CN108060173B - 羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体公开了羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用。本发明通过将可引起卵菌对羧酸酰胺类杀菌剂产生100倍以上抗性的突变蛋白的编码基因作为筛选标记，用于卵菌转化时转化子的筛选，该筛选标记的开发能够在一定程度上解决辣椒疫霉遗传转化时筛选标记单一等问题，有助于辣椒疫霉基因功能的研究。

Description

羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种新型的卵菌转化筛选标记。

背景技术

辣椒疫霉属于藻界(Kingdom Chromista)、卵菌门(Phylum Oomycota)、卵菌纲(Class Oomycetes)、霜霉目(Order Peronosporales)、霜霉科(FamilyPeronosporaceae)、疫霉属(Genus Phytophthora)(Lamour et al.,2012)，该病原引起的辣椒疫病潜育期短、发展迅速，是辣椒生产上的毁灭性病害之一。1918年，辣椒疫病的爆发给智利的辣椒生产造成了严重的经济损失，随后，1922年该病首次在新墨西哥报道(Leonian,1922)，目前该病害在世界各地广泛发生。辣椒疫病的发病症状与辣椒品种、侵染部位及环境条件息息相关，通常该病害在高温高湿条件下发生较为严重。辣椒疫霉侵染辣椒后主要症状表现为根茎部变褐、腐烂或缢缩，叶部出现暗绿色水渍状病斑，植株萎蔫，湿度较大时在发病果实表面形成白色霉层(Hausbeck et al.,2004)。辣椒疫病一般发病率在5％-65％，发病严重时可使辣椒减产80％，甚至绝收(张振兵等,2006)。辣椒在全生育期的不同部位包括茎、叶和果实均可受到辣椒疫霉的侵染(刘志恒，2003)。另外，辣椒疫霉寄主广泛，至少可侵染包括茄科、葫芦科等在内的26科的植物(Kamoun et al.,2015；Granke etal.,2012)。

目前辣椒疫病的防治仍以化学防治为主，羧酸酰胺类(CAA类)杀菌剂是防治该病害的一类重要杀菌剂，其代表药剂包括氟吗啉、烯酰吗啉、异丙菌胺和双炔酰菌胺等。该类杀菌剂的作用机理是抑制卵菌的细胞壁合成，其在卵菌体内的作用靶标是纤维素合酶3(CesA3)。辣椒疫霉纤维素合酶3的突变可引起该菌对CAA类杀菌剂产生抗药性，其中该靶标蛋白第1105位(甘氨酸1105丙氨酸)和1109位(缬氨酸1109亮氨酸)同时突变可造成辣椒疫霉对上述4种CAA类杀菌剂均产生高倍抗药性，其抗性倍数在100倍以上(陈磊,2013)。

卵菌CRISPR/Cas9基因敲除体系首先成功在大豆疫霉中建立(Fang and Tyler,2016)，该体系亦可用于辣椒疫霉的基因功能研究。但是目前辣椒疫霉遗传转化时可利用的筛选标记仅限于具有遗传霉素(G418)抗性的NPTⅡ基因，这严重制约了辣椒疫霉基因回补及多敲除等工作的开展。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种新型的卵菌转化筛选标记——羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因RCesA3，以及其作为卵菌转化筛选标记，在进行卵菌转化时的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用。

其中，所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因编码辣椒疫霉中靶标蛋白RCesA3，使其相对于野生型蛋白CesA3，在第1105位发生氨基酸的突变，由甘氨酸突变为丙氨酸，同时，在第1109位发生氨基酸的突变，由缬氨酸突变成亮氨酸。

本发明将该抗性基因(也可称为抗性标记基因)作为新型的卵菌转化筛选标记RCesA3。

所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列重组且编码与羧酸酰胺类杀菌剂抗性相关蛋白，并可引起卵菌对羧酸酰胺类杀菌剂产生100倍以上抗性的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与羧酸酰胺类杀菌剂抗性相关蛋白，并可引起卵菌对羧酸酰胺类杀菌剂产生100倍以上抗性的DNA分子。

可选的，所述筛选标记RCesA3通过PCR扩增的方法获得，向CesA3基因CDS序列中引入2个核苷酸的突变，即将敏感型基因CDS序列的第3314位的G突变为C，对应的，该基因所编码的蛋白由自N端第1105位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸；第3325位的G突变为T，对应的，该基因所编码的蛋白由自N端第1109位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸。

在本发明的具体实施方式中，通过设计引物，以辣椒疫霉野生型菌株cDNA为模板，利用高保真酶FastPfu Mix分前后两个部分扩增辣椒疫霉CesA3CDS区域，通过In-Fusion连接的方法获得CAA类杀菌剂抗性基因RCesA3，同时将其连入pBluescript II KS+载体(可购自Stratagene公司)以大量克隆该抗性基因，具体技术方案如下：

(1)利用限制性内切酶EcoR V酶切pBluescript II KS+载体，利用商业化的胶回收试剂盒回收线性化载体片段；

(2)以辣椒疫霉野生型菌株cDNA为模板，设计引物分段扩增CesA3CDS区域，在引物中引入突变位点，前部片段扩增引物为MuC3-1F(序列：ATCGATAAGCTTGATATGGGGCTCACCGGCGCG)和MuC3-1R(序列：CAACAGAAGCGAAGCGAACACGTTGGCCGTGAA)，后部片段扩增引物为MuC3-2F(序列：GCTTCGCTTCTGTTGGTGTACATCGTGGTGTTC)和MuC3-2R(序列：CTGCAGGAATTCGATCTAAGACGAAGTAGAACCC)，利用商业化的胶回收试剂盒回收扩增产物片段；

(3)利用Takara商业化In-Fusion HD重组酶将步骤(1)和步骤(2)得到的片段连接，实现抗性基因RCesA3的插入，获得带有该抗性标记的载体(pB-RCesA3)；

(4)将连接产物转入大肠杆菌感受态Trans1-T1，涂于含氨苄青霉素的LB平板，挑取单菌落后利用通用引物M13F和M13R进行扩增，阳性菌落经测序验证后，于LB液体培养基摇培并小量提取质粒。

在上述构建方法中，步骤(1)载体可选择其他载体(例如全式金公司的pEASY-T1载体等)，线性化载体所使用的限制性内切酶也可以是载体上的其他内切酶。

在上述构建方法中，步骤(2)所用的引物MuC3-1F和MuC3-2R与线性化载体两端的微同源序列需要根据步骤(1)载体或内切酶的变化而改变。前部片段代表突变位点之前的片段，后部片段代表突变位点之后的片段。

在上述构建方法中，步骤(3)也可以选择其他公司具有相同功能的重组酶。

在上述构建方法中，步骤(4)LB平板抗生素的选择需要根据载体上的抗生素抗性基因(如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等)而确定。

进一步地，本发明所述的应用具体为：将所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因连入含有卵菌通用启动子的转化载体，用于卵菌遗传转化的筛选。

其中，所述卵菌通用启动子可为来自莴苣霜霉(Bremia lactucae)的ham34或hsp70。

更为具体地，所述应用为：将所述筛选标记连入卵菌CRISPR/Cas9体系的sgRNA表达载体，或是卵菌转化时所用的其他相关载体(如卵菌基因沉默、过表达常用的pTOR载体，亚细胞定位所用的pGFPN载体，亦或是根据特殊目的自行构建的用于卵菌转化的其他载体)，以该标记进行卵菌遗传转化时转化子的筛选，或以该标记进行卵菌其他抗性标记筛选获得的基因敲除转化子的基因回补实验中的筛选，或以该标记进行卵菌其他抗性标记筛选获得的基因敲除转化子的其他靶标基因的再敲除的转化筛选。

其中，所述其他筛选标记基因可为现有技术中常用的NPTⅡ基因，但并不排除随着研究发展而开发的其他筛选标记基因。本发明所提供的新的筛选标记弥补了现有技术中筛选标记基因单一的不足。但无论是其单独作为筛选标记，还是与其他筛选标记组合使用，以进行更为复杂的基因工程实验(多步敲除或回补实验等)，均属于本发明的保护范围。

进一步地，本发明以辣椒疫霉PcDHCR7基因的回补实验为例，说明所述筛选标记(RCesA3)的具体应用如下：

S1、采用已报道的方法将辣椒疫霉BYA5菌株的PcDHCR7基因替换为传统的筛选标记基因NPTⅡ，获得辣椒疫霉PcDHCR7基因敲除转化子KD1-1。

S2、以NPTⅡ为靶基因，http://grna.ctegd.uga.edu/在线设计sgRNA(sgRNA序列：CCATCATGGCTGATGCAATG)，将sgRNA连入sgRNA表达载体pYF2.3G-ribo-sgRNA(已发表载体，Fang and Tyler,2016,Efficient disruption and replacement of an effector genein the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9)，得到靶向NPTⅡ基因的sgRNA表达载体(pYF2.3G-N)。

S3、将所述筛选标记RCesA3连入上述sgRNA表达载体，实现筛选标记RCesA3替换原sgRNA表达载体中的GFP基因，使筛选标记RCesA3被强启动子ham34启动，获得带有筛选标记RCesA3的sgRNA表达载体。具体步骤如下：

(1)利用限制性内切酶ClaⅠ和ApaⅠ酶切靶向NPTⅡ的sgRNA表达载体(pYF2.3G-N)，将GFP基因切除，利用商业化的胶回收试剂盒回收线性化载体片段；

(2)以含有辣椒疫霉CAA类杀菌剂抗性基因RCesA3的载体质粒(pB-RCesA3)为模板，设计引物MuC F(序列：ATATCAAGCTTATCGATATGGGGCTCACCGGCGCG)和MuC R(序列：TAGGCTCCGGAACCGGGCCCCTAAGACGAAGTAGAACCC)，利用全式金高保真酶FastPfu Mix扩增抗性基因RCesA3，同时在抗性基因两侧引入步骤(1)线性化载体的微同源序列，利用商业化的胶回收试剂盒回收PCR产物；

(3)利用Takara商业化In-Fusion HD重组酶将步骤(1)和步骤(2)获得的胶回收产物连接，实现抗性标记RCesA3替换原来sgRNA表达载体中的GFP基因，获得带有RCesA3的sgRNA表达载体(pYF2.3G-CesA3-N)；

(4)将连接产物转入大肠杆菌感受态Trans1-T1，涂于含氨苄青霉素的LB平板，挑取单菌落,设计引物Resg F(序列：ACTCGCCCACGATCGGAAGG)和Resg R(序列：CACAAAATCTGCAACTTCGC)进行扩增，阳性菌落经测序验证后，于LB液体培养基摇培并大量提取质粒。

在上述构建方法中，酶切载体还可以是靶向其他基因的sgRNA表达载体或sgRNA表达载体衍生物。

在上述构建方法中，步骤(2)还可以利用其他带有同样羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因RCesA3的载体质粒或cDNA为模板。

在上述构建方法中，步骤(3)也可以选择其他公司具有相同功能的重组酶。

在上述构建方法中，步骤(4)质粒的提取步骤依据质粒提取试剂盒所提供的方法。

S4、以S1所述的辣椒疫霉PcDHCR7基因敲除转化子KD1-1为实验材料，获得原生质体，通过PEG-CaCl₂介导的方法向原生质体中同时转入带有羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因的载体(pYF2.3G-RCesA3-N)、Cas9蛋白表达载体和同源臂载体；经筛选获得阳性转化子。

所述筛选方法具体为：

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，利用羧酸酰胺类杀菌剂进行转化子的第一次筛选，25℃黑暗条件下培养3天，利用羧酸酰胺类杀菌剂进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养2-3天，待菌落长出后将菌落转接至含有羧酸酰胺类杀菌剂的带药V8平板，进行第三次筛选。

为保证转化子筛选效率及转化子的阳性率，第一次、第二次和第三次筛选转化子时羧酸酰胺类杀菌剂在培养基中的浓度最好介于6-12μg/mL之间。

通过上述筛选，成功获得了辣椒疫霉PcDHCD7基因回补转化子，且在筛选得到的疑似回补转化子中，大多转化子携带有抗性标记RCesA3基因，筛选阳性率较高。

本发明所提供的筛选标记RCesA3抗药性基因来源于辣椒疫霉敏感菌株CesA3基因CDS序列，不包含任何内含子，该基因包括3423个核苷酸，可编码1140个氨基酸。通过PCR扩增的方法向CesA3基因CDS序列中引入核苷酸的突变，即将敏感型基因CDS序列的第3314位的G突变为C，对应的，该基因所编码的蛋白由自N端第1105位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸；第3325位的G突变为T，对应的，该基因所编码的蛋白由自N端第1109位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸。

辣椒疫霉CesA3蛋白其他位点的突变也可能引起辣椒疫霉对CAA类杀菌剂产生抗药性，上述位点的突变仅是引起辣椒疫霉对该类杀菌剂产生抗药性的一种情况，筛选标记若为能引起该类杀菌剂抗药性的带有其他突变位点的或其他卵菌的CesA3基因，同样属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果在于：

本发明获得的改造载体因携带有CAA类杀菌剂抗性基因RCesA3，从而可以用于辣椒疫霉遗传转化时转化子的筛选。将该筛选标记用于辣椒疫霉基因敲除转化子的回补实验，筛选获得了基因回补成功的转化子(图1)。通过第二次筛选长出的菌落有近50％不能在含有氟吗啉的V8培养基上生长(图2)，第三次筛选可提高阳性率。扩增利用该标记筛选获得的转化子体内抗性基因，以验证筛选阳性率。转化子经过三次氟吗啉的筛选，阳性率可达95.45％(图3)。该筛选标记的开发能够在一定程度上解决辣椒疫霉遗传转化时筛选标记单一等问题，有助于辣椒疫霉基因功能的研究。

附图说明

图1为辣椒疫霉PcDHCR7基因回补情况PCR验证。泳道1-19为以氟吗啉为筛选药剂获得的转化子；泳道20为PcDHCR7基因敲除转化子KD1-1；泳道21为野生型菌株BYA5；泳道22为空白对照CK。其中，泳道1、4和16是PcDHCR7基因回补成功的转化子。

图2为以RCesA3为筛选标记利用氟吗啉筛选转化子时菌落生长情况。A：以含有12μg/mL氟吗啉的V8培养基进行第二次筛选3d后菌落生长情况；B：将经过第二次筛选长出的菌落转接至含有8μg/mL氟吗啉的V8培养基2d后菌落生长情况。

图3为以RCesA3为筛选标记获得的辣椒疫霉疑似回补转化子抗性基因验证结果。泳道1-22为以RCesA3为筛选标记获得的转化子；泳道23为PcDHCR7基因敲除转化子KD1-1；泳道24为空白对照CK。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中使用的菌株信息：辣椒疫霉野生型菌株BYA5，采自中国甘肃地区；辣椒疫霉基因敲除转化子KD1-1，以野生型菌株BYA5为亲本获得的PcDHCR7基因敲除的转化子，其PcDHCR7基因被外源基因NPTⅡ所取代。

上述辣椒疫霉菌株已经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定。

下述实施例中所使用的筛选药剂：92.5％氟吗啉原药，由沈阳化工研究院提供。药剂以二甲基亚砜配成相应浓度的母液，以千倍稀释的方法加入培养基中。

实施例1、筛选标记RCesA3在辣椒疫霉基因回补中的应用

由于上述质粒改造时所用的sgRNA表达载体(pYF2.3G-N)表达的sgRNA可靶向NPTⅡ基因，故该载体可用于上述辣椒疫霉PcDHCR7基因敲除转化子的回补。

构建PcDHCR7基因回补所需的同源臂载体；同时改造Cas9蛋白表达载体：利用限制性内切酶EcoR I酶切Cas9蛋白表达载体pYF2-PsNLS-hSpCas9(已发表载体，Fang andTyler,2016,Efficient disruption and replacement of an effector gene in theoomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9)，去除NPTⅡ基因及其启动子和终止子，之后经T4连接酶连接，获不含NPTⅡ基因的Cas9蛋白表达载体，命名为pYF2-Cas9EI。利用商业化的试剂盒大量提取回补同源臂载体和pYF2-Cas9EI载体。

以上述辣椒疫霉PcDHCR7基因敲除转化子KD1-1为实验材料，参考Fang等方法获得原生质体，通过PEG-CaCl₂介导的方法向原生质体中同时转入带有CAA类杀菌剂抗性基因的sgRNA表达载体(pYF2.3G-RCesA3-N)、Cas9蛋白表达载体(pYF2-Cas9EI)和同源臂载体。

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，以含有杀菌剂氟吗啉的PM固体培养基筛选转化子，25℃黑暗条件下培养3天，在有菌丝长出的PM固体培养基上覆一层含有氟吗啉的V8固体培养基，进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟吗啉的V8平板，进行第三次筛选。

上述实验过程优选的参数如下：

为保证转化子筛选效率及转化子的阳性率，第一次、第二次和第三次筛选转化子时氟吗啉在培养基中的浓度最好介于6-12μg/mL之间。

经过三次筛选获得的转化子转接至铺有玻璃纸的V8平板，菌落长出后收集菌丝，提取DNA，设计引物ReD F(序列：AGCGATCCAGACCGAGCGATTTCAC)和ReD R(序列：TTACAGGATCTTTGGCAGGATG)对筛选获得的转化子进行PCR扩增，以验证基因回补情况，并以敲除转化子KD1-1作为阴性对照，以野生型菌株BYA5作为阳性对照。

设计引物ResgC F(序列：ACTCGCCCACGATCGGAAGG)和ResgC R(序列：CTAAGACGAAGTAGAACCCG)对22株氟吗啉筛选获得的疑似回补转化子进行抗性标记的扩增，并以敲除转化子KD1-1作为阴性对照。22株转化子中，有21株转化子扩增到筛选标记RCesA3，说明经三次氟吗啉筛选获得的转化子阳性率95.45％(图3)。

实施例2、辣椒疫霉DNA的提取及基因回补验证

(1)辣椒疫霉DNA提取

刮取辣椒疫霉菌丝适量，置于2mL离心管中，并加入1粒钢珠；

加入150μL抽提缓冲液(0.35M山梨醇，0.1M Tris，0.005M EDTA[pH 7.5]，0.02M亚硫酸氢钠)，在振荡器上振荡30s；

加入150μL核裂解缓冲液(0.2M Tris，0.05M EDTA[pH 7.5]，2.0M NaCl和2％CTAB[pH 7.5])和60μL 20％SDS，在振荡器上充分振荡(1min)后于65℃水浴30min；

加入等体积(360μL)的氯仿:异戊醇(v/v，24:1)上下颠倒6-8次混匀，12000rpm离心10-20min；

取上清液于新的1.5mL尖头离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(v/v，24:1)进行再次抽提；

离心后取上清液于新的1.5mL尖头离心管中，加入等体积的4℃异丙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(pH 8.0)，混匀后于4℃静置1h；

12000rpm离心10min，沉淀用600μL 75％预冷乙醇洗涤两遍；

开盖于40℃条件下干燥10-20min，待乙醇挥发干净后，加入30-50μL的无菌Milli-Q H₂O，DNA溶解后保存于于-20℃备用。

(2)PCR扩增

50μL的PCR体系：

PCR反应条件如下：

94℃，4min；

94℃，30s；58℃，30s；72℃，3min；共34个循环；

72℃，10min；

4℃保存。

(3)测序及比对

PCR扩增19株氟吗啉筛选获得的转化子，有3株转化子扩增出目标条带(图1)。将阳性PCR产物送擎科生物技术有限公司测序，发现3株阳性回补转化子目标片段序列与野生型菌株一致，说明3株阳性转化子均为基因回补成功的转化子。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用

<130> KHP171116897.1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3423

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggctca ccggcgcggg catcatcgcc tccgtcgtgg gcatcctcgg cggcatttcc 60

ttgtcgtgcg gtggctggtc gtcgctgtcc ctcggcgccc ggtcactttt cgtcaccacg 120

cagttcctct cggccttcgc catgggattt gtggtagcat tcacagcgat cgtttcgctc 180

tcggacacta atgaatgggt cgctgttgcc gctggaggcg gcgcaggctt tgtgattgcc 240

ctgattgtgg gcttcatgac gttcttcgga ccgtacatct tgatcctagt gactggcggt 300

attatctcct gctacttgtt gctcatcgat gcgtacgatg gagtcaacct gttcccggcc 360

gacaaccagt tggctcgcca ggagttcgtg atcgctttca tgatcatttt cgagctcgtg 420

tgctgctcct cctccaagac ctcggagctg gagaaccacc gtttcaagta catcatcttt 480

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gccgtgctgt ccaatgtggc cttcacgtct ttgcaggacg gtggcaaggc tgctctaaag 600

ggcatggatt caggctctca aacgctcatg ttcgtgatct ggggcgctgt ctttgtggtt 660

ggcggactca accagctctc gatgcgctgg ggactcatgt gctacaaccg cgtgggtgcc 720

cacgctcagc tcggccccgt tgaagagcag atgccggagc ttcctactgg tgctaccctg 780

ccagctcagg ctatgaccga acgcgttcgc cttgtgtgcg agaactgttt cgctacggtt 840

ccctctggta ccgccttctg taccgagtgt ggcgaggcca tgccgtcgga cgatgctaac 900

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gttcccgacc gttggcagca ggtgccacac cgaacattcc tcagcacgac gtcgtttgtt 1020

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ttcatggact ctggtgtaca gggacctgac ggcaagatga gccagtataa cgactccatt 1140

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ccatgcagtg aactgcctac cagtgaaact accggatgct acagttcgac cgtgaacttc 1440

gacgctagct cgggtgacgg ttactgcatt aaggacgtgc cgttcatgtc gtggctcatg 1500

tacgcaatga tggtcttcag tgagttcctc aactacttcc tgggtctact tttcaacttc 1560

tctatgtggc gcccaatccg tcgtggtgct cgttacatga acgacttcaa gccgcctatc 1620

ccgaaggagc agtggccgag tgtcgacatc ttcttgtgtc actacatgga acctgtgacg 1680

gattcgatgc agacgttgaa gaactgtctt gccatgcagt accctccgga gcttctgcac 1740

atcttcattc tggacgatgg ttacaccaag tctgtttggg acgccaacaa ccatttcaag 1800

gtctcagtga acacgaaggt tattgaaatt tgtggtgacc tgcgtggcga ccttgctcgc 1860

ctcatgcacg agcgcgtggt tggccctgtc caagacgacc agagcttgaa gacctggcgt 1920

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gattgtgccg ttggttcgct gtctgacgac tatgactacc gtgaccgtgg tattccgcgc 2040

gtgaccttca ttggtcgtat gaaacccgaa acgcaccact cgaaggctgg taacattaac 2100

aacgccttgt ttaacgaagg tgccgacggc aagtacctgc tgattttgga taacgatatg 2160

aagccgcacc cgaagttcct gcttgccgtg ctgccgttct tcttctcaga gggcgaggct 2220

gttgacggcg gaggccgcca gtacagcgat gacatttcct ggaaccaggt gtcatacgta 2280

cagactcctc agtacttcga ggacacgccg caactgacga tcatgggcga cccgtgtgga 2340

cacaagaaca ccattttctt cgacgccgtg cagtgtggtc gtgatggttt cgactcggca 2400

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gaaggtgccg ttcccgaaac ggttgctgct gccatgggtc agaagaagcg ttgggccaag 2640

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ccgcgtgtgc ctgccccgga cccgaagccg tctctcgcct tcccgcgtaa gatgttcttc 2760

tacgattcgg tgctgtaccc gttcggttca attcccgccc tgtgttacgt ggctatcgct 2820

gtttactact tgtgcacggg tgacgctcct atctacgctc gcggtaccaa gttcctgtac 2880

tctttcttgc ccgtgacgtt ctgccgttgg gtgctgaacc tgctggccaa ccgtgccgtc 2940

gacaacaacg atgtgtggcg tgcccagcag acttggttct cgttctcatt catcacgatg 3000

atggccattg tggaggctat tcaggcgcgt atgacgggca aggacaagtc gtgggctaac 3060

actggtgccg gtcagaagac gtcgtggacg gaaattccga acgtactgtt cttcttcacg 3120

ctactgttca gtcagttggt ggcgttgatc cgattcttcg agtacgagaa cgccacgaac 3180

ccgtggaact acgtgtctgc catgttcttc gggtttttcg tgatgagcca gttctacccc 3240

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tag 3423

Claims (3)

1.羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为辣椒疫霉转化筛选标记的应用，其特征在于，所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因具体为如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

所述应用具体为：将所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因连入含有来自莴苣霜霉的启动子Ham34的转化载体，用于辣椒疫霉遗传转化时转化子的筛选；

所述筛选为以其他筛选标记基因获得的敲除转化子的基因回补实验中的筛选，或用于辣椒疫霉以其他筛选标记基因获得的敲除转化子的其他基因的再敲除的转化筛选；

其中，筛选阳性转化子的方法具体为：

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，以含有杀菌剂氟吗啉的PM固体培养基筛选转化子，25℃黑暗条件下培养3天，在有菌丝长出的PM固体培养基上覆一层含有氟吗啉的V8固体培养基，进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟吗啉的V8平板，进行第三次筛选；

筛选转化子时氟吗啉在培养基中的浓度介于6-12μg/mL之间。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、以传统的筛选标记NPTⅡ基因为筛选标记，以遗传霉素G418进行转化子的筛选，将辣椒疫霉的靶标基因替换为外源基因NPTⅡ，获得靶标基因被敲除的转化子；

S2、根据NPTⅡ基因，设计靶向NPTⅡ基因的sgRNA表达载体；

S3、将所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因连入上述sgRNA表达载体，得到带有羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因的sgRNA表达载体；

S4、以S1所述的靶标基因被敲除的转化子为实验材料，获得原生质体，通过PEG-CaCl₂介导的方法向原生质体中同时转入带有羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因的sgRNA表达载体、Cas9蛋白表达载体和同源臂载体；经筛选获得阳性转化子。

3.一种辣椒疫霉转化的筛选方法，其特征在于，以羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为筛选标记连入含有来自莴苣霜霉的启动子Ham34的转化载体，进行辣椒疫霉转化时转化子的筛选；

所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因具体为如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

所述筛选为以其他筛选标记基因获得的敲除转化子的基因回补实验中的筛选，或用于辣椒疫霉以其他筛选标记基因获得的敲除转化子的其他基因的再敲除的转化筛选；

其中，筛选阳性转化子的方法具体为：

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，以含有杀菌剂氟吗啉的PM固体培养基筛选转化子，25℃黑暗条件下培养3天，在有菌丝长出的PM固体培养基上覆一层含有氟吗啉的V8固体培养基，进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟吗啉的V8平板，进行第三次筛选；

筛选转化子时氟吗啉在培养基中的浓度介于6-12μg/mL之间。

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