CN103571792A

CN103571792A - 一种体外扩增肿瘤干细胞的方法

Info

Publication number: CN103571792A
Application number: CN201210259932.9A
Authority: CN
Inventors: 马小军; 刘畅; 孙广炜; 徐小溪; 刘洋; 于炜婷
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Zhangjiagang Institute Of Industrial Technology Dalian Institute Of Chemical Physics China Academy Of Sciences
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2012-07-25
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2032-07-25
Also published as: CN103571792B

Abstract

本发明是一种体外扩增肿瘤干细胞的方法，即利用海藻酸盐凝胶支架对肿瘤细胞进行体外三维培养，通过改变海藻酸钠的分子量、古罗糖醛酸含量与甘露糖醛酸含量（GM）比、钙离子浓度、钙化时间等支架制备参数调控凝胶支架的刚度，用于模拟不同肿瘤组织微环境中细胞外基质的软硬程度，以实现不同组织来源肿瘤干细胞的体外扩增。本发明操作简单，成本低廉，性能可控，易于规模放大，是一种很好的将不同来源的肿瘤干细胞进行体外扩增的方法。

Description

一种体外扩增肿瘤干细胞的方法

技术领域

本发明涉及提供一种体外扩增肿瘤干细胞的方法，特别涉及一种基质刚度可控的海藻酸盐凝胶支架的制备。

背景技术

肿瘤干细胞已被证实为恶性肿瘤转移和复发的根本原因，其研究对于阐明肿瘤的发生机制、生物学行为以及为今后寻找靶向肿瘤干细胞的根治治疗方案都具有十分重要的意义。然而肿瘤干细胞在肿瘤组织及肿瘤细胞系中含量很低，难以得到足够量的纯度高的肿瘤干细胞用于研究，这是当前肿瘤干细胞研究所面临的障碍之一。

细胞微环境按其性能可分为生物化学因素和生物物理因素。基质刚度（substrate stiffness）作为生物物理因素之一，近年来被证实与细胞生物学行为密切相关。体内实体组织表现出一系列的刚度，用弹性模量（E）来表示，例如脑组织为0.1-1kPa，肌肉组织为10kPa-15kPa，而骨组织为25-45kPa。对于干细胞，培养基质的刚度影响其未分化状态：刚度为0.6kPa时，胚胎干细胞可长期维持在未分化状态；适当的基质刚度（12kPa）促进骨骼肌干细胞的自我增殖。骨髓间充质干细胞（MSC细胞）的分化方向也受到基质刚度调节；当培养环境的刚度类似肌肉组织的刚度时，MSC细胞会分化成肌肉细胞；而周围环境刚度降到和脑组织相似的时候，MSC细胞则会分化成神经细胞。对于肿瘤细胞，基质刚度则参与调解其增殖、转移等生物学行为。在较硬的基质上，肿瘤细胞伸展，形成应力纤维和成熟的黏着斑，迅速转移；在与正常组织相似硬度的基质上，肿瘤细胞呈圆形，失去转移能力，增殖减缓。研究表明，基质刚度对肿瘤生物学行为的调节是通过细胞膜表面的跨膜蛋白受体integrin提高胞外信号调解激酶（ERK）活性和增加ROCK（Rho kinase）产生的收缩。有证据表明，肿瘤干细胞特性的维持有赖于特殊的肿瘤微环境，而该微环境中的生物物理因素—基质刚度是调控肿瘤干细胞生物学行为的重要因素。因此，不同组织来源的肿瘤干细胞其最适基质刚度是不同的。本发明利用的海藻酸盐凝胶体系能够构建出不同基质刚度即适合不同来源的肿瘤干细胞进行体外扩增，是一种普适性的肿瘤干细胞体外扩增体系。

目前肿瘤干细胞的体外培养主要由与滋养层细胞共培养或通过特殊的干细胞培养基来实现，虽然滋养层细胞分泌的某些细胞因子能够在一定程度上达到维持肿瘤干细胞不分化的目的，但与体内肿瘤组织的三维生长方式不同，该方法中肿瘤干细胞呈现一种二维生长方式，失去了肿瘤干细胞的众多特性。取而代之的是利用添加生长因子EGF和bFGF的干细胞培养基扩增肿瘤干细胞。然而，该培养基以及生长因子价格十分昂贵，不利于培养体系的放大。

发明内容

本发明的是一种体外扩增肿瘤干细胞的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种体外扩增肿瘤干细胞的方法，

1）确定所需体外扩增肿瘤干细胞于生物体内所处环境的基质刚度；

2）利用海藻酸盐凝胶支架包埋所需体外扩增肿瘤细胞，使包埋后的凝胶支架的基质刚度为步骤1）所确定的肿瘤干细胞所处环境的基质刚度的90-110%；

3）进行包埋后肿瘤细胞的体外三维培养，以实现肿瘤干细胞的体外扩增。

即利用海藻酸盐凝胶支架包埋肿瘤细胞，并进行体外三维培养（示意图1），通过改变海藻酸钠的分子量、GM比、浓度及形成凝胶所必需的二价阳离子浓度和作用时间等凝胶支架制备参数调控凝胶支架的基质刚度，以实现不同组织来源的肿瘤干细胞的体外扩增。

其特征在于：所述海藻酸钠分子量范围为100-1000kDa、浓度为0.5%-3%、G/M比范围为0.2-0.7；并且海藻酸钠包括使用多肽(如精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸，即RGD等)或有机化合物(如聚乙二醇等)进行修饰。

所述二价阳离子种类为钙、钡等阳离子，浓度范围为10mmol·L^-1-300mmol·L^-1，作用时间为15-60分钟；

所述凝胶支架为200微米至5毫米的凝胶微球以及其它形状如立方体、片层状等；

所述凝胶支架的基质刚度在1kPa-100kPa之间；

所述不同肿瘤组织来源的肿瘤细胞为肝癌、肺癌、头颈部鳞癌、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、胶质瘤来源的一种；

所述构建不同基质刚度的凝胶支架可以通过改变海藻酸钠的分子量、浓度、G/M比和二价阳离子浓度及作用时间来实现。

所述肿瘤干细胞包括肝癌、肺癌、头颈部鳞癌、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、胶质瘤干细胞中的一种。

所述体外三维培养为静态或者动态条件下的细胞三维培养。

所述锐孔挤压法为一种公知的技术，如静电液滴法。

本发明具有如下优点：

1．操作简单，成本低，本发明利用海藻酸盐凝胶作为细胞三维培养的载体，容易制备，避免使用昂贵材料和工艺；

2．海藻酸盐凝胶为其内部细胞提供了三维生长环境，且制备的凝胶其基质刚度具有可控性；

3.本发明不但在常规静态培养下能实现对肿瘤干细胞的扩增，还可以应用到动态培养体系如转瓶培养体系中，利于规模化放大；

4．应用范围广，本发明方法通过模拟不同来源肿瘤的微环境，能够适合不同组织来源的肿瘤干细胞进行体外扩增，并可用于抗肿瘤药物的筛选。

附图说明

图1为利用海藻酸盐凝胶体外三维培养肿瘤细胞的示意图。

图2为利用不同基质刚度海藻酸钙凝胶培养的舌鳞癌细胞：(A)海藻酸钠浓度为1.5%（w/v）;(B)海藻酸钠浓度为2.5%（w/v）;(C)海藻酸钠浓度为3%（w/v）。

图3为不同基质刚度对肿瘤干细胞相关基因表达的影响。(A)Oct3/4;(B)Nanog;(C)ABCG2:(D)CD44。

图4为浓度0.5%（w/v）的海藻酸钠形成的凝胶培养的肝癌细胞。

图5为不同浓度钙离子形成海藻酸钙凝胶培养的肿瘤细胞其Oct3/4基因的表达情况。

具体实施方式

实施例1：扩增舌鳞癌干细胞

1）确定舌鳞癌干细胞于人体内所处环境的基质刚度为8-17kPa（Engler,A.J.,et al.,Matrix Elasticity Directs Stem Cell LineageSpecification.Cell,2006.126(4):p.677-689.）;

2）将舌鳞癌细胞分别与不同浓度1.5％、2.5％、3%(g/100ml)的海藻酸钠(分子量200kDa，GM比0.4)溶液混合，调整细胞密度为10⁶cells·mL^-1，利用静电液滴法滴入100mmol·L^-1CaCl₂溶液中，室温钙化30min，形成粒径400-500um海藻酸钙凝胶。其凝胶支架的基质刚度为4kPa、10kPa、20kPa;

3）之后，用DMEM培养液洗涤3次，然后添加含有质量浓度10%胎牛血清的DMEM培养液，于37°C、5%CO₂、饱和湿度条件下培养，每2天更换培养液。培养15天后（图2），利用55mmol·L^-1柠檬酸钠溶解包埋有舌鳞癌细的海藻酸钙凝胶，收获内部类组织化细胞团，提RNA，分析Oct3/4、Nanog等干细胞自我更新相关基因表达（Schrader,J.,et al.,Matrix stiffness modulates proliferation,chemotherapeutic response,and dormancy in hepatocellular carcinomacells.Hepatology,2011.53(4):p.1192-1205.）,

实验结果见图3。结果显示，浓度为1%的海藻酸钠形成的海藻酸钙凝胶（ALG-BEADS）培养的舌鳞癌细胞中干细胞相关的基因表达最高。说明该弹性模量的海藻酸钙凝胶适合舌鳞癌干细胞的体外扩增。

实施例2：扩增肝癌干细胞

1）确定肝癌干细胞于人体内所处环境的基质刚度为0.6-3kPa（YEH,W.-C.,Elastic modulus measurements of human liver andcorrelation with pathology.Ultrasound in Med.&Biol,2002.28（4）：p.467-474.）；

2）将肝癌细胞与0.5%(g/100ml)的海藻酸钠(分子量200kDa，GM比0.4)溶液混合，调整细胞密度为10⁶cells·mL^-1，利用静电液滴法滴入100mmol·L^-1CaCl₂溶液中，室温钙化30min，形成粒径300-400um海藻酸钙凝胶。其凝胶支架的基质刚度为1kPa。

3）之后，用培养液洗涤3次，然后添加含有10%胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养，每2天更换培养液。

培养一段15天后（图4），利用55mmol·L^-1柠檬酸钠溶解海藻酸钙凝胶，收获内部类组织化细胞团，提RNA，分析肝癌干细胞标记物在的表达情况。结果表明，肝癌干细胞标记物CD90、CD133表达均显著上调。说明该弹性模量的海藻酸钙凝胶适合肝癌干细胞的体外扩增。

实施例3：通过改变钙离子浓度改变凝胶支架弹性模量

将肝癌细胞与0.5%(g/100ml)的海藻酸钠(分子量430kDa，GM比0.4)溶液混合，调整细胞密度为10⁶cells·mL^-1，利用静电液滴法分别滴入25mmol·L^-1、50mmol·L^-1、100mmol·L^-1、200mmol·L^-1CaCl₂溶液中，室温钙化30min，形成粒径300-400um海藻酸钙凝胶。之后，用培养液洗涤3次，然后添加含有10%胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养，每2天更换培养液。

培养一段时间后，用55mmol·L^-1柠檬酸钠溶解海藻酸钙凝胶，收获内部类组织化细胞团，提RNA，分析相关基因表达情况。结果表明，随着钙离子浓度增加，干细胞因子Oct3/4的表达上调，且当钙离子浓度为200mM时，Oct3/4上调40多倍（图5）。当海藻酸钠质量浓度为0.5%，钙离子浓度为200mM时形成海藻酸钙凝胶的弹性模量与肝组织弹性模量最接近，因此最适合肝癌干细胞的体外扩增。

Claims

1.一种体外扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：

2.按照权利要求1所述的扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：

利用海藻酸盐凝胶支架包埋肿瘤细胞，并进行体外三维培养；通过改变海藻酸钠分子量、GM比、浓度以及形成凝胶必需的阳离子浓度和反应时间等支架制备参数调控凝胶支架的基质刚度，模拟不同肿瘤组织的基质刚度，以实现肿瘤干细胞的体外扩增。

3.按照权利要求1所述的扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：

所述肿瘤细胞为不同肿瘤组织来源的肿瘤细胞，它们为肝癌、肺癌、头颈部鳞癌、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、胶质瘤来源的一种；

对应的，所述肿瘤干细胞为肝癌、肺癌、头颈部鳞癌、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、胶质瘤来源的肿瘤干细胞的一种；

所述体外三维培养为静态或者动态的细胞三维培养。

4.按照权利要求1所述扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：

利用海藻酸盐凝胶支架包埋所需体外扩增肿瘤细胞过程为：将肿瘤细胞与海藻酸钠溶液均匀混合，利用锐孔挤压法将混合后的溶液喷射入含有二价阳离子的溶液中，作用一定时间后得到包埋有肿瘤细胞的海藻酸盐球形凝胶支架；

或者采用直接将混合均匀的肿瘤细胞与海藻酸钠溶液转移到孔板中，加入含有二价阳离子的溶液，作用一定时间后，根据需要切割为所需形状的海藻酸盐凝胶支架；

肿瘤细胞于海藻酸钠溶液中的密度为10⁵-10⁷cells·mL^-1；所述海藻酸钠溶液的质量浓度为0.5%-3%；

所述二价阳离子种类为钙或钡离子，它们于溶液中的浓度为10mmol·L^-1-300mmol·L^-1、作用时间为15-60分钟。

5.按照权利要求4所述的扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：所述海藻酸钠分子量为100-1000KDa、GM比范围为0.2-0.7。

6.按照权利要求4或5所述的扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：所述海藻酸钠为使用多肽或有机化合物进行修饰后的海藻酸钠。

7.按照权利要求4所述的扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：权利要求4所获得的包埋有肿瘤细胞的海藻酸盐凝胶支架表面用聚赖氨酸或壳聚糖修饰，得到修饰的海藻酸盐凝胶支架。

8.按照权利要求4或5所述的扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：所述凝胶支架的基质刚度在1-100kPa之间。

9.按照权利要求4或7所述的扩增肿瘤干细胞的方法，其特征在于：所述海藻酸盐凝胶支架粒径为200微米至5毫米。