CN114606202A - 一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒繁殖技术领域，尤其涉及一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基及其应用，本发明的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，包括以下重量份原料：DMEM培养基85‑95份、片状载体2‑5份、微量元素10‑20份、维生素0.5‑2份、氨基酸1‑3份，所述片状载体是以改性载体纤维经过压合、剪切制成，所述改性载体纤维为葛根纤维经过聚乙二醇改性而得。本发明制备得到的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，不仅能够为细胞繁殖培养提供营养物质，同时能够调整培养基贴壁因子，使得细胞适应悬浮培养，培养出免疫原性良好的圆环病毒。

Description

一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基及其应用
技术领域
本发明涉及病毒繁殖技术领域，尤其涉及一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基及其应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(PCV2)属于圆环病毒科，感染PCV2后导致母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎、猪皮炎、肾病综合征(PDNS)、断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)以及猪的先天性震颤等疾病。该病毒在全国各地区广泛流行，给世界养猪业带来了巨大的影响和严重的经济损失，现在对于猪圆环病毒2型主要以疫苗预防为主。目前疫苗生产中，常用PK-15细胞增殖PCV2,但由于PCV2体外增殖能力弱,致使PCV2抗原含量较低,因此,PCV2的抗原含量高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。
大规模细胞培养核心技术是提升单位体积内PK-15细胞的数量,其中微载体悬浮培养、片状载体悬浮培养、全悬浮培养是当前较为成熟的一项大规模细胞培养技术，在国内外已成功应用于兽用疫苗抗原制备，这三种培养技术具有自动化控制程度高、不易污染、易于大规模生产、抗原产量和含量高等优点，其中，片状载体悬浮培养在单位体积内细胞的数量要大于微载体悬浮培养。而现有的片状载体，大多采用聚丙烯或聚酯无纺布制成，病毒附着率有待提升。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基及其应用，不仅能够为细胞繁殖培养提供营养物质，同时能够调整培养基贴壁因子，使得细胞适应悬浮培养，培养出免疫原性良好的圆环病毒。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，包括以下重量份原料：DMEM培养基85-95份、片状载体2-5份、微量元素10-20份、维生素0.5-2份、氨基酸1-3份，所述片状载体是以改性载体纤维经过压合、剪切制成，所述改性载体纤维为葛根纤维经过聚乙二醇改性而得。
本发明的悬浮培养基，改性载体纤维为原料制备得到片状载体，其中，葛根中的多糖类物质能够促进细胞的活性，使得细胞适应悬浮培养，而加入的改性载体纤维，其不仅能够作为微生物的载体物质，为细胞的繁殖提供营养物质，同时通过在葛根纤维中引入聚乙二醇，从而使得葛根纤维具有两亲性，不仅能够使得其更好的分散在水中，减少团聚，葛根纤维中的物质还具有一定的成膜性和粘附性，能够调整贴壁因子，也有利于细胞在片状载体表面的粘附，培养免疫原性良好的圆环病毒。
进一步，包括以下重量份原料：DMEM培养基90份、片状载体3份、微量元素12份、维生素1份、氨基酸2份。
进一步，所述微量元素包括：250-300mg/L氯化钾、1500-2000mg/L碳酸氢钠、0.03-0.2mg/L硫酸铜、50-60mg/L硫酸镁、1-1.5mg/L氯化铁。
进一步，所述维生素包括：2-4mg/L叶酸、6-10mg/L烟酰胺、10-15mg/L维生素C、50-65mg/L氯化胆碱。
进一步，所述氨基酸包括：200-220mg/L谷氨酸、300-350mg/L脯氨酸、160-180mg/L胱氨酸、300-320mg/L络氨酸、400-460mg/L丝氨酸、800-900mg/L天冬氨酸。
进一步，所述片状载体的制备方法为：取制备得到的改性载体纤维，加入乙醇溶液中，再加入硅烷偶联剂，搅拌混合均匀，加入十二烷基磺酸钠，持续搅拌，升温至70-80℃，保温反应10-12h，反应完成后，冷却至室温，压滤，得到滤饼于40-45℃温度下烘干，剪切、破碎得到片状载体。
进一步，所述改性载体纤维的制备方法包括以下步骤：
所述改性载体纤维的制备方法包括以下步骤：
S1：取葛渣，清洗去除杂质后加入复合酶，于50-60℃温度下进行酶解处理1-1.5h，反应完成后过滤，滤饼抖散、烘干得到葛根粗纤维；
S2：将制备得到的葛根粗纤维搅拌分散于硝酸钙溶液中，得到混悬液，将混悬液于70-75MPa压力下进行高压匀质3次，旋转蒸干得到反应产物置于管式炉中，在氮气气氛下，升温至600-650℃温度下煅1-2h，煅烧完成后随炉冷却，取出喷洒加入去离子水，静置20min，浸泡于去离子水中，超声振荡洗涤，过滤、烘干得到葛根纤维；
S3：分别称取巯基乙酸和聚乙二醇加入甲苯中，搅拌混匀后加入对甲苯磺酸，然后在氮气气氛下搅拌升温至100-120℃，保温反应12-14h，得到反应产物用乙醚沉淀，过滤，滤饼烘干后加入N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解后，加入2,4-二异氰酸酯，然后加入葛根纤维，在氮气气氛下，升温至70-80℃，保温反应150-180min，反应完成后趁热过滤，滤饼用无水乙醇浸泡洗涤，再用去离子水透析3d，干燥得到改性载体纤维。
本发明的改性载体纤维，利用葛渣为原料，在复合酶的作用下，对葛根纤维的木质素、纤维素等进行分解，使得葛根纤维进行帚化疏解，提高葛根纤维的蓬松度和柔软度，然后再将其置于硝酸钙溶液中，吸附负载硝酸钙后通过煅烧，一方面实现对葛根纤维的部分碳化，使得葛根纤维表面变得粗糙有利于微生物的负载，另一方面硝酸钙经过煅烧形成氧化钙，在煅烧完成后喷洒的去离子水和纤维上的氧化钙反应，产生碱性的请氧化钙并产热，对葛根纤维进行活化，有利于后续的聚乙二醇的改性。
进一步，所述S1步骤的复合酶为α-淀粉酶和纤维素酶的复合物，所述α-淀粉酶和纤维素酶的质量比为1:(2-5)。
此外，本发明还公开了上述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基的应用，将培养基应用于猪圆环病毒2型的培养中。
本发明的有益效果：
本发明的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，通过对原料成分的调整，能够促进细胞活性，同时以改性葛根纤维为原料，制备得到片状载体，不仅能够为细胞繁殖培养提供营养物质，同时能够调整培养基贴壁因子，提高细胞在片状载体上的负载性，有利于提高细胞浓度，培养免疫原性良好的圆环病毒。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例一
改性载体纤维的制备
S1：取200g提取完葛根提取物后的葛渣，清洗去除杂质后，加入4L水，再加入6g复合酶，其中复合酶包括2gα-淀粉酶和4g纤维素酶，于60℃温度下进行酶解处理1h，反应完成后过滤，滤饼抖散、烘干得到葛根粗纤维；
S2：将20g制备得到的葛根粗纤维搅拌分散于100ml、18wt％硝酸钙溶液中，得到混悬液，将混悬液于75MPa压力下进行高压匀质3次，旋转蒸干得到反应产物置于管式炉中，在氮气气氛下，升温至620℃温度下煅1-2h，煅烧完成后随炉冷却，取出喷洒加入5g去离子水，静置20min，浸泡于去离子水中，超声振荡洗涤，过滤、烘干得到葛根纤维；
S3：分别称取0.5g巯基乙酸和3g聚乙二醇加入200mL甲苯中，搅拌混匀后加入9mg对甲苯磺酸，然后在氮气气氛下搅拌升温至100℃，保温反应12h，得到反应产物用乙醚沉淀，过滤，滤饼烘干后加入300mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解后，加入0.5g 2,4-二异氰酸酯，然后加入10g葛根纤维，在氮气气氛下，升温至75℃，保温反应180min，反应完成后趁热过滤，滤饼用无水乙醇浸泡洗涤，再用去离子水透析3d，干燥得到改性载体纤维。
片状载体的制备：取5g制备得到的改性载体纤维，加入100mL、60wt％乙醇溶液中，再加入0.3g乙烯基三乙氧基硅烷，搅拌混合均匀，加入1g十二烷基磺酸钠，持续搅拌，升温至70℃，保温反应11h，反应完成后，冷却至室温，压滤，得到滤饼于45℃温度下烘干，剪切、破碎得到片状载体，经检测制备得到片状载体的平均厚度位0.42mm，孔径为12μm，可供细胞生长的比表面积约为1600cm2/g。
本实施例的培养基包括以下重量份原料：DMEM培养基90份、片状载体3份、微量元素12份、维生素1份、氨基酸2份。
微量元素包括：250mg/L氯化钾、1600mg/L碳酸氢钠、0.03mg/L硫酸铜、55mg/L硫酸镁、1.5mg/L氯化铁。
维生素包括：4mg/L叶酸、8mg/L烟酰胺、15mg/L维生素C、50mg/L氯化胆碱。
氨基酸包括：220mg/L谷氨酸、320mg/L脯氨酸、160mg/L胱氨酸、310mg/L络氨酸、460mg/L丝氨酸、850mg/L天冬氨酸。
实施例二
改性载体纤维的制备
S1：取200g提取完葛根提取物后的葛渣，清洗去除杂质后，加入5L水，再加入6g复合酶，其中复合酶包括1gα-淀粉酶和5g纤维素酶，于60℃温度下进行酶解处理1h，反应完成后过滤，滤饼抖散、烘干得到葛根粗纤维；
S2：将20g制备得到的葛根粗纤维搅拌分散于100ml、20wt％硝酸钙溶液中，得到混悬液，将混悬液于70MPa压力下进行高压匀质3次，旋转蒸干得到反应产物置于管式炉中，在氮气气氛下，升温至600℃温度下煅1-2h，煅烧完成后随炉冷却，取出喷洒加入5g去离子水，静置20min，浸泡于去离子水中，超声振荡洗涤，过滤、烘干得到葛根纤维；
S3：分别称取0.6g巯基乙酸和3g聚乙二醇加入200mL甲苯中，搅拌混匀后加入9mg对甲苯磺酸，然后在氮气气氛下搅拌升温至110℃，保温反应13h，得到反应产物用乙醚沉淀，过滤，滤饼烘干后加入300mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解后，加入0.3g 2,4-二异氰酸酯，然后加入10g葛根纤维，在氮气气氛下，升温至70℃，保温反应150min，反应完成后趁热过滤，滤饼用无水乙醇浸泡洗涤，再用去离子水透析3d，干燥得到改性载体纤维。
片状载体的制备：取5g制备得到的改性载体纤维，加入100mL、65wt％乙醇溶液中，再加入0.3g乙烯基三乙氧基硅烷，搅拌混合均匀，加入1.2g十二烷基磺酸钠，持续搅拌，升温至75℃，保温反应12h，反应完成后，冷却至室温，压滤，得到滤饼于40℃温度下烘干，剪切、破碎得到片状载体经检测制备得到片状载体的平均厚度位0.41mm，孔径为15μm，可供细胞生长的比表面积约为1650cm2/g。
本实施例的培养基包括以下重量份原料：DMEM培养基85份、片状载体5份、微量元素10份、维生素0.5份、氨基酸3份。
微量元素包括：300mg/L氯化钾、1500mg/L碳酸氢钠、0.1mg/L硫酸铜、60mg/L硫酸镁、1.2mg/L氯化铁。
维生素包括：3mg/L叶酸、10mg/L烟酰胺、12mg/L维生素C、65mg/L氯化胆碱。
氨基酸包括：210mg/L谷氨酸、350mg/L脯氨酸、170mg/L胱氨酸、320mg/L络氨酸、430mg/L丝氨酸、900mg/L天冬氨酸。
实施例三
改性载体纤维的制备
S1：取200g提取完葛根提取物后的葛渣，清洗去除杂质后，加入6L水，再加入6g复合酶，其中复合酶包括1.2gα-淀粉酶和4.8g纤维素酶，于55℃温度下进行酶解处理1.5h，反应完成后过滤，滤饼抖散、烘干得到葛根粗纤维；
S2：将20g制备得到的葛根粗纤维搅拌分散于100ml、15wt％硝酸钙溶液中，得到混悬液，将混悬液于75MPa压力下进行高压匀质3次，旋转蒸干得到反应产物置于管式炉中，在氮气气氛下，升温至650℃温度下煅1-2h，煅烧完成后随炉冷却，取出喷洒加入5g去离子水，静置20min，浸泡于去离子水中，超声振荡洗涤，过滤、烘干得到葛根纤维；
S3：分别称取0.6g巯基乙酸和4g聚乙二醇加入200mL甲苯中，搅拌混匀后加入8mg对甲苯磺酸，然后在氮气气氛下搅拌升温至120℃，保温反应14h，得到反应产物用乙醚沉淀，过滤，滤饼烘干后加入300mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解后，加入0.4g 2,4-二异氰酸酯，然后加入10g葛根纤维，在氮气气氛下，升温至80℃，保温反应160min，反应完成后趁热过滤，滤饼用无水乙醇浸泡洗涤，再用去离子水透析3d，干燥得到改性载体纤维。
片状载体的制备：取5g制备得到的改性载体纤维，加入100mL、60wt％乙醇溶液中，再加入0.3g乙烯基三甲氧基硅烷，搅拌混合均匀，加入0.8g十二烷基磺酸钠，持续搅拌，升温至80℃，保温反应10h，反应完成后，冷却至室温，压滤，得到滤饼于45℃温度下烘干，剪切、破碎得到片状载体经检测制备得到片状载体的平均厚度位0.44mm，孔径为13μm，可供细胞生长的比表面积约为1500cm2/g。
本实施例的培养基包括以下重量份原料：DMEM培养基95份、片状载体2份、微量元素20份、维生素2份、氨基酸1份。
微量元素包括：280mg/L氯化钾、2000mg/L碳酸氢钠、0.2mg/L硫酸铜、50mg/L硫酸镁、1mg/L氯化铁。
维生素包括：2mg/L叶酸、6mg/L烟酰胺、10mg/L维生素C、55mg/L氯化胆碱。
氨基酸包括：200mg/L谷氨酸、300mg/L脯氨酸、180mg/L胱氨酸、300mg/L络氨酸、400mg/L丝氨酸、800mg/L天冬氨酸。
对比例一
本对比例和实施例一相比，其不同之处在于，本对比例的改性载体纤维在制备的时候不经过S2步骤处理，即改性载体纤维的制备具体为：
S1：取200g提取完葛根提取物后的葛渣，清洗去除杂质后，加入4L水，再加入6g复合酶，其中复合酶包括2gα-淀粉酶和4g纤维素酶，于60℃温度下进行酶解处理1h，反应完成后过滤，滤饼抖散、烘干得到葛根粗纤维；
S3：分别称取0.5g巯基乙酸和3g聚乙二醇加入200mL甲苯中，搅拌混匀后加入9mg对甲苯磺酸，然后在氮气气氛下搅拌升温至100℃，保温反应12h，得到反应产物用乙醚沉淀，过滤，滤饼烘干后加入300mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解后，加入0.5g 2,4-二异氰酸酯，然后加入10g葛根纤维，在氮气气氛下，升温至75℃，保温反应180min，反应完成后趁热过滤，滤饼用无水乙醇浸泡洗涤，再用去离子水透析3d，干燥得到改性载体纤维。
片状载体的制备、培养基的配方与实施例一相同，经检测制备得到片状载体的平均厚度位0.44mm，孔径为18μm，可供细胞生长的比表面积约为1300cm2/g。
对比例二
本对比例和实施例一相比，其不同之处在于，本对比例的改性载体纤维不经过聚乙二醇改性处理，即改性载体纤维的具体制备为：
S1：取200g提取完葛根提取物后的葛渣，清洗去除杂质后，加入4L水，再加入6g复合酶，其中复合酶包括2gα-淀粉酶和4g纤维素酶，于60℃温度下进行酶解处理1h，反应完成后过滤，滤饼抖散、烘干得到葛根粗纤维；
S2：将20g制备得到的葛根粗纤维搅拌分散于100ml、18wt％硝酸钙溶液中，得到混悬液，将混悬液于75MPa压力下进行高压匀质3次，旋转蒸干得到反应产物置于管式炉中，在氮气气氛下，升温至620℃温度下煅1-2h，煅烧完成后随炉冷却，取出喷洒加入5g去离子水，静置20min，浸泡于去离子水中，超声振荡洗涤，过滤、烘干得到改性载体纤维。
片状载体的制备、培养基的配方与实施例一相同，经检测制备得到片状载体的平均厚度位0.41mm，孔径为13μm，可供细胞生长的比表面积约为1500cm2/g。
利用实施例一～实施例三，对比例一、对比例二制备得到的培养基进行猪圆环病毒2型的培养，同时以现有的含有5％胎牛血清的DMEM培养基作为对照，培养采用现有的方法进行，培养完成收获病毒后按照“猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBNSX0 7株)制造及检验试行规程”进行病毒滴度的测定,每个组别进行3次重复试验，测试结果如表1所示：
表1
实施例一 实施例二 实施例三 对比例一 对比例二 对照组
TCID<sub>50</sub>/mL 10<sup>6.2</sup> 10<sup>6.1</sup> 10<sup>6.3</sup> 10<sup>5.6</sup> 10<sup>5.7</sup> 10<sup>5.5</sup>
通过表1数据可以看出，采用本申请的培养基进行猪圆环病毒2型的培养，病毒滴度显著提高，而通过实施例一和对比例一、对比例二的数据可以看出，当改性载体纤维不进行S2步骤处理时会导致得到的片状载体可供细胞生长的比表面积降低，而不进行S3步骤聚乙二醇改性则会降低载体对细胞的聚集，均会对细胞的繁殖产生影响。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (9)

1.一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，包括以下重量份原料：DMEM培养基85-95份、片状载体2-5份、微量元素10-20份、维生素0.5-2份、氨基酸1-3份，所述片状载体是以改性载体纤维经过压合、剪切制成，所述改性载体纤维为葛根纤维经过聚乙二醇改性而得。
2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，包括以下重量份原料：DMEM培养基90份、片状载体3份、微量元素12份、维生素1份、氨基酸2份。
3.根据权利要求2所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，所述微量元素包括：250-300mg/L氯化钾、1500-2000mg/L碳酸氢钠、0.03-0.2mg/L硫酸铜、50-60mg/L硫酸镁、1-1.5mg/L氯化铁。
4.根据权利要求3所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，所述维生素包括：2-4mg/L叶酸、6-10mg/L烟酰胺、10-15mg/L维生素C、50-65mg/L氯化胆碱。
5.根据权利要求4所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，所述氨基酸包括：200-220mg/L谷氨酸、300-350mg/L脯氨酸、160-180mg/L胱氨酸、300-320mg/L络氨酸、400-460mg/L丝氨酸、800-900mg/L天冬氨酸。
6.根据权利要求1-5所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，所述片状载体的制备方法为：取制备得到的改性载体纤维，加入乙醇溶液中，再加入硅烷偶联剂，搅拌混合均匀，加入十二烷基磺酸钠，持续搅拌，升温至70-80℃，保温反应10-12h，反应完成后，冷却至室温，压滤，得到滤饼于40-45℃温度下烘干，剪切、破碎得到片状载体。
7.根据权利要求6所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基，其特征在于，所述改性载体纤维的制备方法包括以下步骤：
S1：取葛渣，清洗去除杂质后加入复合酶，于50-60℃温度下进行酶解处理1-1.5h，反应完成后过滤，滤饼抖散、烘干得到葛根粗纤维；
S2：将制备得到的葛根粗纤维搅拌分散于硝酸钙溶液中，，得到混悬液，将混悬液于70-75MPa压力下进行高压匀质3次，旋转蒸干得到反应产物置于管式炉中，在氮气气氛下，升温至600-650℃温度下煅1-2h，煅烧完成后随炉冷却，取出喷洒加入去离子水，静置20min，浸泡于去离子水中，超声振荡洗涤，过滤、烘干得到葛根纤维；
S3：分别称取巯基乙酸和聚乙二醇加入甲苯中，搅拌混匀后加入对甲苯磺酸，然后在氮气气氛下搅拌升温至100-120℃，保温反应12-14h，得到反应产物用乙醚沉淀，过滤，滤饼烘干后加入N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解后，加入2,4-二异氰酸酯，然后加入葛根纤维，在氮气气氛下，升温至70-80℃，保温反应150-180min，反应完成后趁热过滤，滤饼用无水乙醇浸泡洗涤，再用去离子水透析3d，干燥得到改性载体纤维。
8.根据权利要求7所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基的制备方法，其特征在于，所述S1步骤的复合酶为α-淀粉酶和纤维素酶的复合物，所述α-淀粉酶和纤维素酶的质量比为1:(2-5)。
9.根据权利要求7-8任一权利要求所述的一种猪圆环病毒2型悬浮培养用培养基的应用，其特征在于，将培养基应用于猪圆环病毒2型的培养中。
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