"コールを示した13,026遺伝子を選択した。次いで、1元配置ANOVA（p < 0.05）解析により12,340個のプローブを選択した。最終的に、少なくとも3種の腫瘍において発現が2倍超の差を示した1,819個のプローブを選択した。これら1,819個のプローブを使用し、平均連結法及びPearson’s centered measurement法を用いてHCを実施した。
9. クロマチン免疫沈降法（ChIP）
各免疫沈降あたり合計5 x 106個の細胞を10%ホルムアルデヒドで10分間、室温にて架橋結合した。Gタンパク質磁性ビーズにあらかじめ結合させた抗ヒストン抗体H3K9/K14Ac、H3K4/me3、H3K27/me3、total H3（Cell Signaling Technologies社）又はH3K9/me3（Millipore社）を用いてヒストン免疫沈降を行なった。免疫沈降されたDNAは、各領域に特異的なプライマー（下記表４）で増幅させた。
各免疫沈降あたり合計5 x 106個の細胞を10%ホルムアルデヒドで10分間、室温にて架橋結合した。Gタンパク質磁性ビーズにあらかじめ結合させた抗ヒストン抗体H3K9/K14Ac、H3K4/me3、H3K27/me3、total H3（Cell Signaling Technologies社）又はH3K9/me3（Millipore社）を用いてヒストン免疫沈降を行なった。免疫沈降されたDNAは、各領域に特異的なプライマー（下記表４）で増幅させた。
10. Cre/loxpによる遺伝子サイレンシング
loxPが導入されたEWS-FLI1レトロウイルスを用いてFZ細胞に形質導入し、上述の通りにユーイング肉腫細胞を得た。pMSCV-Cre-puroレトロウイルスを用いて腫瘍細胞に形質導入した。レトロウイルス導入の4日後、Senescence Detection Kit（Biovision社）を用いて老化関連β-ガラクトシダーゼ発現を検出した。
loxPが導入されたEWS-FLI1レトロウイルスを用いてFZ細胞に形質導入し、上述の通りにユーイング肉腫細胞を得た。pMSCV-Cre-puroレトロウイルスを用いて腫瘍細胞に形質導入した。レトロウイルス導入の4日後、Senescence Detection Kit（Biovision社）を用いて老化関連β-ガラクトシダーゼ発現を検出した。
11. siRNA干渉実験
FLI1, Dkk2, Catnb, Prkcb1及びEzh2のノックダウンのためのsiRNA（配列はSI04156152, SI04358375, SI00979629, SI00979636, SI00942046, SI00942060, SI01388646, SI01388653, SI00997801及びSI00997808）はQIAGEN社より購入した。製造者のプロトコールに従い、マウスユーイング肉腫細胞にsiRNAを導入した。ノックダウン効率は、抗FLAG、抗β-カテニン、抗Ezh2（Cell Signaling Technologies社）、抗PKC β1（Santa Cruz Biotechnology社）を用いたウエスタンブロッティング、又はRT-PCRにより確認した。
FLI1, Dkk2, Catnb, Prkcb1及びEzh2のノックダウンのためのsiRNA（配列はSI04156152, SI04358375, SI00979629, SI00979636, SI00942046, SI00942060, SI01388646, SI01388653, SI00997801及びSI00997808）はQIAGEN社より購入した。製造者のプロトコールに従い、マウスユーイング肉腫細胞にsiRNAを導入した。ノックダウン効率は、抗FLAG、抗β-カテニン、抗Ezh2（Cell Signaling Technologies社）、抗PKC β1（Santa Cruz Biotechnology社）を用いたウエスタンブロッティング、又はRT-PCRにより確認した。
12. 特異的阻害剤を用いた薬理学的実験
FZ細胞にEWS-FLI1を形質導入して調製したマウスユーイング肉腫細胞を、インビトロでMEK1阻害剤U0126（Cell Signaling Technologies社）にて処理した。マウス及びヒトのユーイング肉腫細胞株を、インビトロ及びインビボで、Wnt/β-カテニン阻害剤iCRT14及びPNU74654（Tocris Bioscience社）、EZH2阻害剤DZNeP（Cayman Chemical社）、又はPARP1阻害剤Olaparib（Selleckchem社）にて処理した。インビボ実験では、腫瘍をヌードマウスに皮下移植し、腫瘍が直径5 mmに達した時点で各特異的阻害剤をマウスに投与した。それぞれ図7Cに示した通りの用量で腹腔内投与した。
FZ細胞にEWS-FLI1を形質導入して調製したマウスユーイング肉腫細胞を、インビトロでMEK1阻害剤U0126（Cell Signaling Technologies社）にて処理した。マウス及びヒトのユーイング肉腫細胞株を、インビトロ及びインビボで、Wnt/β-カテニン阻害剤iCRT14及びPNU74654（Tocris Bioscience社）、EZH2阻害剤DZNeP（Cayman Chemical社）、又はPARP1阻害剤Olaparib（Selleckchem社）にて処理した。インビボ実験では、腫瘍をヌードマウスに皮下移植し、腫瘍が直径5 mmに達した時点で各特異的阻害剤をマウスに投与した。それぞれ図7Cに示した通りの用量で腹腔内投与した。
13. 細胞周期アッセイ
単一細胞懸濁液をPBS中0.1% triton X-100溶液にて透過処理し、50 mg/mlヨウ化プロピジウム及び1 mg/ml RNAse Aを添加した。その後、FACScaliburフローサイトメーター及びModifit software（Becton Dickinson社）を用いて細胞懸濁液の解析を行なった。
単一細胞懸濁液をPBS中0.1% triton X-100溶液にて透過処理し、50 mg/mlヨウ化プロピジウム及び1 mg/ml RNAse Aを添加した。その後、FACScaliburフローサイトメーター及びModifit software（Becton Dickinson社）を用いて細胞懸濁液の解析を行なった。
14. アクセッション番号
マイクロアレイデータセットは、NCBIのGene Expression Omnibus（GEO）データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）よりGSE32615及びGSE32618のアクセッション番号で入手可能である。
マイクロアレイデータセットは、NCBIのGene Expression Omnibus（GEO）データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）よりGSE32615及びGSE32618のアクセッション番号で入手可能である。
＜結果＞
1. 骨・軟骨原前駆細胞内でのEWS-ETS発現によるユーイング肉腫様の小円形細胞腫瘍の発達
dpc 18.5のマウス胎仔の大腿骨及び上腕骨をマイクロダイセクションによりフェイシャルゾーン（facial zone; FZ）、成長板（growth plate; GP）、骨幹及び滑液膜周囲領域（perisynovial region; PSR）に分離した（Fig. 1A, B）。頭部及び体幹の胚性間葉系細胞も分離した。各細胞画分は、タイプIコラゲナーゼで穏やかに消化し、直ちにレトロウイルスに感染後、短期培養に付した。
1. 骨・軟骨原前駆細胞内でのEWS-ETS発現によるユーイング肉腫様の小円形細胞腫瘍の発達
dpc 18.5のマウス胎仔の大腿骨及び上腕骨をマイクロダイセクションによりフェイシャルゾーン（facial zone; FZ）、成長板（growth plate; GP）、骨幹及び滑液膜周囲領域（perisynovial region; PSR）に分離した（Fig. 1A, B）。頭部及び体幹の胚性間葉系細胞も分離した。各細胞画分は、タイプIコラゲナーゼで穏やかに消化し、直ちにレトロウイルスに感染後、短期培養に付した。
各細胞に対してレトロウイルスによるEWS-FLI1遺伝子導入を行ない、各分画の形質導入細胞106個をヌードマウスに皮下移植した。その結果、FZ細胞を移植されたレシピエントは、平均潜伏期間8週間、100％の浸透度で皮下腫瘤を生じた（図1C）。組織学的解析によると、EWS-FLI1又はEWS-ERGを発現する腫瘍は、ユーイング肉腫に典型的な特徴である、侵攻的に増殖する小円形細胞で構成されていた（図1D）。腫瘍は連続的に移植可能であり（データ省略）、尾静脈注射で転移能を有していた（図1D）。
EWS-ETSの発現はFLAGタグ付加タンパク質の免疫ブロッティング及び免疫染色により確認した（データ省略）。ヒトユーイング肉腫の表面マーカーであるMic2/CD99（Ambros IM et al. 1991. Cancer 67: 1886-1893.）は局所的に検出された（データ省略）。Cd99遺伝子配列はヒト－マウス間で部分的にしか保存されておらず（Bixel G et al. 2004. Blood 104: 3205-3213.）、マウスESの特異的マーカーとしてのCd99の役割は未だ評価されていない。
図1E, Fに示す通り、形質導入されたFZ細胞はわずか1 x 104個の注入でユーイング肉腫を生じることができた。対照的に、EWS-FLI1導入GP画分、骨幹画分及びPSR画分の場合は腫瘍の発達に1 x 106個の細胞が必要であった。このことは、ユーイング肉腫の起源細胞がFZ画分で高度に濃縮されているということを明らかに示している。マウス頭部又は体幹から精製した胚性間葉系細胞にEWS-FLI1を導入した場合には、小円形細胞肉腫の発生率は低く（図1E, F）、線維肉腫様の腫瘍も得られた（データ省略）。また、粘液状脂肪肉腫で見られるEWS-CHOP、又は滑膜肉腫で見られるSYT-SSX1をFZ細胞に導入した場合には、腫瘍は誘導されなかった。空ベクターを導入したFZ細胞を移植した場合には、非腫瘍性の骨及び軟骨の発達が観察された（データ省略）。このように、FZ細胞をEWS-ETS融合遺伝子の標的細胞とすることで、マウスにおいてヒトユーイング様肉腫が効率的かつ特異的に誘導された。
2. マウスのユーイング肉腫はヒトのユーイング肉腫及び神経芽細胞腫と共通した遺伝子発現プロファイルを有する
マウスユーイング肉腫の発現プロファイルをユーイング肉腫, 悪性線維性組織球腫, 粘液状脂肪肉腫, 滑膜肉腫, 骨肉腫, 神経芽細胞腫及び軟骨肉腫を含む一連のヒト腫瘍の発現プロファイルと比較した。マウス及びヒトの間で共通する遺伝子セット（23,860プローブセット）を用いた教師なしクラスタリングによると、マウスのユーイング肉腫はヒトのユーイング肉腫及び神経芽細胞腫と非常に類似していた（図2A）。これらの結果は、本モデルとヒトのユーイング肉腫との間の密接な関係を示している。さらに、EWS-FLI1の発現によって、骨軟骨原前駆細胞から神経芽細胞腫様の小円形細胞肉腫の形態を誘導させることができた。マウスとヒトのユーイング肉腫には共通してアップレギュレートされる遺伝子が存在していた。解析の結果、Ezh2, Id2及びPtpn13遺伝子等の公知のEWS-FLI1の標的（Richter GH et al. 2009. Proc Natl Acad Sci USA 106: 5324-5329.; Nishimori H et al. 2002. Oncogene 21: 8302-8309.; Abaan OD et al. 2005. Oncogene 24: 2715-2722.）を含む336遺伝子がマウス及びヒト両者のユーイング肉腫でアップレギュレートされることが明らかとなった。さらにまた、Nkx2.2、Nr0b1、Gstm4、Polr2g、Tert、Tnc及びUpp1遺伝子等のEWS-FLI1の標的（Smith R et al. 2006. Cancer Cell 9: 405-416.; Kinsey M et al. 2006. Mol Cancer Res 4: 851-859.; Luo W et al. 2009. Oncogene 28: 4126-4132.; Petermann R et al. 1998. Oncogene 17: 603-610.; Fuchs B et al. 2004. Clin Orthop Relat Res 426: 64-68.; Watanabe G et al. 2003. Genes Chromosomes Cancer 36: 224-232.; Deneen B et al. 2001. Oncogene 20: 6731-6741.）を含む6,014遺伝子がマウスのユーイング肉腫でアップレギュレートされていた（図2B）。さらに、360遺伝子（Tgfbr2遺伝子を含む）（Hahm KB et al. 1999. Nat Genet 23: 222-227.）がマウス及びヒト両者のユーイング肉腫でダウンレギュレートされていた（図2C）。これらの遺伝子はEWS-FLI1に反応性である可能性のある遺伝子であり、初期の発がん過程及び悪性度がより高い形質への進行に重要であり得る。これらの遺伝子発現結果は、本マウスモデルがヒトのユーイング肉腫のモデルであることの確実性を裏付けている。
マウスユーイング肉腫の発現プロファイルをユーイング肉腫, 悪性線維性組織球腫, 粘液状脂肪肉腫, 滑膜肉腫, 骨肉腫, 神経芽細胞腫及び軟骨肉腫を含む一連のヒト腫瘍の発現プロファイルと比較した。マウス及びヒトの間で共通する遺伝子セット（23,860プローブセット）を用いた教師なしクラスタリングによると、マウスのユーイング肉腫はヒトのユーイング肉腫及び神経芽細胞腫と非常に類似していた（図2A）。これらの結果は、本モデルとヒトのユーイング肉腫との間の密接な関係を示している。さらに、EWS-FLI1の発現によって、骨軟骨原前駆細胞から神経芽細胞腫様の小円形細胞肉腫の形態を誘導させることができた。マウスとヒトのユーイング肉腫には共通してアップレギュレートされる遺伝子が存在していた。解析の結果、Ezh2, Id2及びPtpn13遺伝子等の公知のEWS-FLI1の標的（Richter GH et al. 2009. Proc Natl Acad Sci USA 106: 5324-5329.; Nishimori H et al. 2002. Oncogene 21: 8302-8309.; Abaan OD et al. 2005. Oncogene 24: 2715-2722.）を含む336遺伝子がマウス及びヒト両者のユーイング肉腫でアップレギュレートされることが明らかとなった。さらにまた、Nkx2.2、Nr0b1、Gstm4、Polr2g、Tert、Tnc及びUpp1遺伝子等のEWS-FLI1の標的（Smith R et al. 2006. Cancer Cell 9: 405-416.; Kinsey M et al. 2006. Mol Cancer Res 4: 851-859.; Luo W et al. 2009. Oncogene 28: 4126-4132.; Petermann R et al. 1998. Oncogene 17: 603-610.; Fuchs B et al. 2004. Clin Orthop Relat Res 426: 64-68.; Watanabe G et al. 2003. Genes Chromosomes Cancer 36: 224-232.; Deneen B et al. 2001. Oncogene 20: 6731-6741.）を含む6,014遺伝子がマウスのユーイング肉腫でアップレギュレートされていた（図2B）。さらに、360遺伝子（Tgfbr2遺伝子を含む）（Hahm KB et al. 1999. Nat Genet 23: 222-227.）がマウス及びヒト両者のユーイング肉腫でダウンレギュレートされていた（図2C）。これらの遺伝子はEWS-FLI1に反応性である可能性のある遺伝子であり、初期の発がん過程及び悪性度がより高い形質への進行に重要であり得る。これらの遺伝子発現結果は、本マウスモデルがヒトのユーイング肉腫のモデルであることの確実性を裏付けている。
同様の解析により、マウス及びヒトのユーイング肉腫、並びにヒト神経芽細胞腫において129遺伝子がアップレギュレートされることが分かった。マウスユーイング肉腫において見られる一連の神経分化関連遺伝子（Astn1, Gfra2, Grik2, Ncan及びNtrk1）及びシナプス関連遺伝子のアップレギュレーション（図2D）が、ヒトの神経芽細胞腫においても観察された。このことは、神経細胞の表現型が骨軟骨原前駆細胞から、おそらくは分化転換の過程を経て誘導され得ることを示している。Ntrk1/Ntrk3及びN-mycを含む神経外胚葉関連のシグナル経路がユーイング肉腫の神経細胞の表現型に関わっているかもしれない。
3. マウスユーイング肉腫の初期腫瘍性病変
我々の新たな動物モデルにより、ヒトのユーイング肉腫では観察が困難な前癌ないしは初期腫瘍状態（Toomey FC et al. 2010. Oncogene 29: 4504-4516.）からどのように悪性細胞が進展するかを調べることが可能になった。そこで、マウスユーイング肉腫の初期病変を顕微鏡的に解析した（図3A）。非腫瘍性の軟骨に隣接してEWS-FLI1（FLAG）陽性細胞の小さい病巣が観察され、BrdU取り込みの評価で急速な細胞周期の進行が確認された（図3B, C）。初期腫瘍病変部は、Cd57, NGFR, S-100, ミオシン, デスミン, フォン・ウィルブランド因子, サイトケラチン及びCd45等の神経筋原、上皮、血管又は造血系マーカーに陰性であった（データ省略）。未成熟軟骨細胞のマーカーである２型コラーゲン（Sohaskey ML et al. 2008. Development 135: 2215-2220.; James CG et al. 2010. PLoS One 5: e8693.）を発現しているFLAG陽性細胞が少数、初期腫瘍病巣の周辺部に観察された（図3D）。興味深いことに、これらの分化細胞では、細胞質にEWS-FLI1の染色が確認された。染色は基本的には初期腫瘍病変の中心部の核に局在化していた（図3C）。EWS-FLI1融合タンパク質の核局在化は多くの種類の細胞において確認されており（Honsei N et al. 2006. Int J Oncol 29: 689-693.）、分化細胞における細胞質への局在化は、EWS-FLI1の核からの排除がユーイング肉腫の腫瘍形成過程における抑制メカニズムとして存在していることを示唆している。これらの結果はまた、EWS-FLI1の発現それ自体では完全な腫瘍形成には不十分であるということを示唆している。さらに、１０型コラーゲン又はS100に陽性のより分化した軟骨細胞が周辺領域に観察された（図3E, F）。これらの所見は、EWS-FLI1の発現が完全な腫瘍形成には十分ではないことを示している。
我々の新たな動物モデルにより、ヒトのユーイング肉腫では観察が困難な前癌ないしは初期腫瘍状態（Toomey FC et al. 2010. Oncogene 29: 4504-4516.）からどのように悪性細胞が進展するかを調べることが可能になった。そこで、マウスユーイング肉腫の初期病変を顕微鏡的に解析した（図3A）。非腫瘍性の軟骨に隣接してEWS-FLI1（FLAG）陽性細胞の小さい病巣が観察され、BrdU取り込みの評価で急速な細胞周期の進行が確認された（図3B, C）。初期腫瘍病変部は、Cd57, NGFR, S-100, ミオシン, デスミン, フォン・ウィルブランド因子, サイトケラチン及びCd45等の神経筋原、上皮、血管又は造血系マーカーに陰性であった（データ省略）。未成熟軟骨細胞のマーカーである２型コラーゲン（Sohaskey ML et al. 2008. Development 135: 2215-2220.; James CG et al. 2010. PLoS One 5: e8693.）を発現しているFLAG陽性細胞が少数、初期腫瘍病巣の周辺部に観察された（図3D）。興味深いことに、これらの分化細胞では、細胞質にEWS-FLI1の染色が確認された。染色は基本的には初期腫瘍病変の中心部の核に局在化していた（図3C）。EWS-FLI1融合タンパク質の核局在化は多くの種類の細胞において確認されており（Honsei N et al. 2006. Int J Oncol 29: 689-693.）、分化細胞における細胞質への局在化は、EWS-FLI1の核からの排除がユーイング肉腫の腫瘍形成過程における抑制メカニズムとして存在していることを示唆している。これらの結果はまた、EWS-FLI1の発現それ自体では完全な腫瘍形成には不十分であるということを示唆している。さらに、１０型コラーゲン又はS100に陽性のより分化した軟骨細胞が周辺領域に観察された（図3E, F）。これらの所見は、EWS-FLI1の発現が完全な腫瘍形成には十分ではないことを示している。
4. 骨軟骨原前駆細胞はFZ細胞画分において濃縮されている
骨軟骨分化の過程において、FZ細胞は未成熟であり、より分化したGP領域に向かって遊走する（Vortkamp A et al. 1996. Science 273: 613-622.）。我々は、精製したFZ細胞及びGP細胞から得られた遺伝子発現プロファイルを比較した（図4A）。予想通り、FZ細胞においてErgの発現が顕著であった。さらに、FZ細胞は、Sox9, Col2a1, Pthrp（Pthlh）及びLubricin(Prg4)遺伝子をはじめとする未成熟軟骨形成前駆細胞に特徴的なプロファイルを示し（図4A）、既報（Iwamoto M et al. 2007. Dev Biol 305: 40-51.; Sohaskey ML et al. 2008. Development 135: 2215-2220.）と一致する結果であった。一方、GP細胞は、Col10a1遺伝子によって表される通り、分化度のより高い軟骨細胞の遺伝子発現プロファイルを示した（図4A）。多くの未成熟細胞系列で発現しているNanog, Oct4及びSox2遺伝子は、PSRでは濃縮されていたが、FZ及びGPではほとんどないしは全く発現していなかった。さらにFZ細胞は、胚性体幹細胞とは対照的に、Sca1, CD34, CD44及びCD105等のMSCの表面マーカーを欠いていた（データ省略）。
骨軟骨分化の過程において、FZ細胞は未成熟であり、より分化したGP領域に向かって遊走する（Vortkamp A et al. 1996. Science 273: 613-622.）。我々は、精製したFZ細胞及びGP細胞から得られた遺伝子発現プロファイルを比較した（図4A）。予想通り、FZ細胞においてErgの発現が顕著であった。さらに、FZ細胞は、Sox9, Col2a1, Pthrp（Pthlh）及びLubricin(Prg4)遺伝子をはじめとする未成熟軟骨形成前駆細胞に特徴的なプロファイルを示し（図4A）、既報（Iwamoto M et al. 2007. Dev Biol 305: 40-51.; Sohaskey ML et al. 2008. Development 135: 2215-2220.）と一致する結果であった。一方、GP細胞は、Col10a1遺伝子によって表される通り、分化度のより高い軟骨細胞の遺伝子発現プロファイルを示した（図4A）。多くの未成熟細胞系列で発現しているNanog, Oct4及びSox2遺伝子は、PSRでは濃縮されていたが、FZ及びGPではほとんどないしは全く発現していなかった。さらにFZ細胞は、胚性体幹細胞とは対照的に、Sca1, CD34, CD44及びCD105等のMSCの表面マーカーを欠いていた（データ省略）。
レーザーマイクロダイセクションを用いて、FZ細胞の特徴を詳細に解析した。レーザーマイクロダイセクションにより回収したPSR、FZ及びGP細胞（図5A）における遺伝子発現をリアルタイム定量RT-PCRにより調べた結果をグラフ化したものを図5Bに示す。Erg、Gdf5、Pthlh、Prg4遺伝子の発現は、FZ細胞においてPSR及びGPよりも顕著に高かった。これら４遺伝子は、他の間葉組織では関節軟骨の表層部にのみ発現しており、特にErg及びGdf5は、成人の関節軟骨表層部では発現せず、胚の関節軟骨表層部のみ発現していることが知られている。Erg及びGdf5遺伝子の発現はFZ細胞の特徴の１つである。
インビトロ分化アッセイによると、FZ細胞は顕著な骨形成性及び軟骨形成性の分化能を示したが、脂肪系列に分化する能力は欠いていた。その一方、MSCは典型的な多系列分化パターンを示した（図4B）。また、FZ細胞は筋肉系列又は神経系列には分化できなかった（データ省略）。これらの所見は、二分化能の前駆細胞がFZ画分中に存在することを示しており（図4C）、FZ細胞画分においてErg発現前駆細胞の濃縮を達成できていることが確認された。従って、EWS-ETS遺伝子導入及びその後の移植実験にはFZ細胞を用いた。
また、分化誘導実験により、マウスのユーイング肉腫が軟骨関連遺伝子を発現可能であることが明らかとなった（データ省略）。このことは、腫瘍細胞が骨軟骨原前駆細胞の活性をある程度保持していることを示しており、ユーイング肉腫の骨軟骨原前駆細胞起源を示唆している。
5. FZ細胞におけるEWS-FLI1反応性遺伝子及びクロマチン修飾
マウスのユーイング肉腫の起源に厳密な制限があると仮定すると、腫瘍母地細胞とEWS-FLI1変異との間の関係性は重要である。そこで、EWS-FLI1の存在下又は非存在下での遺伝子発現プロファイルをFZ細胞とGP細胞との間で比較した。EWS-FLI1導入後のFZ細胞内では、公知のEWS-FLI1標的遺伝子（Ordonez JL et al. 2009. Cancer Res 69: 7140-7150.）の大部分がアップレギュレートされていた（データ省略）。EWS-FLI1は異常な転写因子をコードしており（Smith R et al. 2006. Cancer Cell 9: 405-416.; Ordonez JL et al. 2009. Cancer Res 69: 7140-7150.）、それに対する反応はFZ細胞とGP細胞との間で相違した（図4D）。FZ細胞画分とGP細胞画分における異なる遺伝子応答は、標的座位におけるクロマチンの状態の相違によって引き起こされているのかもしれなかった。そこで、Dkk2, Prkcb1及びEzh2等の代表的な遺伝子について、ヒストン修飾を調べた。遺伝子発現の活性化マークであるヒストンH3K9/K14ac及びH3K4meはFZ細胞において多く観察され、その一方、抑制マークであるヒストンH3K9me3及びH3K27me3はGPにおいて多く観察された（図4E）。これらの結果は、EWS-ETS標的遺伝子の転写活性化がFZ細胞内で最大効率で生じており、それによりEWS-ETSの侵襲性の発がん機能が提供されているということを強く示唆している。
マウスのユーイング肉腫の起源に厳密な制限があると仮定すると、腫瘍母地細胞とEWS-FLI1変異との間の関係性は重要である。そこで、EWS-FLI1の存在下又は非存在下での遺伝子発現プロファイルをFZ細胞とGP細胞との間で比較した。EWS-FLI1導入後のFZ細胞内では、公知のEWS-FLI1標的遺伝子（Ordonez JL et al. 2009. Cancer Res 69: 7140-7150.）の大部分がアップレギュレートされていた（データ省略）。EWS-FLI1は異常な転写因子をコードしており（Smith R et al. 2006. Cancer Cell 9: 405-416.; Ordonez JL et al. 2009. Cancer Res 69: 7140-7150.）、それに対する反応はFZ細胞とGP細胞との間で相違した（図4D）。FZ細胞画分とGP細胞画分における異なる遺伝子応答は、標的座位におけるクロマチンの状態の相違によって引き起こされているのかもしれなかった。そこで、Dkk2, Prkcb1及びEzh2等の代表的な遺伝子について、ヒストン修飾を調べた。遺伝子発現の活性化マークであるヒストンH3K9/K14ac及びH3K4meはFZ細胞において多く観察され、その一方、抑制マークであるヒストンH3K9me3及びH3K27me3はGPにおいて多く観察された（図4E）。これらの結果は、EWS-ETS標的遺伝子の転写活性化がFZ細胞内で最大効率で生じており、それによりEWS-ETSの侵襲性の発がん機能が提供されているということを強く示唆している。
6. FZ細胞及びユーイング肉腫細胞におけるWnt/β-カテニン経路のアップレギュレーション
遺伝子導入後48時間のEWS-FLI1遺伝子発現FZ及びGP細胞の遺伝子セットを用いたGene set enrichment analysis（GSEA）によると、Wnt/β-カテニン経路内並びにEGF及びRTKシグナル経路内の遺伝子が濃縮されていた（図6A）。Wnt/β-カテニン経路では、EWS-FLI1を発現するFZ細胞内でDkk2及びWif1遺伝子の発現が観察された（図4D, 6B）。Dkk2遺伝子の発現はFZ細胞とGP細胞との間で同程度であり、EWS-FLI1遺伝子導入によりFZ細胞においてのみDkk2遺伝子のアップレギュレーションが誘導された（図6B）。Wif1遺伝子の発現上昇はFZでは観察されたがGPでは観察されず、その発現はEWS-FLI1遺伝子導入後も維持されていた。さらに、EGF経路及び受容体プロテインキナーゼ活性に対する遺伝子セットが濃縮されていた（図6B）。Prkcb遺伝子はEWS-FLI1の下流の遺伝子であり（Dohjima T et al. 2000. Br J Cancer 82: 16-19.）、本来FZにおいてGPよりも高いレベルで発現している。特に、その発現はEWS-FLI1遺伝子をFZに導入することでより高いレベルまで上昇した。血管及び神経筋系のシグナル伝達に重要なFlt4/Vegfr3及びMusk遺伝子も、EWS-FLI1反応性の遺伝子として同定された（図6B）。
遺伝子導入後48時間のEWS-FLI1遺伝子発現FZ及びGP細胞の遺伝子セットを用いたGene set enrichment analysis（GSEA）によると、Wnt/β-カテニン経路内並びにEGF及びRTKシグナル経路内の遺伝子が濃縮されていた（図6A）。Wnt/β-カテニン経路では、EWS-FLI1を発現するFZ細胞内でDkk2及びWif1遺伝子の発現が観察された（図4D, 6B）。Dkk2遺伝子の発現はFZ細胞とGP細胞との間で同程度であり、EWS-FLI1遺伝子導入によりFZ細胞においてのみDkk2遺伝子のアップレギュレーションが誘導された（図6B）。Wif1遺伝子の発現上昇はFZでは観察されたがGPでは観察されず、その発現はEWS-FLI1遺伝子導入後も維持されていた。さらに、EGF経路及び受容体プロテインキナーゼ活性に対する遺伝子セットが濃縮されていた（図6B）。Prkcb遺伝子はEWS-FLI1の下流の遺伝子であり（Dohjima T et al. 2000. Br J Cancer 82: 16-19.）、本来FZにおいてGPよりも高いレベルで発現している。特に、その発現はEWS-FLI1遺伝子をFZに導入することでより高いレベルまで上昇した。血管及び神経筋系のシグナル伝達に重要なFlt4/Vegfr3及びMusk遺伝子も、EWS-FLI1反応性の遺伝子として同定された（図6B）。
Dkk2遺伝子はdickkopfファミリータンパク質のメンバーである。Wnt/β-カテニン経路のモジュレーターとして、このファミリーは骨と軟骨の発達及び恒常性に重要な役割を果たしている（Niehrs C. 2006. Oncogene 25: 7469-7481.）。過去の研究によると、ユーイング肉腫細胞においてEWS-FLI1遺伝子をノックダウンするとDKK2遺伝子がダウンレギュレートされるが、DKK1遺伝子については逆の応答が観察されている（Miyagawa Y et al. 2009. PLoS One 4: e4634.）。過去の研究はDKK1及びDKK2がカノニカルなWnt/β-カテニン経路とは独立して機能している可能性を示唆しているが（Mikheev AM et al. 2004. Carcinogenesis 25: 47-59.）、ヒトのユーイング肉腫においてWntの活性化が役割を担っている可能性も報告されている（Uren A et al. 2004. Pediatr Blood Cancer 43: 243-249.）。
ユーイング肉腫の腫瘍形成へのWnt/β-カテニン経路の関与について調べるため、β-カテニンタンパク質の発現を評価した。β-カテニンの発現はFZ細胞にEWS-FLI1遺伝子を一過的に導入することで増大した（データ省略）。上記した通り、マウスのユーイング肉腫は同系のマウスに連続的に移植可能であり、増殖能も高い。二次腫瘍の浸潤領域ではβ-カテニンの発現増大が頻繁に観察され（データ省略）、該経路が腫瘍の維持及び／又は悪性進行に役割を担っている可能性が示唆された。
7. 決定的なシグナルの抑制による腫瘍増殖の阻害
Cre/loxpシステムを用いた遺伝的組換え及びEWS-FLI1導入遺伝子のノックアウトにより、腫瘍の増殖が完全に停止し（図6C）、老化様の細胞表現型が誘導された（図6D）。従って、マウスのユーイング肉腫はEWS-FLI1活性に依存している。この結果は、EWS-FLI1及びその下流のシグナルが治療の有効な標的であることを示している。実際に、遺伝子ノックダウン実験によると、FLI1, Dkk2, Catnb, Prkcb1又はEzh2遺伝子に特異的なsiRNA処理によって腫瘍細胞の増殖が有意に阻害された（図6E）。さらに、MEK1阻害剤（U0126）によりEGF/RAS/MAPK経路を抑制すると、インビトロで用量依存的に腫瘍の増殖が阻害された（図6F）。これらの結果は、ユーイング肉腫の進行においてEWS-FLI1により活性化されるこれらのシグナル経路の重要性、及び臨床治療の新規標的としてのその有望性を証明している。
Cre/loxpシステムを用いた遺伝的組換え及びEWS-FLI1導入遺伝子のノックアウトにより、腫瘍の増殖が完全に停止し（図6C）、老化様の細胞表現型が誘導された（図6D）。従って、マウスのユーイング肉腫はEWS-FLI1活性に依存している。この結果は、EWS-FLI1及びその下流のシグナルが治療の有効な標的であることを示している。実際に、遺伝子ノックダウン実験によると、FLI1, Dkk2, Catnb, Prkcb1又はEzh2遺伝子に特異的なsiRNA処理によって腫瘍細胞の増殖が有意に阻害された（図6E）。さらに、MEK1阻害剤（U0126）によりEGF/RAS/MAPK経路を抑制すると、インビトロで用量依存的に腫瘍の増殖が阻害された（図6F）。これらの結果は、ユーイング肉腫の進行においてEWS-FLI1により活性化されるこれらのシグナル経路の重要性、及び臨床治療の新規標的としてのその有望性を証明している。
8. ユーイング肉腫を標的とした治療法の検討のための本マウスモデルの使用
ヒトのがんの動物モデルは新規な治療法の評価のためのプラットフォームを提供する。理想的には、ヒトとモデル系の表現型及び発達メカニズムは類似しているべきである。そこで、Wnt/β-カテニン経路、EZH2及びPARP1の特異的阻害剤について、本モデルを用いてインビトロ及びインビボの両者で検討した。
ヒトのがんの動物モデルは新規な治療法の評価のためのプラットフォームを提供する。理想的には、ヒトとモデル系の表現型及び発達メカニズムは類似しているべきである。そこで、Wnt/β-カテニン経路、EZH2及びPARP1の特異的阻害剤について、本モデルを用いてインビトロ及びインビボの両者で検討した。
β-カテニン阻害剤であるiCRT14及びPNU74654は、マウス及びヒト両者のユーイング肉腫細胞の増殖をインビトロで有意に抑制し、EZH2阻害剤であるDZNePは、中程度であるが有意に増殖を抑制した（図7A）。ユーイング肉腫特異的に増殖を阻害することが報告されているPARP1阻害剤のOlaparib（Garnett MJ et al. 2012. Nature 483: 570-575.）もまた、マウス及びヒト両者のユーイング肉腫を抑制した（図7A）。細胞周期の解析によると、iCRT14及びDZNePによりG1集団の増大及びG2/M集団の低下が認められ、細胞周期の停止が確認された（図7B）。PNU74654及びOlaparibでもサブG1集団の増大が認められ、アポトーシスの誘導が示された（図7B）。これらの試薬は、ユーイング肉腫のインビボの増殖も抑制し、その効果はiCRT14、Olaparib、DZNeP及びPNU74654の順で高かった（図7C）。このように、本モデルはインビトロ及びインビボの両者で新規治療薬を探索・評価するための有効なツールを提供する。
Claims (12)
- 非ヒト動物胚の長管骨の骨端部表層から分離されたフェイシャルゾーン細胞集団にEWS-ETS融合遺伝子を導入してなる細胞集団を、非ヒト動物に移植することを含む、ユーイング肉腫非ヒトモデル動物の作出方法。
- 非ヒト動物胚の長管骨の骨端部表層から分離されたフェイシャルゾーン細胞集団にEWS-ETS融合遺伝子を導入する工程と、前記融合遺伝子が導入された前記細胞集団を非ヒト動物に移植する工程とを含む、請求項１記載の方法。
- 前記EWS-ETS融合遺伝子が、EWS-ERG融合遺伝子及びEWS-FLI1融合遺伝子から選択される少なくとも１つである、請求項１又は２記載の方法。
- EWS-ETS融合遺伝子の導入は、EWS-ETS融合遺伝子が組み込まれた組換えウイルスをフェイシャルゾーン細胞集団に感染させることにより行われる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組換えウイルスは組換えレトロウイルスである請求項４記載の方法。
- 非ヒト動物胚の長管骨の骨端部表層から分離されたフェイシャルゾーン細胞集団にEWS-ETS融合遺伝子を導入してなる細胞集団が移植されていることを特徴とする、ユーイング肉腫非ヒトモデル動物。
- 前記EWS-ETS融合遺伝子が、EWS-ERG融合遺伝子及びEWS-FLI1融合遺伝子から選択される少なくとも１つである、請求項６記載の非ヒトモデル動物。
- 非ヒト動物胚の長管骨の骨端部表層から分離されたフェイシャルゾーン細胞集団にEWS-ETS融合遺伝子を導入してなる細胞集団。
- 前記EWS-ETS融合遺伝子が、EWS-ERG融合遺伝子及びEWS-FLI1融合遺伝子から選択される少なくとも１つである、請求項８記載の細胞集団。
- ユーイング肉腫非ヒトモデル動物を作出するための移植用細胞集団である請求項８又は９記載の細胞集団。
- 請求項６又は７記載のモデル動物に化合物を投与し、肉腫の増殖が抑制されるか否かを調べることを含む、ユーイング肉腫の治療又は予防に有効な化合物のスクリーニング方法。
- 請求項６又は７記載のモデル動物に化合物を投与し、肉腫の増殖が抑制されるか否かを調べることを含む、前記化合物のユーイング肉腫治療又は予防効果の評価方法。
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|---|---|---|---|
| PCT/JP2013/074139 WO2015033447A1 (ja) | 2013-09-06 | 2013-09-06 | ユーイング肉腫非ヒトモデル動物 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2015033447A1 true WO2015033447A1 (ja) | 2015-03-12 |
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ID=52627952
Family Applications (1)
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-
2013
- 2013-09-06 WO PCT/JP2013/074139 patent/WO2015033447A1/ja active Application Filing
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| D ENEEN,B. ET AL.: "Loss of p16 pathways stabilizes EWS/FLI1 expression and complements EWS/FLI1 mediated transformation.", ONCOGENE, vol. 20, no. 46, pages 6731 - 41 * |
| MIWA TANAKA ET AL.: "Ewing Nikushu Model Mouse o Mochiita Hassei Kigen no Dotei to Idenshi Hatsugen Kaiseki", NIPPON BYORI GAKKAI KAISHI, vol. 101, no. 1, 26 March 2012 (2012-03-26), pages 269, 2 - G-12 * |
| MIWA TANAKA ET AL.: "Mouse Model o Riyo shita Ewing Nikushu no Hatsugan Katei no Kaiseki", NIPPON BYORI GAKKAI KAISHI, vol. 100, no. 1, 26 March 2011 (2011-03-26), pages 350, 3 - H-1 * |
| ZUCMAN,J. ET AL.: "Combinatorial generation of variable fusion proteins in the Ewing family of tumours.", EMBO J., vol. 12, no. 12, December 1993 (1993-12-01), pages 4481 - 7 * |
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