CN107964530B - 浮萍原生质体制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种浮萍原生质体制备方法，按照下述步骤进行：调整Datko培养基的PH至5～6，进行高压灭菌；采集浮萍，将浮萍培养于步骤1所述的Datko培养基上，每周继代1～2次，得到浮萍植株；夹取步骤2中所述浮萍植株，用A液清洗后，将所述浮萍植株放入离心管中，加入组织固定液固定所述浮萍植株至少15min；在酶解温度为23～27℃的条件下，用组织酶解液在黑暗条件下酶解步骤3所得的浮萍植株25～30min，每间隔10～15min吹打混匀一次，得到悬浮的浮萍原生质体，本发明的浮萍原生质体制备方法取材少，耗时短，操作简单方便，获得的浮萍原生质体浓度高，数据分析具有代表性。

Description

浮萍原生质体制备方法
技术领域
本发明属于浮萍原生质体制备领域，具体来说涉及一种浮萍原生质体制备方法。
背景技术
浮萍是单子叶水面漂浮植物，隶属于浮萍科浮萍属，广布于世界各地，其个体小，扩繁快，对环境的适应能力强，对盐碱水环境有一定的抗性，在生物能源开发利用方面也具有一定的优势，是一种具有环境优势的水生植物。近年来，浮萍在水体净化上的应用得到越来越广泛的关注，但其净化水体的生理生化机制尚未阐明。原生质体的制备是浮萍细胞生物学分析不可或缺的关键操作。植物原生质体的制备方法大多集中于陆生植物，而浮萍是水面漂浮植物，细胞壁强韧度、细胞渗透压等与陆生植物有较大差别。用现有技术进行实验，不能得到浮萍原生质体，而是浮萍细胞的碎片。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种浮萍原生质体制备方法。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。
一种浮萍原生质体制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1，调整Datko培养基的PH至5～6，于95～105kPa、120～125℃下进行高压灭菌；所述Datko培养基由水和下述浓度的化合物组成：
在所述步骤1中，高压灭菌至少20分钟。
步骤2，采集浮萍，将浮萍培养于步骤1所述的Datko培养基上，每周继代1～2次，得到浮萍植株；其中，培养条件为：温度18～25℃，光周期16～18小时/天，光强95～97μmol m- 2s-1；
步骤3，夹取步骤2中所述浮萍植株，用A液清洗后，将所述浮萍植株放入离心管中，加入组织固定液固定所述浮萍植株至少15min；其中，所述组织固定液由去离子水和下述浓度的乙醇水溶液和冰醋酸组成：
乙醇水溶液 85～95g/l
冰醋酸 95～100g/l，
其中，在所述乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为80～90％；
所述A液由去离子水和下述浓度的化合物组成：
Nacl 8～9g/l
K2HPO4·3H2O 11～12g/l
KH2PO4 6～7g/l
在所述步骤3中，所述A液的PH为7～8。
步骤4，在酶解温度为23～27℃的条件下，用组织酶解液在黑暗条件下酶解步骤3所得的浮萍植株25～30min，每间隔10～15min吹打混匀一次，得到悬浮的浮萍原生质体；其中，所述组织酶解液由去离子水和下述浓度的物质组成：
在上述技术方案中，在所述步骤1之前，制备Datko培养基母液，通过对所述Datko培养基母液进行稀释得到所述Datko培养基。
在上述技术方案中，将所述Datko培养基母液与水按照体积比为(2～3)：1000的比例进行混合，得到所述Datko培养基。
在上述技术方案中，在所述步骤4之后，对所述浮萍原生质体清洗2～3次。
在上述技术方案中，通过离心对所述浮萍原生质体进行清洗：用20～25℃的B液垂直打入浮萍原生质体所在离心管，以使所述浮萍原生质体悬浮，进行离心，离心后移除上层清液；所述B液由去离子水和下述浓度的化合物组成：
在上述技术方案中，所述B液的PH为7～8。
在上述技术方案中，相对离心力为2000～2500×g。
在上述技术方案中，每次清洗3～4min。
相比于现有技术，本发明的浮萍原生质体制备方法取材少，耗时短，操作简单方便，获得的浮萍原生质体浓度高，数据分析具有代表性，可在短时间(例如两小时内)获得大量浮萍原生质体，填补了浮萍原生质体制备方法的空白。
附图说明
图1为用本发明的浮萍原生质体制备方法获得的浮萍原生质体(标尺＝50μm)；
图2用本发明的浮萍原生质体制备方法获得的浮萍原生质体经DAPI染色后的显微图片(标尺＝20μm)；
图3用本发明的浮萍原生质体制备方法获得的浮萍原生质体的数量统计。
具体实施方式
在本发明的具体实施方式中，浮萍(浮萍科浮萍属L.minor NK 1)采集自天津市西青区湖水。本发明的实施例中所使用的化合物药品均购买自天津市西青区塔科拉实验用品经营部，纯度均为99.5％；本发明的实施例中所使用的酶均购买自天津为科生物技术有限公司。
制备扩繁浮萍完整植株所需的Datko培养基母液，将Datko培养基母液与水按照体积比为3：1000的比例进行混合，得到Datko培养基，备用(保存于4℃)。
Datko培养基母液由水和下述浓度的化合物组成：
Datko培养基由水和下述浓度的化合物组成：
下面结合附图和实施例对本发明的浮萍原生质体制备方法进行详细说明。
一种浮萍原生质体制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1，将40ml Datko培养基分装入50ml锥形瓶内(超净台内操作)，调整Datko培养基的PH至5.6～5.8，于102.9kPa、121℃下高压灭菌20分钟；
步骤2，采集浮萍，将浮萍培养于步骤1中的Datko培养基上，每周继代1次，得到浮萍植株；其中，培养条件为：温度23℃，光周期16小时/天，光强95μmol m-2s-1；
步骤3，夹取6片步骤2中浮萍植株，用A液清洗后(用剪刀将浮萍植株的叶片和假根部位分开处理)，将浮萍植株放入1.5毫升离心管中，加入300μl组织固定液固定浮萍植株15min；组织固定液由去离子水和下述浓度的乙醇水溶液和冰醋酸组成：
乙醇水溶液 90g/l
冰醋酸 98g/l，
其中，在乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为90％；使用时，乙醇水溶液与冰醋酸按照质量份比3：2均匀混合，混合后制备成上述浓度的组织固定液。
所述A液(PH为7.4)由去离子水和下述浓度的化合物组成：
Nacl 8.5g/l 5ml
K2HPO4·3H2O 11.411g/l 80.2ml
KH2PO4 6.804g/l 19.8ml
步骤4，在酶解温度为25.6℃的条件下，用30μL组织酶解液在黑暗条件下酶解步骤3所得的浮萍植株30min，在酶解过程中，每间隔10min吹打混匀一次，得到悬浮的浮萍原生质体；组织酶解液由去离子水和下述浓度的物质组成：
在步骤4之后，通过离心对浮萍原生质体清洗3次(每次清洗3min，相对离心加速度或相对离心力为2500×g)。每次清洗的过程为：用600μL 20℃的B液体垂直打入浮萍原生质体所在离心管，以使浮萍原生质体悬浮，悬浮后进行离心，离心后移除上层清液。
B液(PH＝7.4)由去离子水和下述浓度的化合物组成：
浮萍原生质体的观察：在最后一次对浮萍原生质体进行清洗后，用60μL B液重悬浮萍原生质体，并用移液枪吹打均匀。
向含有浮萍原生质体的B液中滴一滴4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI染液)，在温度37℃且黑暗的条件下，对原生质体染色15min。染色后，通过离心将原生质体清洗2～3次(每次清洗3min)，相对离心力为2000×g。每次清洗的过程为：用600μL 20℃的B液体垂直打入浮萍原生质体所在离心管，以使染色后的浮萍原生质体悬浮，悬浮后进行离心，离心后移除上层清液。最后一次清洗后，用60μL B液重悬原生质体，并用移液枪吹打均匀，用滴管取一滴含有染色的浮萍活体原生质体的B液于载玻片上，盖好盖玻片，于正置荧光显微镜下20倍观察，荧光显微镜型号为Leica(莱卡)DM5000，观察的显微图片如图1所示。剩余的含有浮萍原生质体的B液用400目细胞筛网过滤，将滤液放入1.5ml离心管，在全景细胞多维系统(Merck Millipore公司，FlowSight多维全景流式细胞仪)下观察浮萍原生质体形态，通道1(Ch01)为明场下观察结果，通道7(Ch07)为激发波长488nm激发时观测到的经4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI染液)染色的细胞核，如图2所示。用此方法制备的浮萍原生质体含量为23692822.6个/mL，如图3所示。
利用上述方法制备的浮萍原生质体可应用在浮萍分子生物学互作、单细胞凝胶电泳分析和荧光标记中，是浮萍细胞生物学分析不可或缺的关键操作。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种浮萍原生质体制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤1，调整Datko培养基的PH至5～6，于95～105kPa、120～125℃下进行高压灭菌；所述Datko培养基由水和下述浓度的化合物组成：
步骤2，采集浮萍，将浮萍培养于步骤1所述的Datko培养基上，每周继代1～2次，得到浮萍植株；其中，培养条件为：温度18～25℃，光周期16～18小时/天，光强95～97μmol m-2s-1；
步骤3，夹取步骤2中所述浮萍植株，用A液清洗后，将所述浮萍植株放入离心管中，加入组织固定液固定所述浮萍植株至少15min；其中，所述组织固定液由去离子水和下述浓度的乙醇水溶液和冰醋酸组成：
乙醇水溶液 85～95g/l
冰醋酸 95～100g/l，
其中，在所述乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为80～90％；
所述A液由去离子水和下述浓度的化合物组成：
Nacl 8～9g/l
K2HPO4·3H2O 11～12g/l
KH2PO4 6～7g/l
步骤4，在酶解温度为23～27℃的条件下，用组织酶解液在黑暗条件下酶解步骤3所得的浮萍植株25～30min，每间隔10～15min吹打混匀一次，得到悬浮的浮萍原生质体；其中，所述组织酶解液由去离子水和下述浓度的物质组成：
2.根据权利要求1所述的浮萍原生质体制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，高压灭菌至少20分钟。
3.根据权利要求1所述的浮萍原生质体制备方法，其特征在于，在所述步骤1之前，制备Datko培养基母液，通过对所述Datko培养基母液进行稀释得到所述Datko培养基。
4.根据权利要求3所述的浮萍原生质体制备方法，其特征在于，将所述Datko培养基母液与水按照体积比为(2～3)：1000的比例进行混合，得到所述Datko培养基。
5.根据权利要求1所述的浮萍原生质体制备方法，其特征在于，在所述步骤3中，所述A液的PH为7～8。
6.根据权利要求1所述的浮萍原生质体制备方法，其特征在于，在所述步骤4之后，对所述浮萍原生质体清洗2～3次。
7.根据权利要求6所述的浮萍原生质体制备方法，其特征在于，通过离心对所述浮萍原生质体进行清洗：用20～25℃的B液垂直打入浮萍原生质体所在离心管，以使所述浮萍原生质体悬浮，进行离心，离心后移除上层清液；所述B液由去离子水和下述浓度的化合物组成：
8.根据权利要求7所述的浮萍原生质体制备方法，其特征在于，所述B液的PH为7～8。
9.根据权利要求7所述的浮萍原生质体制备方法，其特征在于，相对离心力为2000～2500×g；每次清洗3～4min。
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