CN112391333B

CN112391333B - 一种牡蒿叶肉原生质体的分离和转化方法

Info

Publication number: CN112391333B
Application number: CN202011334948.2A
Authority: CN
Inventors: 潘琪芳; 邓伯富; 彭柏文; 唐克轩
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2040-11-25
Also published as: CN112391333A

Abstract

本发明公开了一种牡蒿叶肉原生质体分离及瞬时转化的方法，包括以下步骤：1)选取幼嫩牡蒿叶片去除下表皮，将除去下表皮的叶片置于甘露醇溶液中浸泡；2)将于甘露醇溶液浸泡后的叶片放入牡蒿酶解液，在黑暗中抽真空，避光酶解，得到含叶肉原生质体的酶解混合液；3)洗涤酶解混合液、过滤离心得到原生质体沉淀，重悬后获得原生质体悬浮液；4)利用瞬时转化方法将携带绿色荧光蛋白GFP标签的质粒转入上述原生质体中，经过培养，使其在牡蒿原生质体中表达。本发明得到的原生质体产量为1.93×10⁶个/g FW，活力为87.5％，获得的原生质体产量高，状态良好。该技术为开展蛋白间相互作用、亚细胞定位等研究奠定实验基础。

Description

一种牡蒿叶肉原生质体的分离和转化方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及到一种牡蒿叶肉原生质体的分离及瞬时转化方法。

背景技术

牡蒿(Artemisia japonica Tumb.),又名齐头蒿、为菊科蒿属多年生草本植物。植株含挥发油，主要成分有胡椒蔫、毕澄茄烯、α-侧柏酮、1,8一按叶油素、青蒿酮等。牡蒿全草入药，有清热、解毒、消暑、去湿、止血、消炎、散瘀之效；又代“青蒿”用。近年来的研究报道表明，牡蒿植株本身不产生青蒿素，但可通过遗传转化实验可促进牡蒿体内合成青蒿酸、二氢青蒿酸和青蒿素。青蒿素是一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是世界卫生组织推荐的抗疟疾药物联合治疗的主要有效成分。青蒿原生质体的分离和瞬时转化的体系已经有研究人员建立，但是对于牡蒿原生质体的分离和瞬时转化的研究尚属空白。

原生质体是指除去了细胞壁的被细胞膜包围的“裸露细胞”。原生质体具有细胞全能性，在特定条件下可再生完整植株。原生质体可以摄入外源基因、质粒等物质，是植物遗传转化的理想材料。

瞬时转化在分子生物学领域被广泛应用，包括外源基因表达、蛋白质间互作、蛋白的亚细胞定位等等，受体细胞的选择成为了外源基因表达产物正确折叠、修饰并精确定位在相应亚细胞结构上的关键。目前拟南芥、烟草、水稻、和小麦中原生质体的分离和转化体系已经广泛应用于目标基因表达分析。但在本发明申请之前，尚无利用牡蒿原生质体瞬时转化开展目的基因功能验证的报道，利用牡蒿原生质体验证目的基因的功能，有利于快速鉴定蒿属等菊科药用植物中活性成分(如青蒿素等)的生物合成关键酶基因，所以建立适用于牡蒿的原生质体分离及转化体系十分重要，可以加快天然活性成分的生物合成研究与开发进程。为此，我们致力于探索并建立牡蒿原生质体分离及瞬时转化的体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为如何高效制备得到适用于瞬时转化的牡蒿原生质体。

为解决上述问题，本发明提供了一种制备牡蒿叶肉原生质体的方法。其包括如下步骤：

1)选取幼嫩扦插牡蒿苗叶片去除下表皮，得到除去下表皮的牡蒿叶片；

2)预质壁分离：将除去下表皮的叶片置于0.4mol/L甘露醇溶液中浸泡1h；

3)将于甘露醇溶液浸泡后的叶片置于牡蒿酶解液中，在黑暗中抽真空，避光酶解，得到含叶肉原生质体的酶解混合液；

4)在酶解混合液加入M-W5溶液，过滤、低速离心得到原生质体沉淀，重悬后得到原生质体。

5)利用PEG介导法将携带绿色荧光蛋白GFP标签的质粒转入步骤4)获得的原生质体中，在WI溶液培养16h后，使其在牡蒿原生质体中表达。

优选的，幼嫩扦插牡蒿苗叶片为长出8-10片健壮的牡蒿叶片，采用透明胶带粘贴撕去下表皮，并使用剪刀剪成3等份，得到除下表皮的牡蒿叶片。

优选的，酶解溶液配方为：1.5～2％纤维素酶R10，0.5～1％离析酶R10，0.3～0.5mol/L甘露醇，0.02mol/L氯化钾，0.02mol/L MES(用KOH调节至pH＝5.7)，0.01mol/L氯化钙，0.1％BSA，3.5mmol/Lβ-巯基乙醇。其中更优选的，1.75％纤维素酶R10、0.5％离析酶R10、0.4mol/L甘露醇所得原生质体产量和活力最高。

优选的，酶解条件为：黑暗条件下抽真空30min后，室温下水平摇床40-60rpm黑暗酶解4～6h。

优选的，M-W5溶液的配方为：2.2mmol/L MES(pH＝5.7)、154mmol/L氯化钠、125mmol/L氯化钙、5mmol/L氯化钾；MMG溶液的配方为：4mmol/L MES(pH＝5.7)、0.4mol/L甘露醇、15mmol/L氯化镁。

优选的，酶解终止方法为：酶解混合液中加入等体积的M-W5溶液，用70μm尼龙膜过滤后离心，再用M-W5溶液重悬原生质体沉淀。随后离心去除M-W5溶液，用MMG溶液重悬原生质体，使得原生质体溶液的细胞浓度稀释成105-106个/mL。

优选的，WI溶液的配方为：4mmol/L MES(pH＝5.7)、0.5mol/L甘露醇、20mmol/L氯化钾。

优选的，步骤(5)中瞬时转化方法为：在200μL原生质体-MMG混悬液中加入10μg质粒和220μL 40％PEG4000黑暗孵化20分钟，使用M-W5终止反应，离心弃去上清液得到沉淀，沉淀中加入1mL WI溶液室温培养16h。

优选的，质粒提取用天根无内毒素质粒大提试剂盒，将提取的质粒浓度调整为1μg/μL备用。

优选的，用荧光显微镜观察GFP标签的表达。

有益效果：

1、本发明实现了牡蒿原生质体瞬时转化开展目的基因功能验证。

2、获得的原生质体产量高，状态良好。

3、加快牡蒿叶中天然活性成分的生物合成研究与开发进程。

附图说明

图1是对牡蒿幼嫩叶片下表皮的分离过程示意图。

图2(A)图显示用剪刀将牡蒿叶片剪成细条放入酶解液的示意图；图2(B)图显示用胶带撕去叶片下表皮、并将叶片剪成3等份后放入酶解液的示意图；

图3是牡蒿幼嫩叶片经酶解和纯化后得到的原生质体图；

图4(A)图显示100μm标尺下明场通道下原生质体活力检测示意图；图4(B)图显示荧光通道下原生质体活力检测示意图；

图5是本发明的一个较佳实施例中牡蒿原生质体转化结果图。

具体实施方式

以下结合附图介绍本发明的优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

以下实施例1中，所使用的主要试剂配方如下：

M-W5溶液的配方为：2.2mmol/L MES(pH＝5.7)、154mmol/L氯化钠、125mmol/L氯化钙、5mmol/L氯化钾，溶剂为水，0.22μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。

MMG溶液配方为：4mmol/L MES(pH＝5.7)、0.4mol/L甘露醇、15mmol/L氯化镁，溶剂为水，0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。

40％PEG4000溶液：40％PEG4000，0.8mol/L甘露醇，1mol/L氯化钙，现配现用，在转化实验开始前1h配好，使其充分溶解，0.2μm滤膜过滤灭菌，常温保存。

WI溶液配方为：4mmol/L MES(pH＝5.7)、0.5mol/L甘露醇、20mmol/L氯化钾，溶剂为水，0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。

实施例1

本实施例涉及一种牡蒿原生质体的分离方法，包括以下步骤：

牡蒿叶片原生质体的制备；

(1)选取3-4周生长健壮的牡蒿扦插苗，此时每株小苗有8-10片幼嫩叶片，用胶带撕去叶片下表皮，如图1所示；

(2)预质壁分离：将除去下表皮的叶片置于0.4mol/L甘露醇溶液中浸泡1h；

(3)酶解：将于甘露醇溶液浸泡后的叶片置于酶解溶液中放入酶解液中，大约5-10片叶子。黑暗下抽真空30min，放入水平摇床黑暗酶解4h。酶解液为1.75％纤维素酶R10，0.5％离析酶R10，0.4mol/L甘露醇，0.02mol/L氯化钾，0.02mol/L MES(pH＝5.7)混合后置于55℃水浴锅中10min；冷却至室温后分别加入0.01mol/L氯化钙，0.1％BSA，3.5mmol/Lβ-巯基乙醇，定容至10ml，搅拌均匀，用0.22μm的过滤器过滤除菌。

(4)向酶解液中加入10mL的M-W5溶液终止酶解，然后将上述液体经70μm的尼龙膜过滤至50mL离心管中，1000rpm离心3min，弃上清；

(5)向步骤(4)中的沉淀加入5mL的M-W5清洗原生质体，1000rpm离3min，弃上清，再用5mL的M-W5重复清洗一次，得到牡蒿的原生质体，冰浴30min，备用；

(6)1000rpm离心3min，弃上清，收集的沉淀用MMG重悬。

原生质体的产量：

将步骤(6)中冰浴的原生质体轻轻摇匀，用移液枪吸取40μL滴于血球计数板上，待原生质体充满记数室，在显微镜下观察并计数，重复计数三次，计算每克牡蒿叶片原生质体产量(个/g FW)，计算方法为：原生质体个数(个/ml)/材料质量(g)×稀释倍数。显微镜观察下，200μm标尺下原生质体示意图如图3所示。

原生质体活力检测：

取步骤(6)中原生质体稀释5倍，加入5mg/mL FDA溶液，使其终浓度为100μg/mL，室温黑暗处放置5min，用移液枪吸取40μL滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察原生质体，亮绿色的为有活性的细胞。其计算方法为：原生质体活力＝(荧光通道下原生质体个数/明场通道下原生质体个数)×100％。

明场通道100μm标尺下的原生质体活力检测示意图如图4的(A)图所示，荧光通道100μm标尺下的原生质体活力检测示意图如图4的(B)图所示。

实施例2

针对实施例1方法中对牡蒿幼嫩叶片的处理，本发明设置了2个处理方法：将牡蒿叶片剪成细条放入酶解液、用胶带撕去叶片下表皮放入酶解液，将经过处理后的幼嫩叶片按照实施例1的方法进行酶解和纯化。结果表明，幼嫩叶片宜用胶带撕去叶片下表皮(表1).

表1切成5mm细条以及用胶带撕去叶片下表皮后原生质体产量与活力

如图2，将幼嫩叶片分别剪成5mm细条以及用胶带撕去叶片下表皮，并将叶片剪成三所得到的原生质体产量和活力如表1所示，用胶带撕去幼嫩叶片下表皮原生质体产量更高，所得的原生质体活力达到77.78％。

实施例3

针对实施例1方法中的预质壁分离，本发明在预质壁分离的过程中设置了不经预质壁分离的对照组，具体结果见表2。

表2预质壁分离对原生质体产量及活力的影响

如表2所示，将去下表皮的叶片进行0.4mol/L甘露醇预处理1h，原生质体产量显著提高，原生质体活力提高到80.0％。

实施例4

酶浓度配比、甘露醇浓度对牡蒿叶肉原生质体制备的影响

针对步骤(2)中纤维素酶和离析酶浓度配比和甘露醇浓度，本发明设置了9个不同酶浓度配比和甘露醇浓度组合(表3)。纤维素酶浓度水平为1.5％、1.75％、2％；离析酶浓度水平为0.5％、0.75％、1％；甘露醇浓度水平为0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L。根据各组试验条件分别进行酶解，并计数原生质体产量与活力。

表3牡蒿叶片原生质体产量和活力结果

结果如表3所示，组合4(1.75％纤维素酶R-10，0.5％离析酶R-10，0.4mol/L甘露醇)所得的原生质体产量为1.93×10⁶个/g FW，原生质体活力为87.50％，原生质体产量和活力在9个组合中均最高。

实施例5

本实施案例涉及一种以PEG介导的牡蒿原生质体瞬时转化的方法，包括以下步骤：

(1)用MMG溶液重悬原生质体，使得原生质体溶液的细胞浓度稀释成10⁵-10⁶个/mL。

(2)在2mL EP管中加入10μg质粒，200μL原生质体-MMG混合液，220μL 40％PEG4000溶液，轻柔混匀，室温黑暗下孵育20min。

加入880μL的M-W5溶液终止转化，轻弹管底混匀后700rpm离心3min，吸出上清；再用1mL M-W5溶液重悬，轻弹管底混匀后700rpm离心3min，吸出上清，加入1mLWI溶液重悬原生质体，并于室温暗培养16h。

荧光蛋白的检测，用激光共聚焦显微镜进行观察，2×35S启动子驱动GFP蛋白成功在牡蒿原生质体表达。

本实施例中GFP在牡蒿原生质体中的瞬时表达示意图如图5所示。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种牡蒿叶肉原生质体的分离和瞬时转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)预质壁分离：将除去下表皮的牡蒿叶片置于0.4mol/L甘露醇溶液中浸泡1h；

3)将于甘露醇溶液浸泡后的牡蒿叶片置于牡蒿酶解溶液中，在黑暗中抽真空，避光酶解，得到含叶肉原生质体的酶解混合液；所述酶解溶液配方为：1.75％纤维素酶R10，0.5％离析酶R10，0.4mol/L甘露醇，0.02mol/L氯化钾，0.02mol/L MES，0.01mol/L氯化钙，0.1％BSA，3.5mmol/Lβ-巯基乙醇；

4)在酶解混合液加入M-W5溶液，过滤、低速离心得到原生质体沉淀，重悬后得到原生质体，M-W5溶液的配方为：2.2mmol/L MES pH＝5.7、154mmol/L氯化钠、125mmol/L氯化钙、5mmol/L氯化钾；MMG溶液的配方为：4mmol/L MES、0.4mol/L甘露醇、15mmol/L氯化镁；

5)利用PEG介导法将携带绿色荧光蛋白GFP标签的质粒转入步骤4)中获得的原生质体中，在WI溶液培养16h后，使其在牡蒿原生质体中表达。

2.如权利要求1所述的一种牡蒿叶肉原生质体的分离和瞬时转化方法，其特征在于，步骤1)中所述幼嫩扦插牡蒿苗叶片为幼嫩扦插苗长出8-10片健壮的牡蒿叶片，采用透明胶带粘贴撕去下表皮，得到除去下表皮的牡蒿叶片。

3.如权利要求1所述的一种牡蒿叶肉原生质体的分离和瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤3)的酶解条件为：黑暗条件下抽真空30min后，室温下水平摇床40-60rpm避光酶解4h。

4.如权利要求1所述的一种牡蒿叶肉原生质体的分离和瞬时转化方法，其特征在于，MES溶液的pH＝5.7。

5.如权利要求1所述的一种牡蒿叶肉原生质体的分离和瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤4)酶解终止方法为：酶解混合液中加入等体积的M-W5溶液，用70μm尼龙膜过滤后离心，再用M-W5溶液重悬原生质体沉淀；随后离心去除M-W5溶液，用MMG溶液重悬原生质体，使得原生质体溶液的细胞浓度稀释成10⁵-10⁶个/mL。

6.如权利要求1所述的一种牡蒿叶肉原生质体的分离和瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤5)的WI溶液的配方为：4mmol/L MES pH＝5.7、0.5mol/L甘露醇、20mmol/L氯化钾。

7.如权利要求1所述的一种牡蒿叶肉原生质体的分离和瞬时转化方法，其特征在于，步骤5)中转化方法为：在200μL原生质体-MMG混悬液中加入10μg质粒和220μL 40％PEG4000黑暗孵化，使用M-W5终止反应，离心弃去上清液得到沉淀，沉淀中加入1mL WI溶液室温暗培养16h。

8.如权利要求7所述的一种牡蒿叶肉原生质体的分离和瞬时转化方法，其特征在于，步骤5)黑暗孵化的时间为20分钟。