CN107868797A

CN107868797A - 一种捕光色素蛋白基因Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用

Info

Publication number: CN107868797A
Application number: CN201711161036.8A
Authority: CN
Inventors: 董宏坡; 郝庭彬
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2018-04-03

Abstract

本发明公开了一种捕光色素蛋白基因Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用，所述捕光色素蛋白基因Lhcx3的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据本发明可以利用转基因技术将响应高光抑制的基因转到三角褐指藻中高表达，构建新型转基因藻株，该藻株能够在高光强下健康生长，而且表现出很高的生物量，具有很高的应用前景和应用价值。

Description

一种捕光色素蛋白基因Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用

技术领域

本发明涉及藻类培育技术领域，更具体地，涉及一种捕光色素蛋白基因Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用。

背景技术

三角褐指藻是重要的饵料藻和能源微藻，具有很高的经济利用价值。然而，目前在利用光反应器工厂化养殖过程中，产量还远达不到生产需要；而如果提高光强，则又抑制了它们的生长。

转基因技术已经在植物育种中发挥着巨大作用，转基因抗虫棉的大规模产业化大大促进了我国棉纺工业的快速发展。抗逆和抗病的转基因大豆和玉米也在一些发达国家进行种植。截止到2015年，全球转基因作物已经涉及200多个种，种植转基因的国家已经增加到29个，年种植面积超过27亿亩。

因此，利用转基因技术改造三角褐指藻是一个重要的研究方向。但是，由于缺乏合适的关键基因，目前尚没有关于转基因技术提高三角褐指藻抵御对于高光强的技术报道。

发明内容

本发明的第一个目的是为了克服现有技术的不足，提供捕光色素蛋白基因Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用。

本发明的第二个目的是为了克服现有技术的不足，提供一种含所述的捕光色素蛋白基因Lhcx3的重组载体在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用。

本发明的第三个目的是为了克服现有技术的不足，提供一种含所述的重组载体的宿主细胞在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用。

本发明的第四个目的是为了克服现有技术的不足，提供捕光色素蛋白Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用或在制备可提高三角褐指藻抵御高光强能力的制剂方面的应用。

本发明的第五个目的是为了克服现有技术的不足，提供一种可提高三角褐指藻抵御高光强能力的制剂。

本发明的第六个目的是为了克服现有技术的不足，提供一种构建耐高光强转基因三角褐指藻的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

捕光色素蛋白基因Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用，其特征在于，所述捕光色素蛋白基因Lhcx3的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种含权利要求1所述的捕光色素蛋白基因Lhcx3的重组载体在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用。

一种含权利要求2所述的重组载体的宿主细胞在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用。

优选地，所述应用是指在构建耐高光强的转基因三角褐指藻方面的应用。

捕光色素蛋白Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用或在制备可提高三角褐指藻抵御高光强能力的制剂方面的应用。

一种可提高三角褐指藻抵御高光强能力的制剂，含有捕光色素蛋白Lhcx3。

一种构建耐高光强转基因三角褐指藻的方法，将捕光色素蛋白基因Lhcx3转化到三角褐指藻中。

优选地，将权利要求1所述的捕光色素蛋白基因Lhcx3连接到表达载体中，得到阳性重组表达载体，线性化阳性重组表达载体，将线性化的阳性重组表达载体转化三角褐指藻细胞中，筛选出阳性转化子。

优选地，阳性重组表达载体转化三角褐指藻细胞采用电击法进行转化，电击法的参数设置为电压500 V，电容25 Μf，电阻400 Ω，间距2 mm。

优选地，电击法进行转化的体系为：30 μmol/m²/s光强下培养至1.0×10⁷～1.0×10⁸指数期的三角褐指藻50 ml藻液，经4 ℃下4400 rpm离心5 min收集菌体；加入900 ml山梨醇，4400 rpm室温离心3 min，洗涤三次，收集藻体；加入200 μl山梨醇，3μg线性化阳性重组表达载体，4 μl经过100 ℃加热1 min的鲑精DNA；混匀，冰浴30 min。

优选地，表达载体为PHY-21。

优选地，用85 mg/L的博莱霉素筛选出阳性转化子。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次提供了捕光色素蛋白基因Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用，利用转基因技术将高光抑制基因转到三角褐指藻中高表达，构建新型转基因藻株，该藻株能够在高光下健康生长，而且表现出很高的生物量，具有很高的应用前景和应用价值。

附图说明

图1为野生型和过表达株Lhcx3，LhcR6 和LhcR8在1h或者2h高光（800 μmol m⁻² s⁻¹）照射下的相对表达情况。

图2为标签蛋白flag在不同藻株中的表达情况。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 捕光色素蛋白基因Lhcx3的获得

1、抗高光胁迫的基因的筛选

对三角褐指藻进行高光胁迫，之后按照标准程序，用trizol方法提取三角褐指藻样品总RNA，用NanoDrop 分光光度计进行测量RNA的浓度，进而构建测序文库，在Illumina 的Hiseq 2500高通量测序平台上进行测序。测序的reads进行去除低质量的reads和接头序列，获得干净的高质量reads。使用Trinity软件进行reads的拼接，将拼接获得的Unigene与COG, Nr，Pfam，Uniport等数据库进行blastx比对，得到基因的功能注释。基因表达的差异使用FPKM方法在DEGseq软件中进行表达差异分析。通过分析，发现捕光色素蛋白LhcR6，LhcR8和Lhcx3在1 h的高光下上调了13～36倍。LhcR6，LhcR8和Lhcx3 在NCBI的Gene bank中的ID号分别为7202932，7196903，7199712。

2、Lhcx3，LhcR6，LhcR8的克隆

根据NCBI的Gene bank中记载的LhcR6，LhcR8和Lhcx3的序列，按照标准程序设计引物，从三角褐指藻中克隆出LhcR6，LhcR8和Lhcx3基因，其中PCR扩增引物分别为：

Lhcx3-F：ATGAAGTGCATCGCCGCTAT；

Lhcx3-R：AGGAGGTGTTCCAAGATTCCCT；

LhcR6-F：ATGAAGCTCTCTATTGCCCTT；

LhcR6-R：GGCATGTAGTATCCCGAGTT；

LhcR8-F：ATGAAATTTTGCCTTGCT；

LhcR8-R：GCCAAACCAAGATAGCTGTG。

经过测序，其序列与NCBI的Gene bank中记载的的序列相似性达到100%。

实施例2 构建耐高光强三角褐指藻的方法

1、构建表达载体

将实施例1中得到的LhcR6，LhcR8和Lhcx3，连结到表达载体PHY-21上，这个表达载体包括一个来自三角褐指藻fcpC 启动子和终止子，目的基因就连接在启动子和终止子之间。载体上还有一个用于筛选转化子的博莱霉素抗性基因，经过筛选获得阳性重组载体。

2、阳性重组表达载体转化三角褐指藻细胞

将上述阳性重组载体通过电击的方法转化到三角褐指藻细胞中，然后将电击后的藻细胞倒入培养基中进行复苏，涂布到含有博莱霉素的固体培养基上，放入光照培养箱进行培养。具体步骤如下：

（1）将30 μmol/m²/s光强下培养至1.0×10⁷~1.0×10⁸指数期的三角褐指藻50 ml藻液4℃下4400 rpm离心5 min收集，加入900 ml山梨醇，用移液枪轻轻吹打至混匀，4400 rpm室温离心3 min，洗涤三次。

（2）加入200 μl山梨醇，随后加入3 μg线性化质粒与4 μl经过100 ℃加热1 min的鲑精DNA，用移液枪轻轻吹打至混匀，冰浴30 min。

（3）将上述混合液加入事先-20 ℃预冷处理的电击杯中，轻轻吹打，放入电击穿孔仪中，参数设置为电压500 V，电容25 Μf，电阻400 Ω，间距2 mm，电击完毕后将电击杯中藻液倒入10 ml的f/2培养基中，放入人工气候培养箱，黑暗培养48 h。

（4）将上述藻液4400 rpm离心5 min，弃掉上清液，将剩余藻液用已灭菌的涂布棒均匀平涂在博莱霉素浓度为85 mg/L的固体琼脂糖f/2培养平板上，倒扣平板，放入人工气候培养箱培养。

3、转化子的筛选

等到培养箱中平板上长出单藻落之后，挑取单藻落，放入f/2液体培养基里复苏，之后再接种到含有博莱霉素的f/2液体培养基中继续培养，用野生性三角褐指藻细胞作为对照，上述过程筛选三次。等到阳性转化子能够在含有抗生素的培养基稳定生长的时候，再转到正常的不含抗生素的f/2培养基上进行后继验证实验。具体步骤如下：

（1）待人工气候培养箱中的平板中长出单藻落后，挑取至24孔板中复苏培养，每孔加入2 ml的f/2培养基。

（2）培养4~5天，待单藻落扩大生长后，吸取1 ml藻液加入10 ml新鲜的的f/2培养基中，选取野生型藻株作为对照，博来霉素浓度为30 mg/L，继续培养4~5天，待藻液生长扩大后反复筛选三次。

（3）待三角褐指藻阳性克隆在抗性中可以稳定表达，取1 ml加入200 ml新鲜f/2培养基中扩大培养，用于后续验证实验。

（4）取50 ml指数期藻液，提取基因组DNA，使用博莱霉素基因特异性引物进行PCR，1%琼脂糖凝胶电泳验证。

实施例3 转化子的验证

1、荧光定量PCR检测目的基因的表达

将获得的LhcR6，LhcR8和Lhcx3阳性转化子分别按照标准步骤提取总RNA,进行逆转录，进行荧光定量PCR检测，其引物见上面所述。

结果显示（图1）：高光照射下，三个基因在过表达株系中的表达都显著高于在野生型中的表达，表明目的基因已经在转化株中成功表达。同时，Lhcx3在过表达株系中相对表达最高。

2、Western-blotting 检测目的蛋白表达情况

将获得的LhcR6，LhcR8和Lhcx3阳性转化子使用Western-blotting 检测试剂盒检测标签蛋白flag的表达量。标签蛋白为8个氨基酸的亲水小肽DYKDDDDK，介于启动子和终止子之间，表达的时候目的基因和标签蛋白一起形成一个融合蛋白，以此来表征目的基因的表达情况，使用的抗体为市售的相应的抗体。

结果显示（图2），标签蛋白和目的基因置于同一个启动子下，表达出来的蛋白为融合蛋白，如果表达蛋白能够用抗体检测到，表明目的基因成功表达。三个转化株目的基因都已经成功表达，而在野生株中没有检测到标签蛋白的表达。

实施例4 抵御高光的能力的检测

1、在400 μmol m⁻² s⁻¹光照下检测了藻株的5天的比生长速率和干重，在800 μmol m⁻²s⁻¹光照下检测了非光化学淬灭（NPQ）

2、结果显示：使用比正常光高一倍的光强（400 μmol m⁻² s⁻¹）培养5天之后，Lhcx3过表达株系的比生长速率和干重显著高于野生型、LhcR6和LhcR8，说明Lhcx3-OE株系能够适应较高光强的照射，在相同培养条件下，能够获得更高的生物量。同时其反映抵抗光保护能力的NPQ在Lhcx3过表达株中也显著高于其它株系。

注解：表中数值为4个平行样的平均值±SD，**表示p<0.01，*表示p<0.05，表示Lhcx3-OE与野生型、LhcR6-OE和LhcR8-OE比较有极显著差异。

序列表

<110> 广东海洋大学

<120> 一种捕光色素蛋白基因Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213> 三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)

<400> 1

atgaagtgca tcgccgctat cgctcttctc gccactacgg cgtccgcctt taacgcattc 60

ggtgccgcca agaaggctgc gcccaaaaag ccggtattct cgatcgaaac gatccccggt 120

gcgctcgctc ccgttggtat ctttgatccc ctcggtttcg ccgccaaggc cgacgagtcc 180

accctgaagc gataccgcga agccgagctc acccacggac gggtggccat gctcgctacc 240

gttggcttct tggtcggtga agccgtggaa ggatcttcct tcctctttga tgcttctatc 300

aaaggacctg ctatttctca tctcgcccaa gtgccgactc cgttctgggt tctcttgacc 360

attttcatcg gggccgcgga acagacccgt gccgtcatcg gctggcggga tccttccgac 420

gtacccttcg acaagcccgg tctcttgaac gaggactaca ccccgggtga cattggcttt 480

gatcctctcg gactcaagcc aacggatgcg gaagaactca gggttctaca gaccaaggaa 540

ctccagaacg gacgcttggc catgcttgct gccgctggat tcatggcgca ggaactcgtg 600

gacggcaagg gaatcttgga acacctcctc taa 633

<210> 2

<211> 210

<212> PRT

<213> 三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)

<400> 2

Met Lys Cys Ile Ala Ala Ile Ala Leu Leu Ala Thr Thr Ala Ser Ala

1 5 10 15

Phe Asn Ala Phe Gly Ala Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Pro Val

20 25 30

Phe Ser Ile Glu Thr Ile Pro Gly Ala Leu Ala Pro Val Gly Ile Phe

35 40 45

Asp Pro Leu Gly Phe Ala Ala Lys Ala Asp Glu Ser Thr Leu Lys Arg

50 55 60

Tyr Arg Glu Ala Glu Leu Thr His Gly Arg Val Ala Met Leu Ala Thr

65 70 75 80

Val Gly Phe Leu Val Gly Glu Ala Val Glu Gly Ser Ser Phe Leu Phe

85 90 95

Asp Ala Ser Ile Lys Gly Pro Ala Ile Ser His Leu Ala Gln Val Pro

100 105 110

Thr Pro Phe Trp Val Leu Leu Thr Ile Phe Ile Gly Ala Ala Glu Gln

115 120 125

Thr Arg Ala Val Ile Gly Trp Arg Asp Pro Ser Asp Val Pro Phe Asp

130 135 140

Lys Pro Gly Leu Leu Asn Glu Asp Tyr Thr Pro Gly Asp Ile Gly Phe

145 150 155 160

Asp Pro Leu Gly Leu Lys Pro Thr Asp Ala Glu Glu Leu Arg Val Leu

165 170 175

Gln Thr Lys Glu Leu Gln Asn Gly Arg Leu Ala Met Leu Ala Ala Ala

180 185 190

Gly Phe Met Ala Gln Glu Leu Val Asp Gly Lys Gly Ile Leu Glu His

195 200 205

Leu Leu

210

Claims

1.捕光色素蛋白基因Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用，其特征在于，所述捕光色素蛋白基因Lhcx3的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.一种含权利要求1所述的捕光色素蛋白基因Lhcx3的重组载体在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用。

3.一种含权利要求2所述的重组载体的宿主细胞在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用。

4.根据权利要求1～3任一所述应用，其特征在于，是指在构建耐高光强的转基因三角褐指藻方面的应用。

5.捕光色素蛋白Lhcx3在提高三角褐指藻抵御高光强中的应用或在制备可提高三角褐指藻抵御高光强能力的制剂方面的应用。

6.一种可提高三角褐指藻抵御高光强能力的制剂，其特征在于，含有高表达的捕光色素蛋白Lhcx3。

7.一种构建耐高光强转基因三角褐指藻的方法，其特征在于，将捕光色素蛋白基因Lhcx3转化到三角褐指藻中。

8.权利要求7所述的方法，其特征在于，转化步骤为：将权利要求1所述的捕光色素蛋白基因Lhcx3连接到表达载体中，得到阳性重组表达载体，线性化阳性重组表达载体，将线性化的阳性重组表达载体转化三角褐指藻细胞中，筛选出阳性转化子。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于，阳性重组表达载体转化三角褐指藻细胞采用电击法进行转化，电击法的参数设置为电压500 V，电容25 Μf，电阻400 Ω，间距2 mm。

10.权利要求9所述的方法，其特征在于，电击法进行转化的体系为：30 μmol/m²/s光强下培养至1.0×10⁷～1.0×10⁸指数期的三角褐指藻50 ml藻液，经4 ℃下4400 rpm离心5min收集藻体；加入900 ml山梨醇，4400 rpm室温离心3 min，洗涤三次，收集藻体；加入200μl山梨醇，3 μg线性化阳性重组表达载体，4 μl经过100 ℃加热1 min的鲑精DNA；混匀，冰浴30 min。